Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время, согласно Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года, производство ферментов является одним из приоритетных направлений промышленной биотехнологии.
-L-фукозидазы (ЕС 3.2.1.51) – ферменты, относящиеся к классу О-гликозидгидролаз, расщепляют внутренние – 1,3, - 1,4 - гликозидные связи основной цепи молекул фукоидана – полисахарида клеточных стенок бурых водорослей. Установлено, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза фукоолигосахариды и моносахарид фукоза обладают пребиотическим и иммунотропным действием. Отсутствие или низкий уровень фукозы в крови приводит к нарушению синтеза фукозилированных гликанов и вызывает хронический иммунодефицит и недоразвитость ткани тимуса (Park et al., 2007, Ali et al, 2008). На основании вышеизложенного создание на основе продуктов гидролиза фукоиданов лечебно-профилактических средств с иммуностимулирующими свойствами является актуальной задачей.
Спектр микроорганизмов – природных продуцентов -L-фукозидаз довольно широк, однако они характеризуются недостаточной активностью для их использования в качестве промышленных продуцентов.
В мировой практике для получения биотехнологически важных ферментных препаратов используют различные молекулярно-генетические подходы, которые состоят в комбинации методов генной инженерии и микробиологии, для создания микроорганизмов с заданными генетическими характеристиками, что позволяет повысить активность и выход целевого фермента по сравнению с нативным продуцентом.
Изучением -L-фукозидаз занимались в основном зарубежные ученые: Sano (1992), Goso (2001), Katayama (2004), Miura (2005), Rodriguez-Diaz (2013) и другие. Однако число работ, посвященных выделению и клонированию генов -L-фукозидаз с целью максимальной продукции фермента, увеличению его активности, изменения свойств ферментов для их промышленного применения, немногочисленно, а в отечественной практике отсутствуют вовсе.
В настоящее время на рынке имеется коммерческий ферментный препарат термостабильной -L-фукозидазы из T. maritima фирмы Megazyme. Однако он имеет низкую фукозидазную активность и высокую стоимость. На отечественном рынке коммерческих препаратов ферментов, способных расщепить сульфатированные полисахариды морских водорослей, не существует, что делает поиск и получение активных продуцентов -L-фукозидазы актуальной задачей современной биотехнологии.
Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры биохимии и биотехнологии Воронежского государственного университета инженерных технологий по разработке биологических методов получения минорных сахаров и изучению их функциональных свойств в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», государственный контракт № 14.512.11.0069 от 17.04.2013 г.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биотехнологии высокоактивной -L-фукозидазы с использованием методов генной инженерии, исследовании некоторых физико-химических свойств ферментного препарата и определении пребиотической способности полученных фукозосодержащих гидролизатов.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
выбор микроорганизма – источника гена -L-фукозидазы и системы экспрессии клонированного гена;
получение рекомбинантного штамма – высокоактивного продуцента -L-фукозидазы;
определение оптимальных условий биосинтеза целевого фермента;
получение ферментного препарата -L-фукозидазы и исследование его некоторых физико-химических свойств;
очистка рекомбинантного белка -L-фукозидазы;
исследование ферментативной деструкции фукоидана;
определение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов в опытах in vivo.
-
Научная новизна. Впервые получен отечественный ферментный препарат высокоактивной -L-фукозидазы с применением технологии рекомбинантных ДНК. Путем введения в составе плазмиды pet23b+ гена -L-фукозидазы под контролем Т7 - промотора сконструирован штамм E. coli top 10 - перспективный продуцент -L-фукозидазы, превышающий уровень активности нативного продуцента в 20 раз и не уступающий известным рекомбинантным бактериальным продуцентам -L-фукозидаз. Установлены оптимальные параметры биосинтеза генетически-модифицированного штамма; показано, что введение в состав питательной среды синтетического аналога лактозы – ИПТГ в концентрации, 0,1 мМ при рН 7,0 вызывает индукцию экспрессии гена фукозидазы, при этом в бактериальных клетках наблюдается активное накопление белка с молекулярной массой 45 кДа. Исследование стабильности функционирования гибридных плазмид в клетках продуцента показало, что в течение 10 пассажей генетически-модифицированный штамм E. coli top 10 сохраняет свою стабильность.
Доказано, что введение в рацион опытных мышей фукозосодержащих гидролизатов в дозировке 0,04 % от массы тела в условиях экспериментального дисбиоза способствует восстановлению состава и численности индигенной кишечной микрофлоры мышей, проявляя тем самым пребиотическую активность.
Практическая значимость. Разработана биотехнология рекомбинантной -L-фукозидазы, способной гидролизовать фукоидан бурых водорослей до фукоолигосахаридов и фукозы, которые позволят существенно расширить рынок пребиотиков.
Полученные научные материалы используются в учебном процессе для студентов, обучающихся по направлению подготовки «Биотехнология».
Новизна технических решений отражена в заявке на изобретение (приоритет от 24.09.2013 № 2013143212).
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были доложены на отчетных конференциях ВГУИТ (г. Воронеж, 2011-2013 гг.); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011, 2012 гг.).
Данная работа была удостоена диплома конкурса молодых ученых, проходившего в рамках VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».
Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.».
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 13 работ, в том числе 5 в журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает рисунков и таблиц. Библиография включает наименований, в т. ч. иностранных.
![Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс]](/i/i/4612/199276.png "Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс] Ефременко Анна Александровна")
