Введение к работе
Актуальность проблемы. Дальнейший существенный прогресс в генетике к селекции домашних птиц возможен при использовании новейших достижений клеточной и генной инженерии. Особую роль в этой специальной области на современном этапе играют химерные организмы.
Известны две основные области применения химер в птицеводстве: для сохранения генофонда и создания трансгенной птицы. В связи с обеднением генофонда, даже исчезновением некоторых редких локальных пород и популяций, в мире, в том числе на Украине, созданы коллек-ционарии пород и низкотемпературные банки спермы. Однако создание генофондных коллекций птицы и криобанков с запасом спермы решают данную проблему лишь частично. Эффективная технология низкотемпературной консервации эмбрионов еще не разработана. Между тем известно, что суспензия клеток эмбрионов и взрослых организмов птиц на различных стадиях развития успешно замораживается с высокой эффективностью ( Springer S.T. et al., 1969, Stephens E.A. et al., 1931)." С другой стороны, многочисленными исследованиями установлено, что клетки эмбрионов птиц на ранних, стадиях развития хотя и проявляют тотипотентные свойства, не способны к формированию сложных органов в условиях культуры. Поэтому замораживание эмбриональных клеток может найти применение лишь в случае разработки надежных методов реализации заложенной в них генетическсй информации, чте зсзможно при использовании' метода получения инъекционных химер птиц.
При создании трансгеннсй птиш из существующих методов встраивания экзогенного генетического материала в геном наиболее приемлемым в отношении птицы является использование РНК-вирусов в качестве векторов для введения новых генов. Используя этот метод чужеродная ДНК уже введена в клетки зародышевой линии Солтером v. др.( Solter D.W. et а]., 1986) и Босселменом и др.( Boselman R.A. et al., 19Є9). Преимущество же метода получения химер для создания трансгенной птицы заключается в потенциальной возможности направления экзогенной ДНК в специфический локус генома, характеристики его локализации и уровня встраивания гена в геном хозяина in vitro еще
- 4 -до получения трансгенных цыплят.
Первое сообщение об удачном получении химерных цыплят появилось недавно, в 1990 году. Выводимость оперированных яиц и процент химеризма в этих экспериментах были крайне ниэкими, на уровне 8-10Z ( Petitte J.N. et al., 1990). Причина этого заключается в специфике развития эмбрионов птиц на начальных этапах эмбриогенеза. В целом же, инъекционные химеры птиц получают на более поздних стадиях развития, чем у млекопитающих, что предполагает специфичность химериз-ма тканей и органов. Учитывая это, необходимо было провести исследования по разработке метода реабилитации оперированных яиц, совершенствованию техники получения химер птиц и изучению характера химеризма тканей на клеточном уровне.
Цель и задачу исследований. Целью настоящей работы явилось совершенствование метода получения и изучение инъекционных химер птиц. Для достижения данной цели на разрешение были поставлены следующие задачи:
1. Разработать метод реабилитации оперированных куриных яиц.
2.Усовершенствовать технику получения химер.
3. Изучить харатаер химеризма ткачей на клеточном уровне.
Научная новизна. Впервые изучены особенности химеризма тканей птиц на клеточном уровне, исследована зависимость химерообразувдеи способности клеток эмбрионов птиц от возраста донора, получены межвидовые (курица- перепел) химеры птиц.
Разработана оригинальная конструкция инъекционной микропипетки; определены объем суспензии и количество .клеток, обеспечивающие высокий результат, установлена возможность использования как эмбрионов-доноров, -так и реципиентов на Я1-ХШ стадиях развития по Зйал Жилади и Кочав при получении химер птиц.
Установлены причины низкой выводимости оперированных яиц, разработан эффективный метод их реабилитации.
Основные положения, вшюснмые на загризу.
1.Метод реабилитации оперированных яиц кур, включающий вынужденное повреждение скорлупы к подскорлупных оболочек с последувдим восстановлением их целостности, обеспечивающий выводимость таких яиц на уровне 507..
2. Метод создания инъекционных химер птиц, включавший применение оригинальной техники, обеспечивающий получение химерных организмов на уровне 35Х.
Практическая значимость работ». Разработанный метод реабилитации оперированных яиц кур может быть применен не только для получения инъекционных химер, но и для повышения выводимости яиц при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии, токсикологии, криобиологии.
Экспериментально обоснованный метод получения инъекционных химер в целом или отдельные этапы технологии можно использовать как один из подходов к клонированию птиц и получению монозиготных близнецов.
В результате гистологического анализа углублены известные ранее представления о процессах, происходящих на ранних этапах эмбриогенеза и взаимодействии различных типов тканей и клеток, что может быть использовано в учебниках по гистологии и экспериментальной эмбриологии.
Реализация результатов исследований. Предлагаемые технические решения по получению инъекционных химер птиц используются в лаборатории клеточной инхенерки отдела генетики и селекции птиц Института птицеводстза Украинской академии аграрных наук при выполнении плановых исследований по разделу 02.02. "Разработать методы получения монсзиготкых близнецов и клонирования птиц" государственной ' программы "Фундаментальны* исследования" на 1991-1995г.г.
Апробация работ». Основные положения диссертации доложены ка следующих научных конференциях:
Ежегодное рабочее совещание "Консервация генетических ресурсов", Путино, 4-6 марта 1992 г.
Украінской конференції молодих учених, аспірантів з питань птахівництва, Бірки, Є*7 жовтня. 1992 р.
l2internatlonal congress on animal reproduction, 23-27aupist 1992, -Hague, Netherland :
Перша наукова конференція по птахівництву, Бірки, 6-8 жовтня 1993 р.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации
опубликовано 8 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена ка 143страница> машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 23 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы собственно исследований, включающей материал и методы исследовании, результаті исследований с их обсуждением, выводов и списка цитированной литературы.