Разделение стабильных изотопов углерода микроорганизмами и возможности его практического использования Зякун, Анатолий Маркович

Введение к работе

Актуальность проблемы. В течение последних 40 лет свойство биологических систем разделять (фракционировать) изотопы углерода является предметом постоянного внимания биологов, биогеохимиков и геохимиков (Craig, 1953; Галимов,196& Алексеев и др.,1978; Иванов, 1982; Rundel et at., 1989 и др.І-

Результаты анализа вариаций распространения стабильных изотопов ¹²С и ¹³С в продуктах жизнедеятельности живых систем по отношению к углероду потребленного вещества показали, что их количественные значения могут изменятся в зависимости от характера организма, условий его развития и других как физико-химических,так и биологических факторов [Park & Epstein, 1960; Abelson & Hoering,1961; Алексеев и др., 1973; De Niro & Epstein,1977; Беляев, 1985 и др.].

Информация об условиях, в которых обитали живые организмы, и их физио-лого-биохимических особенностях может проявиться на уровне атомов. В ряде случаев это обеспечивает ее долговременную сохранность и представляет повышенный интерес для специалистов, интересующихся определением происхождения углеродсодержащих продуктов в биосфере, оценкой роли и активности живых систем в природных и биотехнологических процессах [Алексеев и др., 1973; Галимов, 1981; Леин, 1983; Иванов и Нестеров, 1983; Беляев, 1984; Schidlowski, 1988 и др.].

Расшифровка информации, заложенной в изотопных характеристиках углерода анализируемых продуктов, может быть получена при рассмотрении модельных экспериментов или процессов, наблюдаемых в природных условиях, которые связаны с определенными изменениями распространения изотопов и обусловлены различными превращениями углеродсодержащих соединений биологическими системами.

К началу настоящей работы (1974 год) способность к биологическому фракционированию изотопов углерода была показана для высших растений и некоторых водорослей. Фракционирование изотопов углерода фототрофными бактериями в зависимости от их биохимических и физиологических условий роста не было изучено. Ничего не было известно и о факторах, определяющих формирование изотопного состава углерода метаболитов у наиболее распространенных представителей почвенной микрофлоры - грибов и дрожжей. Не были выявлены и причины, оказывающие влияние на распределение изотопов углерода в продуктах, наблюдаемых при бактериальном образовании и окислении метана. Поэтому сделать однозначные заключения о возможностях использования изотопных данных при диагностике биологических процессов, связанных с образованием соответствующих форм углерода в природных и лабораторных условиях было невозможно.

Принимая во внимание, что в ряде случаев изотопный состав углерода продуктов жизнедеятельности микроорганизмов может быть единственным источником информации о их существовании в природных экосистемах, решение поставленных выше вопросов является весьма актуально. Поэтому анализ факторов, определяющих разделение изотопов углерода в продуктах, образуемых при жизнедеятельности чистых культур микроорганизмов разных таксономических групп, имеет как теоретическую, так и практическую значимость.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в изучении факторов, влияющих на формирование изотопного состава углерода при жизнедеятельности микроорганизмов, как наиболее динамичной части живой материи в природе. Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Выяснить диапазон значений изотопного состава углерода продуктов: а) фо-тотрофных бактерий как наименее обследованных в этом плане объектов; б) ге-теротрофов - грибов и дрожжей при их росте на частично окисленных (глюкоза,

целлюлоза, лигнин) и полностью восстановленных (н-алканы) субстратах; в) ме-танобразующих и метанотрофных бактерий.

1. Выявить закономерности разделения изотопов углерода, обусловленные фи-зиолого-биохимическими особенностями роста микроорганизмов и природы используемых ими субстратов.

2. Оценить влияние физических и физико-химических условий обитания микроорганизмов на величину и направленность разделения изотопов углерода.

3. Определить возможность использования вариаций распространенностей изотопов углерода для оценки биосинтетической активности микроорганизмов как в биотехнологических.так и природных процессах.

Материалы и методы исследования. Объектами исследования фракционирования изотопов углерода при бактериальном фотосинтезе служили представители класса Anoxyphotobacteria: Rhadopseudomonas palustris штамм Накамура (семейство Bhodospirillaceae); Thiocapsa roseopersicina BBS (семейство Chromatiaceae); Ectothio-rhodospira shaposhnikotii (семейство Ectoshiorhodaceae) и Chlorobium limicola forma thiosulfatophillum 1С (семейство Chlorobiaceae).

При изучении фракционирования изотопов углерода гетеротрофными микроорганизмами использовались грибы базидиомицеты, способные разлагать сложные ароматические и гетероциклические вещества как природного, так и абиогенного происхождения (Phanaerochaete chrysosporium F-1764 (ВКМ ИБФМ РАН); Panta tigrinus 144 (Головлева и др., 1986J); и дрожжи, растущие на н-алканах и углеводах (Candida quilHermondii ВСБ-774; Candida lipolytka 674 (ВКМ ИБФМ РАН).

Изучение фракционирования изотопов углерода при бактериальном метано-генезе проводили у Melhanobacterium formkicum штамм Kuznetsov 41, Methano-bacterium formicicum штамм Ivanov 31, Methanosarcina barkeri MS, MeAanasarcina sp. 47, Methanococcoides euhalobius 283 и Methanobacterium thermoautotrophicum ДН. Для анализа фракционирования изотопов углерода метанокисляющими бактериями использовали культуры Methylomonas melhanica 12, Methylosinus trichosporium 44, Methylococcus capsulatus и смешанную культуру 1-70 (ВНИИ синтезбелок), содержащую до 95-98% Methylococcus capsulatus. Фракционирование изотопов углерода в природных условиях при бактериальном метаногенезе наблюдали в экспериментах на заводняемых нефтеносных пластах Бондюжского нефтяного месторождения (Татарстан), а при бактериальном окислении метана - в опытах с метанстрофными бактериями, нанесенными на обрушаемые породы выработанного пространства угольных шахт Донбасса (Украина).

Научная новизна. Полученные данные представляют комплексное исследование факторов, определяющих разделение (фракционирование) изотопов углерода микроорганизмами, являющимися ключевыми агентами в цепи круговорота углерода в природных экосистемах. Их новизна состоит в следующем.

1. Установлены факторы, определяющие фракционирование стабильных изото
пов углерода фототрофными серобактериями и выявлена роль удельной концен
трации С0₂ в формировании изотопного состава углерода при их метаболизме.

Показано наличие специфичной концентрации С0₂, выше которой фракционирование изотопов определяется биохимическими особенностями изученных бактерий, а при ее уменьшении величина фракционирования изотопов углерода снижается и может достигать нулевого значения.

2. Впервые проведен систематический анализ разделения изотопов углерода
микроорганизмами с гетеротрофным типом питания. Показано, что факторами,
определяющими величину фракционирования ими изотопов углерода, является
вероятность включения в конструктивный метаболизм субстрата или его части, а
также соотношения потоков С0₂, выделяющейся из клетки и включенной в
биомассу при ее гетеротрофной фиксации. Предложен критерий, позволяющий

определять участие гетеротрофных микроорганизмов в окислении углеводородов нефти по изотопному составу углерода метаболической С0₂, липидной и углеводной фракций биомассы.

3. Впервые с использованием сочетания методов материального и изотопного баланса выявлены закономерности фракционирования изотопов углерода чистыми культурами метанобразующих бактерий и доказано, что величина изотопного фракционирования обратно пропорциональна скорости бактериального метан-образования.

4. На основе современных биохимических представлений о механизме бактериального метаногенеза на С,- и С₂-субстратах и полученных экспериментальных данных выявлены факторы, определяющие формирование изотопного состава углерода метана, биогенной С0₂, а также органического вещества биомассы и метаболитов. Показано, что фракционирование изотопов углерода метанобра-зующими бактериями зависит от используемого субстрата ( С02+Н₂, метанол, метиламины, ацетат и др.), удельной его концентрации, видовой принадлежности микроорганизмов (мезофилы, термофилы) и удельной скорости метаногенеза.

5. Впервые выяснены причины, детерминирующие величину фракционирования изотопов углерода метанотрофными бактериями и выявлены количественные зависимости между изотопным составом углерода метана в среде обитания метанотрофных бактерий и долей его потребления. Установлена степень влияния условий роста метанотрофов (периодическое и непрерывное культивирование, рост клеток на твердофазньи носителях и иммобилизованных в полимерные матрицы, аэрация ) на величину фракционирования изотопов углерода потребленного ими метана

6. Разработаны методы колігчественного определения степени потребления и расходования микрооганизмами углерода субстрата в конструктивном и энергетическом обмене на основе анализа изотопного состава углерода продуктов их жизнедеятельности.

Научно-практическая значимость. 1. Создана теоретическая и экспериментальная база данных по фракционированию изотопов углерода гетеротрофными микроорганизмами, позволяющая количественно определять степень обогащения микробной биомассой лигно-целлюлозных природных комплексов (древесные опилки, измельченная солома) при росте на них грибов.

2. На основании анализа изотопных измерений углерода метана и углекислоты в заводняемых нефтеносных пластах и результатов лабораторных экспериментов по фракционированию изотопов углерода метзнобразующими бактериями, растущими на разных субстратах, доказано, что процесс современного бактериального метаногенеза способствует дополнительному получению нефти из нефтеносных пластов.

3. На основе лабораторных экспериментов по фракционированию изотопов углерода метанотрофными бактериями разработана и апробирована методика оценки активности метанокисляющих бактерий при реализации микробиологического способа снижения метана в атмосфере угледобывающих шахт. Результаты измерений изотопного состава углерода метана и углекислоты в шахтной атмосфере показали, что эффективность потреблния метана метанотрофными бактериями, нанесенными на обрушаемые породы в угольной шахте, достигала 50 - 70% от исходной концентрации метана.

Апробация работы. Материалы диссертации были должены на VI-XIII Всесоюзных симпозиумах по стабильным изотопам в геохимии (Москва, 1976, 1978, 1980, 1982, 1984, 1986, 1989, 1992 г.г.), на П-Ш Всесоюзных совещаниях по геохимии углерода (Москва, 1986, 1991г.г.),на международном симпозиуме "Изотопы в природе", (Лейпциг, 1983), на международном коллоквиуме по изотопам (Фрайберг,1988), на Ш-й Всесоюзной конференции по масс-спектрометрии (Ле-

нинград, 1981), на школе-семинаре "Применение масс-спектрометрии в биологии и медицине" (Харьков, 1989, 1992 г.г.), на международной конференции по бактериальным газам (Милан, 1989), на 9-м международном симпозиуме по биогеохимии окружающей среды (Москва, 1990), на 2-й конференции по газам в морских осадках (Дания, 1992), на 193-м национальном собрании американского химического общества (Денвер, Колорадо, 1987).

Публикации. По итогам исследований опубликовано около 50 работ в периодической научной печати и тематических сборниках, получены 2 авторских свидетельства на изобретения. '

Основные защищаемые положения диссертации: 1. Фототрофные бактерии при росте в автотрофних условиях с разной скоростью включают в метаболизм углекислоту, содержащую ¹²С и "С (т.е., фракционируют изотопный состав углерода). Также как у высших растений и водорослей, величина этого фракционирования фототрофньтаи бактериями определяется активностью их ферментных систем, участвующих в первичной фиксации углекислоты (РуДФ-, ФЕП-, и пируват-карбоксилазы).

Обнаружен и изучен фактор фракционирования изотопов углерода фотосин-тезирукшшми организмами, определяемый концентрацией углекислоты, который по степени влияния на формирование изотопного состава углерода продуктов их жизнедеятельности может перекрыть все другие известные причины, приводящие к фракционированию изотопов углерода.

2. Изучено фракционирование изотопов углерода гетеротрофными микроорга
низмами - эукариотами (на примере грибов и дрожжей). В зависимости от ис
пользуемого субстрата метаболическая углекислота и биомасса клеток могут быть
как обогащены изотопом ¹³С, так и обеднены им относительно потребленной
части субстрата. Факторами,определяющими формирование изотопного состава
углерода биомассы гетеротрофов и их метаболитов являются процессы, связан
ные с гетеротрофной ассимиляцией углекислоты (карбоксилирование пирувата,
ФЕП и др.) и ее выделением при метаболизме органических субстратов в клетке
(функционирование окислительного пентозо-фосфатного цикла, цикла трикарбо-
новьгх кислот и др.).

3. Изотопный состав углерода метана, продуцируемого метанобразующими бактериями, имеет широкий диапазон значений 5¹³С (от крайне низких, не наблюдаемых ни для каких продуктов других организмов, и до величин, наследующих или даже тяжелее изотопного состава углерода используемого субстрата). Факторами, определяющими формирование изотопного состава углерода биогенного метана являются удельная концентрация субстрата (С0₂), удельная скорость метаногенеза, природа субстрата и особенности его метаболизма бактериями.

4. Фракционирование изотопов углерода метана метанотрофами, растущими в водной среде, определяется соотношением скоростей поступления метана из газовой фазы в жидкость и потреблением его бактериями. Соотношение потоков кислорода и метана в среду обитания метанотрофов также влияют на фракционирование изотопов углерода. Распределение изотопов углерода метана, потребленного бактериями, между биогенной углекислотой и биомассой клеток определяется активностью ферментных систем, ответственных за утилизацию углерода метана.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, и приложения. Общий объем работы : 300 страниц текста, 78 таблиц, 60 рисунков, в том числе 70 таблиц в приложении. Библиография включает 450 наименований