Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1 Особенности культивирования и регенерации растений in vitro 11
1.1.1 Культура изолированной ткани картофеля 12
1.1.2 Культура изолированной ткани ячменя 14
1.2 Возможности генной инженерии для совершенствования культур картофеля и ячменя 23
1.2.1 Генная инженерия антиоксидантов 32
1.3 Методы генетической инженерии растений 35
1.3.1 Методы прямого переноса чужеродных генов в растительный геном 36
1.3.2 Agrobacterium-опосредованная трансформация 40
1.4 Подходы к повышению эффективности агробактериальной трансформации 43
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования 51
2.1 Объекты исследования 51
2.2 Условия культивирования растений in vitro 52
2.3 Индукция морфогенеза в каллусе ячменя 56
2.4 Гистологическая оценка состояния каллуса 57
2.5 Агробактериальная трансформация растений 58
2.6 Молекулярно-генетический анализ растений-трансформантов для подтверждения их трансгенной природы 63
2.7 Фенотипическая оценка трансгенных растений 65
2.8 Статистическая обработка данных 67
ГЛАВА III. Получение и анализ трансформантов картофеля с гетерологичным геном Fe-SOD1 69
3.1 Получение трансгенных линий картофеля Беллароза с геном Fe-SOD1 70
3.2 Влияние гетерологичного гена Fe-SOD1 на морфометрические и биохимические показатели трансформантов картофеля 72
3.3 Оценка растений-трансформантов в условиях стресса 76
ГЛАВА IV. Подбор методических приемов и способов для повышения регенерационного потенциала ячменя 79
4.1 Изучение особенностей каллусогенеза и морфогенеза (регенерации) у хозяйственно ценных генотипов ячменя 79
4.2 Разработка новых способов индукции морфогенеза в каллусной ткани ячменя 84
4.2.1 Изучение влияния перфторорганических соединений и метилотрофных бактерий на каллусную ткань ячменя 85
4.2.2 Подбор оптимальных условий культивирования каллуса ячменя на средах с добавлением перфтордекалина 97
ГЛАВА V. Агробактериальная трансформация ячменя геном FE-SOD1 103
5.1 Подбор оптимальных концентраций антибиотиков, используемых в протоколе агробактериальной трансформации ячменя 104
5.1.1 Подбор концентрации канамицина для отбора растений трансформантов 104
5.1.2 Подбор концентрации цефотаксима для элиминации агробактерии... 109
5.1.3 Подбор концентрации тиментина для элиминации агробактерии 115
5.2 Сравнительная характеристика эффективности агробактериальной трансформации ячменя в различных реципиентных системах 121
5.3 Изучение первичных трансформантов (Т0) ячменя с гетерологичным геном Fe-SOD1 и их потомства (Т1) 128
Заключение 133
Список сокращений и условных обозначений 139
Список литературы
- Культура изолированной ткани картофеля
- Гистологическая оценка состояния каллуса
- Влияние гетерологичного гена Fe-SOD1 на морфометрические и биохимические показатели трансформантов картофеля
- Изучение влияния перфторорганических соединений и метилотрофных бактерий на каллусную ткань ячменя
Введение к работе
Актуальность темы, степень ее разработанности. Длительная направленность селекционного процесса на высокую урожайность привела к тому, что многие культурные виды, в результате однонаправленного отбора, утратили устойчивость к стрессовым воздействиям, что существенным образом снижает их продуктивность. Сравнение потенциальных и фактических урожаев нескольких видов культурных растений показало, что их урожаи обычно составляют не более 30% от максимально возможного уровня (Brown, 2011). Последние достижения биотехнологии и генной инженерии позволили достичь крупных успехов в повышении устойчивости растений к гербицидам, насекомым-вредителям, фитопатогенам (Clive, 2014), в меньшей степени - к повреждающим абиотическим факторам. Это делает актуальным разработку методических основ создания стресс-толерантных сортов растений.
Важным условием формирования у растений адаптивных реакций является эффективное функционирование общих систем устойчивости, и, среди них – антиоксидантных систем, защищающих организм от окислительного стресса, который выдвинут сегодня на роль универсального звена в реакции растительного организма на действие самых разнообразных факторов (Шакирова, 2001; Тарчевский, 2002; Mittler, 2002).
К числу ключевых компонентов системы защиты клеток и тканей от
окислительной деструкции относится антиоксидантный фермент
супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) (Бараненко, 2006). СОД катализирует реакцию дисмутации супероксидных анион-радикалов до молекулярного кислорода и пероксида водорода. Супероксидные анион-радикалы могут вызывать прямые повреждающие эффекты, а также быть источником образования других, в том числе и более токсичных, форм кислорода. Поэтому клетка нуждается в строгом контроле над продукцией и своевременном удалении данных радикалов.
Антиокислительную активность внутри клетки можно значительно повысить, внедрив в геном реципиентного растения гены фермента СОД. Гетерологическая суперэкспрессия этих генов в растениях табака (Gupta et al., 1993; Badavi et al., 2004; Павлючкова, 2012; Широких и др., 2015), кукурузы (Breusegem et al., 1999), арабидопсиса (Gao et al., 2003), томата (Серенко и др., 2009; Баранова и др., 2015) и др. повышала их устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды, в сравнении с обычными растениями. В отношении повышения антиоксидантной защиты важнейших для Нечерноземья РФ культур - картофеля и ячменя – ранее подобных исследований не проводилось.
Эффективность генетической трансформации растений напрямую зависит
от возможности сохранения морфологических и физиологических
характеристик культуры и стабильной экспрессии гетерологичных генов. Сегодня существует ряд стратегий и технологий, применяемых для получения трансгенных растений с новыми физиолого-биохимическими признаками
(Колодяжная и др., 2009; Vinocur, Altman, 2005). Однако, несмотря на разнообразие подходов, универсального эффективного способа все еще не найдено. В связи с этим разработка эффективных способов и приемов трансформации и регенерации для получения трансгенных растений ячменя, как и получение трансформантов картофеля с искомым стабильным фенотипом, остаются важными задачами и будут содействовать разработке современных технологий повышения стресс-толерантности растений.
Наряду с прикладными аспектами применения нового
биотехнологического подхода в селекции, эти исследования могут иметь важное значение для развития фундаментальных вопросов физиологии растений и молекулярной биологии.
Цель работы – получение и анализ трансгенных растений картофеля и
ячменя с гетерологичным геном Fe-супероксидисмутазы (Fe-SOD1) для
повышения стресс-толерантности растений и изучения механизмов
антиоксидантной защиты.
Задачи работы
1. Получить трансгенные по гену Fe-SOD1 растения картофеля
(Solanum tuberosum L.) и ячменя (Hordeum vulgare L.) с использованием штамма
Agrobacterium tumefaciens AGL0 с бинарным вектором pBI-FeSOD.
2. Провести проверку встраивания, функциональной активности
гетерологичного гена Fe-SOD1 в геноме трансформантов и оценку влияния
встроенного гена на фенотип трансгенных растений (морфологические и
биохимические признаки, продуктивность).
-
Выявить оптимальные условия для проведения агробактериальной трансформации ячменя.
-
Подобрать методические приёмы и способы повышения регенерационной способности ячменя in vitro.
Научная новизна. Впервые на основе картофеля сорта Беллароза и ячменя
отечественных сортов Белгородский 100 и Купец получены трансгенные линии,
несущие ген Fe-SOD1 из Arabidopsis thaliana. Показано, что встраивание гена
Fe-SOD1 в геном картофеля повышает уровень общей активности
супероксиддисмутазы в листьях трансформантов по сравнению с исходными
(нетрансгенными) растениями, не вызывая нарушений роста и
клубнеобразования. Выявлены оптимальные условия для агробактериальной
трансформации исследованных сортов ячменя, в частности подобраны
реципиентные системы, концентрации антибиотиков для отбора
трансформантов и элиминации агробактерии, а также продолжительность инокуляции и сокультивирования (для каллусной ткани). Впервые установлено, что перфторорганические соединения (ПФОС) в чистом виде, а также в сочетании с бактеризацией каллуса M. extorquens, могут способствовать активизации процессов вторичной дифференцировки каллусной ткани ячменя, в том числе – при длительном культивировании.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные являются методологической основой к проведению
работ, связанных с трансформацией однодольных и двудольных
сельскохозяйственных культур для придания им хозяйственно-ценных
признаков. Результаты проведенных исследований могут быть использованы
для разработки новых способов создания стресс-толерантных сортов растений.
Полученные трансформанты по гену Fe-SOD1 могут служить
экспериментальной моделью для изучения перекисного гомеостаза растений в условиях стресса. Предлагаемые методики регенерации и трансформации представляют интерес для генетической и клеточной инженерии ячменя. Подана заявка на изобретение № 2015136821 от 28.08.2015 «Способ стимуляции морфогенеза в культуре ткани ячменя».
Методология и методы исследований. Методология работы
спланирована в соответствии с поставленной целью. Эксперименты проводились согласно стандартным и вновь разработанным методикам. В работе использовали изолированные культуры ткани картофеля и ячменя, а также микробиологические, биохимические и молекулярно-генетические методы. Генетическую модификацию картофеля и ячменя осуществляли методом агробактериальной трансформации.
Достоверность и обоснованность результатов и выводов работы подтверждается использованием статистических методов.
Связь работы с научно-исследовательскими программами и темами.
Исследования проведены в 2011–2016 гг. в лаборатории биотехнологии растений и микроорганизмов ФГБНУ «НИИСХ Северо-Востока», являясь частью плановых НИР Россельхозакадемии по научному обеспечению АПК Российской Федерации на 2011-2015 гг. по заданию 04.04.04. «Разработать биотехнологические методы создания и оценки исходных перспективных форм ячменя и овса с улучшенными хозяйственными характеристиками, в т.ч. с адаптациями к локальным климатическим изменениям» и Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2015-2017 гг. по заданию № 0767-2014-0021 «Разработка фундаментальных основ создания новых сортов и линий ячменя и овса с улучшенными хозяйственно-ценными признаками, в т.ч. с использованием постгеномных биотехнологий».
Положения, выносимые на защиту
-
Встраивание в геном картофеля Беллароза гетерологичного гена Fe-SOD1 из Arabidopsis thaliana сопровождалось увеличением общей активности супероксиддисмутазы в листьях трансформантов, по сравнению с интактными растениями, и не оказало негативного влияния на фенотип растений.
-
Использование перфторорганических соединений с газотранспортной функцией (ПФД, 5об.%) в чистом виде и в сочетании с инокуляцией каллуса Methylobacterium extorquens АМ1 ВКM В-2064 (1108 кл/мл) позволяет активизировать процессы вторичной дифференцировки и регенерации в каллусной культуре ячменя.
-
Осуществлению агробактериальной трансформации отечественных сортов ячменя способствуют следующие разработанные методические приемы:
отмывание эксплантов различных типов (незрелые и зрелые зародыши, каллус) в жидкой среде с добавлением 150 мг/л тиментина и последующее культивирование на среде с добавлением 500 мг/л тиментина; при использовании в качестве реципиентной системы каллусной ткани ячменя необходимо использовать оптимальное время инокуляции - 20 мин. и сокультивирования с агробактерией - 1 сут.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на
Всероссийских научно-практических конференциях с международным
участием: «Биологический мониторинг природно-техногенных систем» (Киров,
2011, 2012), «Актуальные проблемы региональной экологии и биодиагностика
живых систем» (Киров, 2015); Всероссийских молодежных конференциях:
«Адаптационные реакции живых систем на стрессорные воздействия» (Киров,
2012), «Методы и технологии в селекции растений» (Киров, 2014); Первой
молодежной научно-практической конференции СМУ СВРНЦ
Россельхозакадемии «Молодые ученые – аграрной науке Евро-Северо-Востока» (Киров, 2012); Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2012); Форуме Bio-Киров (Киров, 2013); Междисциплинарном форуме «Moscow Science Week 2014 – Неделя науки в Москве» (Москва, 2014); V Всероссийском симпозиуме «Трансгенные растения: технологии создания, биологические свойства, применение, биобезопасность» (Москва, 2014); Международных научно-практических конференциях: «Аграрная наука: развитие и перспективы» (Николаев, Украина, 2015), «Методы и технологии в селекции растений и растениеводстве» (Киров, 2015, 2016).
Работа по теме диссертационного исследования стала победителем в Областном молодежном научно-инновационном конкурсе по программе "У.М.Н.И.К." (Киров, 2011, 2012) и конкурсе докладов на II Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2013); была отмечена дипломом I степени за доклад на XVI Международной научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых «Знания молодых: наука, практика и инновации» (Киров, 2016) и почетной грамотой за доклад на XXIII Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2016).
Личный вклад автора. Автор принимал личное участие в планировании и проведении экспериментов, анализе и обобщении результатов, подготовке материалов к публикации.
Публикации. По результатам исследования опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, 3-х глав результатов, заключения, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 191 странице, содержит 36 таблиц и 40 рисунков. Список литературы включает 343 источника, из них 228 на иностранных языках.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность научному
руководителю д.б.н. Широких И.Г. за неоценимую помощь в подготовке
диссертации. Искреннюю благодарность автор адресует к.х.н. Лундовских И.А.,
к.б.н. Огородниковой С.Ю., к.б.н. Барановой Е.Н., к.б.н. Гулевичу А.А., к.б.н.
Курениной Л.В., д.б.н. Широких А.А., к.б.н. Шуплецовой О.Н., к.б.н.
Щенниковой И.Н. за содействие на разных этапах выполнения работы, а также
благодарит сотрудников лаборатории биотехнологии растений и
микроорганизмов ФГБНУ «НИИСХ Северо-Востока» за дружескую
поддержку.
Культура изолированной ткани картофеля
В отличие от картофеля ячмень относится к числу менее освоенных объектов для генетической трансформации и ни одна из полученных трансгенных линий (табл. A.2, приложение А) не допущена к производству. Зерновые культуры являются главной целью биотехнологического улучшения, т.к. играют важнейшую роль в обеспечении человечества продовольствием (Пастернак, 1991), но именно для зерновых злаков отмечается в настоящее время множество методических затруднений, связанных со сложностью их культивирования и регенерации in vitro (Shravat, Lorz, 2006).
Каллусогенез. Изолированная ткань зерновых злаков в современных фитобиотехнологиях, чаще всего, представлена каллусной культурой 15 неорганизованной пролиферирующей тканью, состоящей из дедифференцированных клеток (Бутенко, 1964; 1975; Шевелуха, 2008). У ячменя формирование каллусной ткани (индукция каллусогенеза) происходит на 3-7 день после помещения экспланта на среду для каллусогенеза в результате дедифференцировки клеток на поверхности экспланта. Особенности каллусогенеза обусловлены генотипом растения (Komatsuda et al., 1989; Широких и др., 2010), но также зависят от типа экспланта (Goldstein, Kronstard, 1986; Круглова, Катасонова, 2009; Чернов, Пендиен, 2011), состава питательной среды (ПС) (Luhrs, Lorz, 1987) и, прежде всего, от соотношения в среде фитогормонов (ауксинов и цитокининов) (Skoog, Miller, 1957). Определенное соотношение ауксинов и цитокининов является обязательным условием для дедифференцировки клеток экспланта и формирования каллусной ткани. При этом ауксины способствуют подготовке клетки к делению, вызывая дедифференцировку, а цитокинины вызывают деление (пролиферацию) дедифференцированных клеток (Шевелуха, 2008). Однако, эффект, вызываемый действием одних и тех же гормонов, может быть различным в зависимости от ткани-мишени. Во многом результаты зависят от эндогенного баланса гормонов, содержащегося в тканях экспланта (Бутенко, 1975; Шаяхметов, 1999). Например, в культуре незрелых зародышей пшеницы и ячменя каллусообразование происходит на среде с (2,4-Д) без цитокининов.
При культивировании клеток и тканей ячменя в качестве источника ауксинов чаще всего используют 2,4-Д (Luhrs, Lorz, 1987; Dahleen, 1995; Dahleen, Bregitzer, 2002; Arabi et al., 2005; Широких и др., 2009). В работе Bregitzer с соавт. (1998) сообщается о положительном воздействии 2,4-Д, вносимой на этапе каллусогенеза и пролиферации каллуса в среду Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige, Skoog, 1962), на регенерацию трех сортов ячменя. При этом оптимальной концентрацией для индукции каллусогенеза указывается концентрация в 3 мг/л (Bregitzer et al., 1998). Однако, другие авторы (Ziauddin, Kasha, 1990) указывают, что при длительном культивировании каллуса ячменя, 2,4-Д (2 мг/л) в большей мере вызывает хромосомные нарушения в каллусных клетках, чем нафтилуксусная кислота (НУК). Помимо 2,4-Д в качестве источника ауксинов при работе с культурой ткани ячменя используют также пиклорам (4-амино-3,5,6-трихлорпиридинкарбоновая-2 кислота) или дикамбу (3,6-дихлор-2-метоксибензойная кислота) (Castillo, 1998; Чернов, Пендиен, 2011).
Значительную роль для каллусогенеза и последующей регенерации играет тип экспланта. Со времени первого сообщения о работе с культурой ткани ячменя in vitro (Norstog, 1970), регенерация была достигнута из различных эксплантов: зрелых (Luppoto, 1984; Чернов, Пендиен, 2011) и незрелых зародышей (Lurhs, Lorz, 1987; Dahleen, 1995; Bregitzer, 1992; Шуплецова, 2003; Овчинникова и др, 2006; Сидоров и др., 2009; Чернов, Пендиен, 2011), молодых соцветий (Чернов, Пендиен, 2011), микроспор (Белинская и др., 1993; Arabi et al., 2005), листьев (Mohanty, Ghosh, 1988), апикальной меристемы (Исаева и др., 1983; Weigel, Hughes, 1985), проростков (Becher et al., 1992) и колеоптиля (Toyoda et al., 1990). Однако наибольшая регенерационная способность характерна для каллусов, индуцированных эксплантами, представляющими собой генеративные ткани (пыльники и незрелые зародыши), что обусловлено зависимостью морфогенеза от компетентности клеток экспланта. Под компетентностью клетки понимают степень ее дифференциации, т.е. соответствующее состояние хроматина и распределение в нем транскрипционной активности (Журавлев, Омелько, 2008), необходимое для индукции каллусо- или органогенеза. Наилучшими эксплантами для ячменя признаны незрелые зиготические зародыши (Wan, Lemaux, 1994; Chang et al, 2003) на 3 подстадии дифференциации (Круглова, Катасонова, 2009). Стадия развития зародыша играет важную роль, поскольку способность к образованию морфогенного каллуса и последующей регенерации для зародышей пшеницы сохраняется у незрелых зародышей в период от 12,5 до 17 сут после опыления (Круглова, Катасонова, 2009). Для ячменя установлено, что незрелые зародыши, размером 1-1,5 мм, у которых только начинается накопление крахмала, индуцируют каллус, который впоследствии легко регенерирует, более мелкие прозрачные зародыши (менее 0,9 мм) не способны формировать каллус, а зародыши размером более 2 мм, как правило, дают начало проростку (Goldstein, Kronstard, 1986; Шуплецова, 2003). В связи с этим, оптимальным эксплантом считается зародыш размером 1-2 мм. Морфогенетический потенциал экспланта зависит также от физиологического состояния растения-донора, например, способность к регенерации у эксплантов, полученных от здоровых растений пшеницы, выращенных в климатических камерах, выше, чем у эксплантов, полученных от растений, выращенных в аналогичных условиях, но подвергнутых стрессу (Chеng et al., 2004).
В зависимости от культуральных признаков каллус разделяют на морфогенный и неморфогенный. У ячменя рыхлый, оводненный каллус, состоящий из крупных вакуолизированных клеток, не способен к морфогенезу, и только плотный, крупинчатый каллус светло-желтого цвета формирует меристематические очаги и дает в последующем регенерацию растений (Luppoto, 1984; Chauhan, Kothari, 2004).
Гистологическая оценка состояния каллуса
Для первичного отбора трансформированных растений на этапе регенерации в среду МС вводили 50 мг/л канамицина. После двух пассажей на средах с увеличенной до 500 мг/л концентрацией канамицина устойчивые к антибиотику побеги черенковали и помещали на среду МС без гормонов и антибиотиков.
Трансформация ячменя. Подготовительным этапом при проведении экспериментов по агробактериальной трансформации ячменя был подбор концентраций, используемых в протоколе трансформации антибиотиков.
Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) тиментина и цефотаксима в отношении A. tumefaciens. Для определения эффективности антибиотиков, используемых при элиминации (удалении) агробактерии, в отношении штамма A. tumefaciens AGL0 определяли МПК тиментина и цефотаксима. С этой целью A. tumefaciens культивировали в жидкой и на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики в градиенте концентраций. Определение МПК в жидкой ПС проводили по стандартной методике двукратных серийных разведений (Егоров, 1983). Готовили два ряда разведений для каждого антибиотика: 1) 800, 400, 200, 100, 50, 25 мкг/мл; 2) 600, 300, 150, 75, 37,5, 18,75 мкг/мл. В каждую пробирку вносили по 0,2 мл суточной культуры A. tumefaciens. Для изучения действия антибиотиков на плотной ПС готовили чашки Петри со средой LB, содержащей 20, 40, 100, 200, 400, 600 мг/л тиментина и цефотаксима. Посев агробактерии на плотную ПС осуществляли методом штриха. Пробирки и чашки Петри инкубировали в термостате при 27С в течение трех дней. Учет результатов проводили, определяя наличие/отсутствие роста бактерии в среде с антибиотиком.
Изучение чувствительности каллуса и эмбриокультуры ячменя к антибиотикам. В связи с низкой регенерационной способностью ячменя в условиях in vitro определяли чувствительность изолированной ткани ячменя к добавлению в состав ПС антибиотиков, необходимых при агробактериальной трансформации для элиминации бактерии (цефотаксим, тиментин) и первичного отбора трансформантов (канамицин). Каллусную ткань и эмбриокультуру ячменя культивировали на средах с добавлением указанных антибиотиков в градиенте концентраций (табл. 4).
Антибиотик Концентрация, мг/л Канамицин 25 50 100 Цефотаксим 150 200 300 Тиментин 450 500 550 Для каллусной ткани антибиотики вносили в среду МС2, для эмбриокультуры – в МС-среду без гормонов. Через 10, 20 и 30 суток культивирования ячменя в присутствии антибиотиков рассчитывали выживаемость каллуса и эмбриокультуры как процент от общего количества эксплантов. Для каллусной культуры определяли также долю морфогенного каллуса, а для эмбриокультуры – наличие морфологических изменений («перехватов», побеления хлорофиллоносной ткани, задержки ризогенеза и т.д.), сравнивая развитие растений, выращенных на средах с антибиотиками, с контрольными растениями. В каждом варианте опыта оценивали по 45 каллусов/ проростков для каждого генотипа ячменя.
Подбор эффективной реципиентной системы. В качестве реципиентных сравнивали три типа систем: морфогенный каллус, незрелые и зрелые зародыши ячменя, различающиеся по направленности морфогенеза и процессов регенерации. Так, незрелые зародыши на подстадии 3 стадии органогенеза при наличии в ПС 2,4-Д формируют каллусную ткань, способную далее к морфогенезу (Круглова, Катасонова, 2009). Поэтому при трансформации незрелых зародышей растения-трансформанты получали путем регенерации через каллусную ткань. Принципиальным отличием при использовании в качестве реципиентной системы зрелых зародышей ячменя являлось то, что растения после трансформации получали путем прямой регенерации (эмбриокультура), минуя стадию каллуса.
Процедура трансформации. Зрелые и незрелые зародыши ячменя культивировали на МС-среде в течение двух суток перед трансформацией с целью отбора стерильных эксплантов. Для зрелых зародышей использовали среду без гормонов, а для незрелых – МС1 (с целью инициации процесса каллусогенеза). Каллусную ткань ячменя трансформировали в возрасте 2-3 недель.
Перед инокуляцией в суспензию A. tumefaciens (109 КОЕ/мл) вносили ацетосирингон (100 мкМ) с целью повышения эффективности трансформации. Зрелые зародыши инкубировали в суспензии агробактерий на качалке (125 об./мин) в течение 1 сут, а затем промывали жидкой средой с половинным составом минеральных солей (среда МС), подсушивали на стерильной ткани и переносили на чашки с агаризованной МС-средой (табл. 2). Незрелые зародыши для инокуляции помещали на среду МС1 и наносили бактериальную суспензию капельно (5 мкл на зародыш). Морфогенный каллус инокулировали путем обмакивания каллуса или его погружения в суспензию A. tumefaciens на 20, 60 или 120 мин, после чего каллус подсушивали на стерильной ткани в течение 5-10 мин и переносили на среду МС1. Чашки с изолированными зародышами и каллусом помещали после инокуляции в темноту и выдерживали при температуре 24С в течение 1-2 сут до появления светлого агробактериального ореола вокруг растительной ткани.
Элиминация агробактерии. По окончании сокультивирования с A. tumefaciens зародыши и каллус отмывали в жидкой МС-среде, подсушивали на стерильной ткани и помещали на МС-среду с добавлением цефотаксима или тиментина (150 - 500 мг/л). Зрелые зародыши культивировали на безгормональной среде, незрелые зародыши и каллус – на средах с регуляторами роста в указанных ранее концентрациях (табл. 3). При каждом пассаже растительной ткани на свежую среду концентрацию антибиотиков снижали на 150 мг/л.
Первичный отбор трансформантов. Отбор проводили после регенерации растений ячменя путем культивирования на ПС с добавлением 50 мг/л канамицина. Растения, не утратившие хлорофилл после 20 дней культивирования на канамицин-содержащей среде, переводили в почвенные условия.
Влияние гетерологичного гена Fe-SOD1 на морфометрические и биохимические показатели трансформантов картофеля
После амплификации с праймерами к гену Fe-SOD1 образцы ДНК, выделенные из трансформированных линий картофеля Тrf1 и Тrf2, содержали ПЦР-фрагмент размером 645 п.н., соответствующий таковому в положительном контроле. В отрицательном контроле фрагмент не синтезировался. Анализ ДНК трансформированных линий картофеля на наличие бактериального гена virD2 подтвердил отсутствие контаминации A. tumefaciens у обеих линий трансформантов (рис. 7б).
Таким образом, на основе сорта картофеля Беллароза методом агробактериальной трансформации получены две независимые трансгенные линии Тrf 1 и Тrf 2, содержащие ген Fe-SOD1.
С целью комплексной оценки последствий трансформации у получивших чужеродную вставку растений на фенотипическом уровне сравнивали растения независимых линий Тrf 1 и Тrf 2 с исходным сортом Беллароза. При выращивании растений in vitro на безгормональных средах определяли морфометрические показатели. По высоте побега, числу междоузлий, длине корня значительных отклонений у обеих линий трансформантов от исходной формы не выявлено (табл. 6), хотя визуально трансформанты превосходили исходные растения по габитусу (рис. 8).
Примечание – Здесь и далее после знака ± указано стандартное отклонение. Рисунок 8 – Растения картофеля Беллароза на среде МС без гормонов
Растения линий Тrf 1 и Тrf 2, несущие в составе генома чужеродную вставку, и контрольные (интактные) растения далее были вовлечены в сравнительную оценку по морфометрическим и биохимическим показателям в условиях in vivo.
Ранее, на примере модельных растений табака и томатов, было показано (Baranova et al., 2010), что экспрессия гена Fe-SOD1 приводит к увеличению активности СОД в листьях и повышению выносливости трансформантов к солевому стрессу и ультрафиолетовому облучению, но, в то же время, вызывает изменения в ультраструктурной организации пластид и митохондрий в клетках фотосинтезирующих тканей. В связи с этим представлялось целесообразным провести сравнение трансформантов картофеля с исходными растениями по накоплению в листьях пластидных пигментов.
Определение пластидных пигментов в листьях растений, выращенных в почве, не выявило значимых различий между исходной формой и трансформированными линиями картофеля по содержанию хлорофиллов и каротиноидов (табл. 7). Соотношения хлорофиллов а и в, хлорофиллов и каротиноидов также находились в пределах нормы, что говорит о том, что трансформированные растения картофеля не имели фенотипических отклонений от нормы.
Линия Хлорофиллы, мг/г Каротино-иды, мг/г Соотношение а в хлорофиллов а/в хлорофиллы/ каротиноиды Исходная форма 5,51±0,48 1,91±0,19 0,97±0,08 2,88 7,63 Линия Тrf 1 5,53±0,08 2,03±0,13 0,83±0,05 2,72 9,07 Линия Тrf 2 5,94±0,31 2,16±0,05 0,94±0,10 2,75 8,65 Проверка функциональной активности встроенного гена показала, что отличие между трансформантами и исходным сортом заключалось в достоверно более высоких показателях суммарной активности СОД в листьях, при одинаковой интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) (табл. 8). Таблица 8 – Активность СОД и ПОЛ в листьях растений картофеля Картофель Беллароза Показатель исходная форма линия Тrf 1 линия Тrf 2 СОД, ед./г сырой массы 3,83±0,12 4,05±0,05 4,66±0,31 МДА, нмоль/г сырой массы 14,41±1,66 17,09±3,66 16,28±3,41 Достоверно отличается от исходной формы при а=0,01 Однако, проверка экспрессии целевого гена методом ОТ-ПЦР, проведенная у растений картофеля после биохимического анализа, установила, что ген FeSOD1 экспрессирует только линия Trf 1, тогда как в растениях линии Тrf 2 экспрессия не выявлена (рис. 9). Известно, что у значительной доли трансгенных растений интродуцированный ген через какое-то время может терять свою активность, хотя физически сохраняется в геноме (Лутова, 2010).
Электрофореграмма продукта амплификации кДНК трансгенных линий картофеля на наличие экспрессии гена Fe-SOD1: М – маркер молекулярных масс, 1-положительный контроль (плазмидная ДНК), 2 и 4 трансформированные растения Тrf 1 и Тrf 2, 3 –отрицательный контроль (исходное растение) По показателям продуктивности трансформированные растения обеих линий при выращивании в почве не отличались от исходной формы (табл. 9).
Показатели продуктивности картофеля Беллароза в первом клубневом поколении Вариант Количествоминиклубнейс растения,шт. Средняяпродуктивностьрастения, г Количество миниклубней по фракциям, % 1см 1-2 см 2 см Исходная форма 6,86±1,08 4,95±1,61 16,3 67,4 16,3 Линия Тrf 1 7,17±2,56 6,08±1,83 15,9 63,7 20,4 Линия Тrf 2 7,83±1,72 5,05±2,05 18,1 63,6 18,3 Примечание – После знака ± указано стандартное отклонение. Встройка и экспрессия чужеродного гена повлияла только у линии Тrf 1 на распределение миниклубней по размеру. Основным отличием от исходной формы была способность Тrf 1 образовывать большее количество крупных миниклубней и снижать долю мелких. Полученные результаты позволяют сделать вывод об отсутствии отрицательных эффектов встраивания гена Fe-SOD1 на экспрессию жизненно важных генов реципиентного растения. Агробактериальная трансформация картофеля геном Fe-SOD1 не вызвала в вегетативном потомстве трансформантов нарушений роста и клубнеобразования, изменений в комплексе фотосинтетических пигментов и, вместе с тем, сопровождалась усилением суммарной активности супероксиддисмутазы как в растениях линии Тrf 1, экспрессирующих целевой ген, так и в растениях линии Тrf 2, в отношении которых наличие экспрессии методом обратной транскрипции доказать не удалось. Эти данные позволяют предполагать, что на момент проверки функциональной активности супероксиддисмутазы у трансформантов обеих линий встроенные гены были функциональны и, вероятно, могли участвовать в поддержании перекисного гомеостаза растений. Сайленсинг («замолкание») гетерологичного гена FeSOD1 в геноме линии Тrf 2, вероятно, произошел позднее.
Изучение влияния перфторорганических соединений и метилотрофных бактерий на каллусную ткань ячменя
В качестве наиболее универсального индуктора морфогенеза для каллусной ткани ячменя следует использовать сочетание бактеризации каллуса M. extorquens с культивированием в присутствии ПФД, которое способствовало достоверному увеличению частоты встречаемости меристематических клеток, наряду с высокими показателями частот встречаемости дифференцированных структур в каллусе и направленности морфогенетических процессов в сторону геммогенеза.
Положительные тенденции в длительно культивируемой каллусной ткани ячменя показывают, что сочетание ПФОС и бактеризации M. extorquens может быть использовано для стимуляции морфогенетических процессов в каллусной ткани ячменя, когда необходимо длительное культивирование и многократное пассирование каллусной ткани, приводящее к ее старению и потере способности к регенерации. Процесс старения каллуса, по данным Бабаевой с соавторами (Бабаева и др., 1994), цитологически проявляется в увеличении степени конденсации хроматина в ядрах меристематических клеток, а также в постепенном сокращении количества меристематических зон в каллусной ткани. Как показали наши данные, ПМФД (10 об.%) в чистом виде и в сочетании с бактеризацией каллуса M. extorquens способствует повышению встречаемости меристематических клеток в длительно культивируемом каллусе ячменя, а значит, вызывает замедление старения каллусной ткани.
Реакция каллусной ткани на внесение индукторов морфогенеза зависела от генотипа. Каллусные линии, инициированные сортами Белгородский 100, Купец, 498-08 и 419-07 характеризовались наибольшей отзывчивостью на воздействия, индуцирующие морфогенез, в отличие от других (637-98, 473-07) исследованных генотипов с изначально более низким уровнем компетентных клеток. Выявление генотипических различий в гистологическом строении каллусов и степени их реакции на внесение индукторов позволило выделить генотипы Белгородский 100 и Купец как наиболее перспективные для дальнейшей работы.
В связи с тем, что среди исследуемых перфторуглеродов ПФД был выбран в качестве наиболее универсального индуктора морфогенеза в каллусе ячменя, далее осуществляли подбор оптимальных условий культивирования, обеспечивающих наиболее эффективную реализацию морфогенетического потенциала каллуса ячменя сортов Купец и Белгородский 100 на средах с добавлением данного перфторуглерода. Для определения оптимальной концентрации ПФД, каллус культивировали в полужидкой среде МС3 с добавлением ПФД в градиенте концентраций от 2 до 15 об.%. В контроле исследуемые генотипы различались по выживаемости: у сорта Купец некрозы отсутствовали, тогда как 9,1% каллусных линий сорта Белгородский 100 погибли (табл. 18).
Доля каллусов (% от общего количества каллусных линий) с некрозами у исследованных генотипов ячменя после двух недель в среде с ПФД Генотип Концентрация ПФД, об.% (контроль) 2 5 10 15 Купец 0 0 0 0 27,5 Белгородский 100 9,1 0 0 0 2,6 Варианты, статистически значимо отличающиеся от контроля при =0,01 Примечание - Приведены доли некротизации каллуса с учетом -преобразования (2 арксинусХ) После глубинного культивирования с ПФД в градиенте концентраций от 2 до 10 об.% гибели каллусной ткани не наблюдалось у обоих генотипов, т.е. ПФД способствовал достоверному ее снижению у сорта Белгородский 100, в сравнении с контролем. В результате увеличения концентрации ПФД до 15 об.%, некротизацию каллуса наблюдали у обоих исследованных сортов.
По окончании культивирования каллуса оценивали влияние ПФД на регенерационную способность ячменя. Добавление ПФД способствовало повышению частоты регенерации ячменя Купец во всем градиенте исследованных концентраций, но наибольшее (на 15,0%) положительное воздействие на каллусную ткань ПФД оказывал в концентрации 5 об.% (рис. 19).
У сорта Белгородский 100 высокие (10 и 15 об.%) концентрации ПФД вызывали незначительное (на 6,1 и 0,7% соответственно) снижение регенерационной способности по сравнению с контролем (37,5%). Достоверное положительное отличие от контроля (=0,05) у этого генотипа ячменя обеспечила, как и у сорта Купец, концентрация ПФД 5 об. %: частота регенерации возросла на 19,6% к контролю.
Таким образом, было установлено, что выживаемость каллуса ячменя при добавлении ПФД, в количестве от объема питательной среды до 10% включительно, не снижается. В концентрации 5 об.% ПФД может оказывать на каллусную ткань положительное воздействие, которое проявляется в достоверном увеличении регенерационной способности исследованных генотипов ячменя. Далее оценивали влияние способа культивирования (глубинное / поверхностное) каллусной ткани при добавлении ПФД (5 об.%) и этапа его внесения (пролиферация каллуса / морфогенез). Добавление перфторуглерода в питательную среду для пролиферации каллусной ткани способствовало незначительному (на 1,5-3,9%) увеличению доли морфогенного каллуса относительно контроля, как при глубинном, так и поверхностном культивировании у двух исследованных генотипов ячменя (табл. 19).