Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время низкотемпературные процессы широко используются в различных областях биотехнологии. На стадиях постферментанионной обработки нашли применение такие процессы как замораживание, сублимационная сушка, концентрирование вымораживанием, криогрануляция. Несмотря на несколько большую стоимость по сравнению с другими методами, данные технологии обеспечивают очень высокое качество конечного продукта, а в некоторых случаях являются единственно возможными.
Для коллекции культур, как больших, так и малых локальных блоков, наиболее эффективным и перспективным признан метод криоконсервирова-ния [Heckly, 1978], при котором коллекционные штаммы хранятся при температуре жидкого азота весьма длительное время, сохраняя свои специфические свойства. В отличие от других способов хранения, в условиях долгосрочного хранения при низких температурах не происходит нарушений на генетическом уровне.
Однако, с началом использования низких температур в биотехнологии, возник ряд проблем, связанных с частичной утратой жизнеспособности и функциональных свойств различных микроорганизмов. Известно, что при замораживании реализуются различные процессы, имеющие неблагоприятное или летальное воздействие на клетки [Пушкарь, 1975]. К ним относятся концентрация электролитов, кристаллообразование, изменение кислотности, а также непосредственное действие самих низких температур. Методы, позволяющие компенсировать эти повреждающие факторы, основаны на результатах исследований, носящих, главным образом, эмпирический характер, и заключаются в использовании определенных криопротекторов с оптимальной концентрацией. Но зачастую использование криопротекторов бывает нежелательно по причине их токсичности или исключено вовсе из-за невозможности их сепарации в конце процесса, как при сублимационной сушке. По своей природе большинство криопротекторов являются чуждыми веществами для живых клеток. При помещении клеток в растворы криопротекторов происходит обезвоживание, наблюдаются химические реакции криопротекторов с составляющими клеток с образованием различных комплексов, изменяются физические свойства как суспензионной, так и внутриклеточной сред.
Несмотря на бесспорную практическую значимость традиционных методов зашиты, по нашему мнению, перспективы дальнейшего развития они не имеют. Назрела необходимость в разработке качественно нового метода
РДуцаева, 1987] решения задачи по поддержанию сохранности биоматериа
ла в низкотемпературных процессах . Такой метод мог бы заключаться в
получении культуры, устойчивой к неблагоприятным факторам заморажи
вания, за счет адаптации к ним на этапе культивирования. В природе каж
дый биологический организм обладает большей или меньшей степенью
адаптабельности к изменению условий окружающей среды. Чем выше эта
степень, тем больше шанс выжить в неблагоприятных условиях и сохранить
свои специфические свойства. Дрожжевые клетки обладают целым рядом
механизмов адаптации к изменениям условий роста. Учитывая также их
большую практическую значимость, дрожжи можно считать наиболее инте
ресным объектом исследования в данном направлении.
Ц»яь-рабвия.Эдиарнм1НЫЛ1>Н0 Изучить влияние температурной и ос-мотичской адаптации дрожжей на их криорезнстентность, определить пути интенсификации массопереноса воды из клетки при замораживании.
Для выполнения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
изучить влияние температуры роста на температурный диапазон фазовых переходов липидов в мембранах и криорезнстентность клеток;
изучить реакцию дрожжевых клеток на повышение осмолярности среды роста различными добавками;
- і изучить влияние внутриклеточных веществ-осморегуляторов на криорезнстентность осмоадаптированных клеток;
- исследовать сохранность ферментативной и генеративной активности
замороженных-отогретых клеток;
-.исследовать процесс льдообразования в клетках с различным биохимическим составом.
;. Научная новизна работы. В результате исследования определен каче-ственношовый подход к решению задачи повышения сохранности дрожжевых культур в низкотемпературных процессах. Намечено два пути увеличения криорезистентности клеток: адаптация к пониженным температурам и адаптация к осмотическому фактору при культивировании.
Показано, что клетки, выращенные при субоптимальной температуре и имеющие температурный диапазон фазового перехода липидов в отрицательной области, были значительно устойчивее к низким температурам, чем клетки, выращенные при оптимальных температурах.
Установлена корреляционная зависимость между содержанием трега-лозы иполиодов в клетках и их выживаемостью после замораживания.
' Исследована зависимость эвтектических температур и динамики льдообразования от биохимического состава клеток.
Практическая значимость. Проведенное исследование представляет практический интерес, так как определенные в работе условия культивирования и оптимально соответствующие им режимы замораживания позволя-ют достичь высокой сохранности клеток без использования криопротекто-ров. Результаты и выводы работы могут быть использованы в практике криоконсервировання как в коллекциях культур, так и в производственных криобанках маточных культур, для выращивания высококачественных дрожжей, предназначенных для сублимационной сушки, в справочной литературе. Разработанная математическая модель позволит прогнозировать устойчивость дрожжевых клеток к замораживанию в зависимости от их морфологических и биохимических свойств.
Теоретическое значение представляют результаты исследований по влиянию температуры роста на температурный диапазон фазовых переходов в мембранах и криорезистентность дрожжей, по влиянию биохимического состава дрожжей на их криорезистентность и процесс льдообразования.
Апробация работы.
Результаты исследований докладывались и обсуждались на:
-XLVI научно-технической конференции МГАХМа(Москва, 1995г.);
іМеждународной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (Москва, 1995г.);
Международном научном симпозиуме ЮНЕСКО "Техника и технология экологически чистых химических производств" (Москва, 21-23 октября 1996г.),
Научных чтениях "Теоретические/фактические основы расчета термической обработки пищевых продуктов" (Москва, 1997г.).
Структура и обьем работы.
Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов экспериментов, изложения и анализа полученных результатов, выводов, списка литературы, приложений. Работа изложена на 122 страницах, содержит 24 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает 171 источник, из них 107 опубликованных в зарубежных изданиях.