Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современное состояние биотехнологических процессов и методов получения иммунобиологических лекарственных препаратов (обзор литературы) 20
1.1. Протективные антигены V. cholerae 20
1.2 Культивирование V. cholerae 21
1.3 Оптимизация процессов культивирования микроорганизмов с использованием методов математического моделирования 27
1.4 Очистка биологических аэрозолей в биотехнологических процессах 32
1.4.1 Стерилизующая фильтрация биоаэрозолей 39
1.5 Контроль защитной эффективности систем очистки биологических аэрозолей 41
1.5.1 Биологические методы испытания фильтров 41
1.5.2 Физико-химические методы испытания фильтров
1.6 Использование фильтрации в производстве иммунобиологических лекарственных препаратов 47
1.7 Сублимирование биологических препаратов 52
1.8 Технологические аспекты производства твердых лекарственных форм 59
1.8.1 Вакцины в форме таблеток 59
1.8.2 Таблетирование и гранулирование в производстве твердых форм препаратов 61
1.8.3 Вспомогательные вещества в технологии получения таблеток 66
1.8.4 Оборудование для покрытия оболочками твердых лекарственных форм 67
1.8.5 Типы пленочных оболочек и особенности покрытия ими твердых лекарственных форм 70
Заключение по обзору литературы 74
Собственные исследования 77
Глава 2 Материалы и методы 77
2.1 Основные материалы и оборудование 77
2.2 Методы исследований
2.2.1 Биологические методы 78
2.2.2 Физико-химические, физические и биохимические методы 81
2.2.3 Статистическая обработка результатов 84
Результаты исследования и их обсуждение 86 глава 3 конструирование системы очистки от микроорганизмов отходящих из биореактора газов и оценка ее эффективности 86
3.1 Конструирование системы очистки от микроорганизмов отводимых из биореактора газов 86
3.2 Экспериментальная оценка возможности применения физического метода испытания системы очистки отходящих газов от биореактора на эффективность очистки от микроорганизмов 91
Заключение по главе 97
ГЛАВА 4 Моделирование периодического процесса культивирования производственных штаммов v. cholerae м-41 серовара огава и v. cholerae 569в серовара инаба с лимитацией по углеродному субстрату 99
4.1 Моделирование периодического процесса культивирования V. chol-erae М-41 серовара Огава 100
4.2 Моделирование периодического процесса культивирования V. chol-erae 569В серовара Инаба 105
4.3 Конструирование программ для ЭВМ для решения математических моделей 110
4.4 Проверка итогов моделирования при выращивании производственных штаммов холерных вибрионов 113
Заключение по главе 117
ГЛАВА 5 Разработка технологии концентрирования, выделения и очистки антигенных компонентов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной ме тодом ультрафильтрации 118
5.1 Повышение качества ультрафильтрационного концентрирования О-антигенов V. cholerae 118
5.2 Использование тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования иммуногенных компонентов холерной химической вакцины, продуцируемых штаммом V. cholerae 569В серовара Инаба 134
5.3 Разработка аппаратного метода обессоливания антигенных компонентов холерной химической вакцины 145
5.4 Ультрафильтрационное фракционирование холерогена-анатоксина холерного вибриона 150
Заключение по главе 160
ГЛАВА 6 Совершенствование технологии стерилизующей фильтрации холерогена-анатоксина v. cholerae 569в серовара инаба 162
6.1 Изучение эффективности работы оборудования и технологической процедуры стерилизации холерогена-анатоксина фильтрованием 162
6.2 Интенсификация технологии стерилизации холерогена-анатоксина фильтрованием 166
Заключение по главе 168
ГЛАВА 7 Сублимирование протективных антигенов v. cholerae 169
Заключение по главе 175
ГЛАВА 8 Разработка технологии гранулирования ингредиентов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной и оптимизация процесса нанесения ки-шечнорастворимого покрытия на готовую лекарственную форму вакцины 176
8.1 Исследование процесса гранулирования существующей биофарма цевтической композиции холерной химической вакцины 176
8.2 Обоснование новой биофармацевтической композиции холерной химической вакцины и разработка оптимальной технологии гранулирования таблеточной смеси в псевдоожиженном слое 186
8.3 Разработка технологии прессования гранул с новой биофармацевти ческой композицией и изучение характеристик таблеток-ядер 193
8.4 Оптимизация технологии нанесения кишечнорастворимого покры тия на таблетку холерной химической вакцины 194
8.5 Экспериментальное обоснование возможности получения новой формы выпуска холерной химической вакцины – таблетки 100 мг 203
Заключение по главе 205
ГЛАВА 9 Разработка экспериментально производственной технологии производства холерной химической вакцины с использованием атоксигенных штаммов v. cholerae 207
9.1 Характеристика атоксигенных штаммов V. cholerae после длительного хранения 207
9.2 Разработка технологии культивирования авирулентных штаммов V. cholerae с целью получения О-антигенов 209
9.3 Разработка математических моделей синтеза О-антигенов атокси генными штаммами холерных вибрионов на основе модели синтеза О антигена, секретируемого при культивировании вирулентного штамма V. сhol erae М-41 Огава 21
9 9.4 Выделение О-антигенов и В-субъединицы холерного токсина 224
9.4.1 Выделение О-антигенов 224
9.4.2 Выделение В-субъединицы холерного токсина
9.5 Характеристики полученных протективных антигенов 229
9.6 Исследование свойств прототипной холерной химической вакцины.. 233 Заключение по главе 234
Заключение 236
Выводы 256
Список сокращений и условных обозначений 258
Список литературы .
- Очистка биологических аэрозолей в биотехнологических процессах
- Биологические методы
- Экспериментальная оценка возможности применения физического метода испытания системы очистки отходящих газов от биореактора на эффективность очистки от микроорганизмов
- Проверка итогов моделирования при выращивании производственных штаммов холерных вибрионов
Введение к работе
Актуальность исследований и состояние проблемы. Достигнутый на настоящее время уровень развития науки и техники диктует необходимость применения современных биотехнологических решений для промышленного выпуска иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП), к которым относятся и вакцины.
В Федеральной целевой программе «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы)» говорится об актуальности исследований по совершенствованию вакцинопрофилактики инфекционных болезней, вызываемых микроорганизмами I-II групп патогенности. Холера до сих пор вызывает крупные вспышки и эпидемии, как правило, в странах азиатского и африканского регионов. За десятилетний период (2003-2012 гг.) в мире зафиксировано 2269248 случаев заболевания холерой в более чем ста странах (Москвитина Э.А. и др.,2013).
На международном и национальном уровнях признано, что холера, наряду с рядом других особо опасных инфекций, способна вызывать чрезвычайные ситуации в здравоохранении (Международные медико-санитарные правила,2005; Онищенко Г.Г. и др.,2007,2011). Ярчайшим свидетельством этому является эпидемия холеры в 2010-2011 г.г. в Доминиканской Республике и Республике Гаити. Не исключена вероятность образования эпидемических очагов холеры за счет заноса ее из эндемичных территорий (Щуковская Т.Н. и др.,2009; Онищенко Г.Г. и др.,2011). Вспышка холеры, возникшая в 2011 году в Мариуполе, является этому подтверждением. На территории России почти каждый год выявляют заболевших холерой, прибывших из других стран.
В Российской Федерации вакцинацию против холеры, согласно национальному календарю профилактических прививок, осуществляют в соответствии с эпидемическими показаниями. Для специфической профилактики используют производимую ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» вакцину холерную бивалентную химическую, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, обладающую не меньшей эффективностью в сравнении с зарубежными вакцинами (Кутырев В.В. и др., 2006.; Щуковская Т.Н. и др.,2009). Данная вакцина разрешена к применению в 1991 г. и в промышленных количествах производится институтом «Микроб» с 1995 г. Оборудование и технология производства данного иммунобиологического препарата требовало коренной модернизации.
При производстве вакцинных препаратов определяющим биотехнологическим этапом является культивирование микроорганизмов. В производстве биологических препаратов все более широко используется управляемое глубинное культивирование микроорганизмов (Васильев Н.Н. и др.,1975; Кафаров В.В. и др.,1979; Перт, С.Дж.,1978; Бирюков В.В., 2004). Применение данного способа позволяет максимально увеличить количество целевых продуктов. При разработке стратегии управления часто прибегают к математическому моделированию данного процесса, которое позволяет оптимизировать процесс культивирования микроорганизмов (Озеренко О.А.,2004; Ни-жегородова Т.А.,2007; Казеев И.В.,2009; Zhang X.-C. et al.,1994; Kors D.J. et al.,1995; Tartakovsky B. et al.,1997; Venkat A.N. et al.,2003; Аkesson M. et al.,2001; Roeva O. et al.,2007). Существовавшие технические возможности оборудования, предназначенного для культивирования производственных штаммов холерных вибрионов и методические приемы проведения этого процесса не позволяли в полной мере реализовать управление процедурой выращивания Vibrio cholerae.
Одной из важнейших задач производства вакцинных препаратов, в особенности при работе с микроорганизмами I-II групп патогенности, является обеспечение биологической безопасности персонала и окружающей среды. В процессе аэробного глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторе неизбежно образуется аэрозоль, содержащий выращиваемые микроорганизмы. В производственном процессе получения холерной химической таблетированной вакцины, на
технологическом этапе культивирования V. cholerae, применяются вирулентные штаммы. Это обуславливает ужесточение мер биологической безопасности. Используемая для очистки от микроорганизмов, находящихся в газовой смеси отводимой от биореактора, система, предусматривающая прохождение газов через лизол, при снижении его концентрации может оказаться неэффективной. Кроме того, применение лизола запрещено Всемирной организацией здравоохранения. К тому же, оценить эффективность функционирования системы очистки инструментальными способами невозможно.
Для очистки воздуха выводимого из биореактора используют разнообразные инженерные технические решения, в том числе, удаление микроорганизмов из воздуха фильтрацией (Валашек Е.Р.,1988; Дроздов С.Г. и др.,1987; Редикульцев Ю.В. и др.,1995; Фролов А.И. и др.,1999; Владим-цева И.В. и др.,2007; Володин А.М.,2007; Самыгин В.М. и др.,2008,2009; Ульянов А.Ю. и др.,2011; Chatigny M.A. et al.,1970; Chisti Y.,1998). Проверку эффективности технических устройств очистки газов от микроорганизмов осуществляют различными методами (Криницын Л.А. и др.,1999; Басманов П.И. и др.,2003; ГОСТ Р ИСО 14644-3-2007; Чупалов B.C.,2007; Алексеев С.М. и др.,2008; Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08, 2008; Методические указания МУ 1.3.2411-08, 2009; Смирнов Г.Г. и др., 2011; Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.3118-13,2013; Ененко А.А.,2014; Костюкова Т.А. и др.,2014; Кравченко О.В. и др.,2014; Elsworth R. et al.,1955; Kastelein J. et al.,1992; Kousaka Y. et al.,1990; Benezech T.,2001). Разнообразие инженерных технических подходов к очистке газов от микроорганизмов, методов проверки эффективности реализованных технических решений вызывает потребность их критического обсуждения и, исходя из его итогов, выполнения экспериментальных работ по конструированию высокоэффективной, современной и надежной системы обеззараживания отводимого из биореактора аэрозоля микроорганизмов и разработки методических приемов контроля эффективности ее функционирования.
В конце ХХ века были выполнены исследования по ультрафильтрационному концентрированию О-антигена на половолоконных колонках (Громова О.В. и др.,1999). Это дало возможность внедрить данный метод в производственный процесс выделения О-антигена штамма V. cholerae М-41 серовара Огава (Дятлов И.А. и др.,2001; Нижегородцев С.А.,2003). Вместе с тем, внедренные технологические решения, наряду с положительными моментами (в первую очередь, существенная экономия сульфата аммония, затрачиваемого на осаждение) обладали недостатками, присущими тупиковым процессам фильтрации: большие потери выделяемого продукта, небольшая удельная скорость процесса.
Выделение двух других иммуногенов вакцины – О-антигена Инаба и холерогена-анатоксина производят последовательным двукратным осаждением сернокислым аммонием из всего объема детоксицированной культуральной среды, освобожденной от микробных клеток штамма V. chol-erae 569В серовара Инаба (от 200 до 400 дм3 за один технологический цикл). Это влечет за собой существенное расходование осадителя. Технологический процесс выделения холерогена-анатоксина является затратным и многоступенчатым. Необходимо подчеркнуть, что при данном способе выделения холероген-анатоксина отходом производства является от 180 до 360 дм3 80 % раствора сернокислого аммония, удаляемого в очистную систему производства. Большим потенциалом для ликвидации указанных недостатков технологии обладает применение микро- и ультрафильтрации для разделения выделяемых веществ (Козлов В.Е. и др.,1998; Агафонов А.П. и др.,1995; Михайлова Н.А. и др., 1995; Шевырев Н.С. и др.,1995; Микшис Н.И. и др.,2013; Лебедев Н.В.,2013; Матвеева Ж.В.,2013).
Также существующая технология предусматривает удаление сульфата аммония из растворов протективных антигенов V. cholerae диализом против водопроводной воды в мешках из целлофа-
на. Процесс протекает в неконтролируемых условиях, кроме того существует возможность попадания в обессоливаемые антигены нежелательных примесей.
Стерилизация термолабильных веществ, в том числе холерогена-анатоксина в производстве ИЛП осуществляется мембранной микрофильтрацией. Существующие технологические приемы данного процесса в производстве холерной химической вакцины характеризуются низкой эффективностью из-за больших потерь холерогена-анатоксина. Устранить этот недостаток представляется возможным за счет снижения числа технологических процедур стерилизующей фильтрации. Это достигается, в свою очередь, за счет роста пропускной способности устройств стерилизующей фильтрации, применяя повышение температуры стерилизуемого препарата, освобождение фильтруемого раствора от крупных частиц «грубой» фильтрацией или центробежными методами, уменьшением «мертвого» объема микрофильтрационного оборудования при увеличении площади фильтрации (Черкасов А.Н., Пасечник В.А.,1991; Комиссаров А.В. и др.,2002; Попова В.М.,2011).
При сублимации протективных антигенов – компонентов холерной химической вакцины происходит, в ряде случаев, ухудшение их характеристик. Это может быть вызвано тем, что указанный процесс осуществляется без учета физических характеристик антигенов как объекта сушки. Исследования по научному обоснованию температурно-временных режимов лиофилизации имму-ногенов холерной химической вакцины отсутствуют.
Биофармацевтическая композиция холерной вакцины является смесью сублимационно высушенных холерогена-анатоксина V. cholerae 569В серовара Инаба, О-антигена V. cholerae 569В серовара Инаба, О-антигена V. cholerae М-41 классического биовара серовара Огава и вспомогательных веществ. Реализованный в технологии производства вакцины способ получения таблетки прямым прессованием характеризуется существенными потерями (до 1/3) смеси, подвергаемой таблетированию. Данное обстоятельство является следствием различий в плотности основных и вспомогательных ингредиентов. Предварительное гранулирование таблеточной смеси предоставляет возможность достижения ее однородности (Хишова О.М.,2006; Палечкин А.В.,2009). Верный подбор вспомогательных веществ и их количества, наряду с величинами параметров технологического процесса, определяет эффективность гранулирования.
Для покрытия таблетки вакцины кишечнорастворимой оболочкой применяют целлацефат в виде 5 % раствора в ацетоне. Работа с органическими растворителями неизбежно сопровождается такими опасностями, как возможность взрыва и загрязнение окружающей среды. Кроме того, они, как правило, а ацетон, без сомнения (ГОСТ 2768-84), являются токсичными. Использование плёночных покрытий на водной основе позволяет создать более безопасные условия работы без снижения качества готовых лекарственных форм препаратов (Baudoux M. et al.,1990; Chang R.K.,1990; Bianchini R. et al.,1991; Bushra R. et al.,2010).
Таким образом, производство холерной таблетированной вакцины до начала наших исследований базировалось на методических, инженерных и технологических подходах, относящихся к концу двадцатого столетия. Используемые биотехнологические и технические решения производства вакцины не в полной мере соответствовали условиям, предъявляемым в настоящее время к биотехнологическим аспектам производства ИЛП. Основываясь на этом, разработка комплекса научно обоснованных технологических и технических решений производства данной вакцины чрезвычайна важна как в научном, так и в практическом плане. Решение данной проблемы имеет важное хозяйственное значение для обеспечения России иммунобиологическим лекарственным препаратом, включенным в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям.
Использование вирулентных штаммов при промышленном производстве вакцины увеличивает вероятность инфицирования персонала в случае возникновения аварийных ситуаций. Учеными
института «Микроб» созданы штаммы-продуценты О1 антигенов V. cholerae КМ 262 биовара Эль Тор серовара Огава (Стрельникова-Ааб Е.Н. и др.,2011) и V. cholerae КМ 263 биовара Эль Тор се-ровара Инаба (Ливанова Л.Ф. и др.,2011), в которых отсутствует ctxA ген, кодирующий синтез токсичной А-субъединицы холерного токсина. Получить О139 антиген представляется возможным при применении штамма V. cholerae M 377 О139 серогруппы, у которого также отсутствует ctxA ген. Данные штаммы V. cholerae целесообразно использовать для создания новой холерной химической вакцины. Для обеспечения антитоксического иммунитета необходимо включение в ее состав В-субъединицы холерного токсина, продуцируемой рекомбинантным штаммом V. cholerae non O1 КМ93 (Ильина Т.С. и др.,1991; Смирнова Н.И. и др.,2007). Отсутствие технологии культивирования атоксигенных штаммов холерных вибрионов – продуцентов О-антигенов определяет необходимость проведения исследований по ее созданию.
Если технологические аспекты масштабного культивирования штамма V. cholerae non O1 КМ93 продуцента B-субъединицы холерного токсина в достаточной степени отработаны, то существующие подходы к выделению B-субъединицы разрабатывались для получения в условиях лаборатории и вряд ли применимы к производственному ее получению (Захарова Т.Л. и др.,2003; Захарова Т.Л. и др.,2012.).
Исходя из вышеизложенного были определены цель и основные задачи диссертационной работы.
Цель и задачи исследования.
Цель работы разработка комплекса современных биотехнологических решений производства холерной химической таблетированной вакцины.
Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. Разработать экспериментально-производственную технологию получения холерной
химической вакцины с использованием атоксигенных штаммов V. cholerae.
2. Обосновать и сконструировать универсальную систему очистки от микроорганизмов
отходящих из биореактора газов и провести ее промышленную апробацию в процессе
производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной.
-
Дать экспериментальную оценку возможности применения физического метода контроля системы очистки отходящих газов от биореактора на эффективность очистки от микроорганизмов.
-
Разработать математические модели периодического процесса культивирования вакцинных штаммов холерного вибриона на модели V. сholerae М-41 серовара Огава и V. cholerae 569В серовара Инаба с лимитацией по углеродному субстрату и апробировать результаты моделирования при производственном культивировании холерных вибрионов – продуцентов протективных антигенов.
-
Разработать технологии концентрирования, выделения и очистки антигенных компонентов профилактических препаратов против особо опасных инфекционных заболеваний на примере вакцины холерной бивалентной химической таблетированной методом ультрафильтрации.
6. Экспериментально обосновать процедуру стерилизации термолабильных антигенных
компонентов профилактических препаратов на примере холерогена-анатоксина, позволяющую
увеличить выход целевого продукта и снизить продолжительность процесса.
7. Разработать биотехнологический процесс лиофилизации протективных компонентов вакцин
против особо опасных инфекций на примере иммуногенов вакцины холерной бивалентной
химической таблетированной.
8. Создать технологический участок и разработать технологии гранулирования ингредиентов таблетированных препаратов для профилактики особо опасных инфекционных заболеваний на модели холерной химической вакцины, а также прессования таблетки и нанесения кишечнорастворимого покрытия на готовую лекарственную форму.
Научная новизна. Разработана оригинальная биотехнологическая система каскадной фильтрации отходящих от биореактора газов, позволяющая безопасно и контролируемо проводить процесс биосинтеза протективных антигенов холерной химической вакцины. Предложена нестандартная методика оценки эффективности системы фильтрации отходящих технологических газов.
Разработана и решена неординарная математическая модель периодического культивирования холерных вибрионов, адекватно отражающая кинетику продукции антигенов. Проведение исследований позволило конкретизировать входящие параметры в действующие решения системы дифференциальных уравнений. Итоги моделирования дали возможность создать нетрадиционный алгоритм автоматической подачи в среду выращивания главного энергетического источника (глюкозы) для размножения микроба холеры в процессе культивировании штаммов V. cholerae М-41 серовара Огава и V. cholerae 569В серовара Инаба. Проведенные исследования реализованы программами для ЭВМ «Программа для расчета концентрации и скорости роста микроорганизмов и продуктов их биосинтеза в зависимости от концентрации субстрата» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2012614773) и «Программа для расчета кинетики выделения двух продуктов биосинтеза, образующихся в процессе глубинного культивирования микроорганизмов» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2013617558).
Разработана новая методика получения протективных компонентов холерной вакцины на основе метода ультрафильтрации. Создана оригинальная технология концентрирования О-антигена и хо-лерогена-анатоксина штамма V. cholerae 569В серовара Инаба тангенциальной ультрафильтрацией; научно обоснована целесообразность концентрирования протективных антигенов на мембранах с НОММ 50 кДа. Изучение белкового и полисахаридного состава сублимационно высушенных протективных антигенов штамма холерного вибриона 569В серовара Инаба, проведенное сопоставление иммунохимических, физико- и биохимических характеристик регламентного и экспериментального препаратов выявило их тождественность. Технология концентрирования протек-тивных антигенов используется при производстве вакцины, получен патент РФ № 2451522 от 27.05.2012 «Способ концентрирования нативных холерогена-анатоксина и О-антигена Vibrio cholerae О1 классического биовара штамма 569В серовара Инаба».
Усовершенствовано ультрафильтрационное концентрирование О-антигена V. cholerae. Показана предпочтительность применения тангенциальной ультрафильтрации на плоскорамных модулях. Выявлена эффективность концентрирования О-антигена холерного вибриона на мембранах с НОММ 500 кДа. В результате изучения физико-химических и иммунохимических свойств О-антигена, приготовленного усовершенствованным и регламентным способами, показано сходство их характеристик. Технология концентрирования О-антигена используется при производстве вакцины, получен патент на изобретение РФ № 2445116 от 20.03.2012 «Способ концентрирования на-тивного холерного O-антигена Vibrio cholerae».
Впервые разработана технология ультрафильтрационного фракционирования холерогена-анатоксина штамма V. cholerae 569В серовара Инаба на плоскорамных модулях, обеспечивающая увеличение выхода препарата на 25 %, сокращение времени технологических процедур на 60 ч. Данная технология используется при производстве вакцины, получен патент на изобретение РФ № 2535122 от 10.12.2014 «Способ получения холерогена-анатоксина».
Опытным путем обоснована ультрафильтрационная технология удаления сернокислого аммония из растворов протективных антигенов холерного вибриона. Показана возможность применения тангенциальной диа-ультрафильтрации в периодическом режиме на плоскорамных модулях.
Для ультрафильтрационных процессов определены оптимальные величины тепловых и барометрических параметров ультрафильтрационных процессов: температура фильтруемой жидкости – 37 оС; давление, создаваемое фильтрационной машиной на входе и выходе фильтруемого продукта – 2,5 бар и 0,5 бар соответственно.
На модели холерогена-анатоксина разработана оригинальная процедура стерилизации термолабильных антигенных компонентов профилактических препаратов, заключающаяся в отделении балластных примесей из раствора холерогена-анатоксина перед его стерилизующей фильтрацией проточной микрофильтрацией на плоскорамных фильтрующих элементах с порогом отсечки, равным 0,45 микрона и проведении технологического процесса при температуре 37 оС. Производственное применение экспериментально обоснованной процедуры дало увеличение выхода холе-рогена-анатоксина на 60 % и позволило снизить продолжительность процесса в 3,5-4 раза.
На основе экспериментально определенных тепловых характеристиках растворов иммуногенов холерной химической вакцины разработаны оригинальные температурно-временные параметры сублимации. Показано, что применение процедуры отжига позволяет достичь полного отвердевания холерогена-анатоксина, а проведение процесса первичной лиофилизации по величине электрического сопротивления иммуногенов вакцины позволяет поддерживать оптимальную температуру продукта.
Впервые изучены технологические свойства сублимированных протективных антигенов штаммов V. cholerae 569В серовара Инаба и V. cholerae М-41 серовара Огава. Выявлено, что величины изученных показателей характеризуются значениями, требующими агломерации иммуногенов. Для получения твердой лекарственной формы холерной химической вакцины экспериментально доказана преимущественность использования предварительного гранулирования таблеточной смеси в псевдоожиженном слое с новым качественным и количественным составом вспомогательных компонентов: лиофилизаты иммуногенов вакцины в количестве от 6 до 19 масс. %; целлюлозы микрокристаллической и лактозы моногидрата – от 44,3 до 36,3 масс. % каждого компонента. Установлены оптимальные технологические характеристики проведения процесса: давление воздуха в форсунке распыления связывающего вещества – 1,2 бар; расход повидона – 25,0 см3/мин; количество воздуха для создания «кипящего» слоя – 90 м3/ч; температура и масса гранулируемых компонентов – 25 оС и 2,2 кг соответственно.
Впервые для иммунобиологических лекарственных препаратов определены оптимальные условия прессования таблеточной смеси, способствующие гарантированной доставке иммуногенов в кишечник пациента и обеспечивающие качественное проведение процесса нанесения на таблетки кишечнорастворимого покрытия. Доказана необходимость прессования при давлении от 8 до 12 кН.
Экспериментально доказана предпочтительность применения водных систем пленочного покрытия на таблетку вакцины. Впервые для иммунобиологических лекарственных препаратов разработана технология нанесения кишечнорастворимого покрытия на таблетку в аппаратах барабанного типа (коутерах) при следующих оптимальных параметрах процесса: давление воздуха в форсунке для атомизации и распыления раствора покрытия – 1,4 и 1,0 бар; количество распыляемого раствора Acryl-EZE – 8,3±0,1 см3/мин; скорость вращения барабана – 11±1 об/мин; температура и количество воздуха для сушки таблеток – 40-45 оС и 50-55 м3/ч. Технологии гранулирования и нанесения покрытия апробированы в условиях производства, получен патент на изобретение РФ
№ 2563620 от 25.08.2015 «Способ получения таблетированной формы холерной бивалентной химической вакцины».
Впервые разработана опытно-промышленная технология процесса культивирования авирулент-ных штаммов V. cholerae КМ 262 биовара Эль Тор серовара Огава, V. cholerae КМ 263 биовара Эль Тор серовара Инаба и V. cholerae M 377 О139 серогруппы, дающая возможность производить О-антигены в производственных масштабах.
Экспериментально обоснован оригинальный способ производственного получения В-субъединицы холерного токсина. Показано, что применение метода тангенциальной микро- и ультрафильтрации на этапах ее очистки и концентрирования делает процесс более технологичным за счет исключения трудоемких операций хроматографической очистки.
Теоретическая и практическая значимость. Диссертация имеет ярко выраженную практическую направленность и посвящена совершенствованию существующего производства ИЛП для специфической профилактики холеры. В результате внедрения в производство научно обоснованных инновационных технических и технологических решений решена проблема обеспечения Российской Федерации отечественным ИЛП, использование которого для специфической профилактики холеры предусмотрено национальным календарем профилактических прививок по эпидемическим показаниям. Введенные производственные мощности позволяют полностью удовлетворить потребности Российской Федерации в данном профилактическом препарате.
В рамках выполнения распоряжения Правительства Российской Федерации № 1426-р от 02.10.2009 г. модернизирована аппаратурно-технологическая линия производства вакцины холерной бивалентной химической, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, обеспечивающая выпуск доступного для широкого применения единственного отечественного препарата для специфической профилактики холеры. Для промышленного производства вакцины разработан и утвержден регламент производства ПР № 01898109-39-12 «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой».
По разработанным техническим и технологическим решениям, в соответствии с Государствен
ным заданием, выпущено 3 производственные серии вакцины холерной бивалентной химической,
таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, прошедшие независимую процедуру обяза
тельной сертификации. На каждую серию вакцины выданы сертификаты соответствия, дающие
право применять препараты в здравоохранении. Получены 3 экспериментально-
производственные серии вакцины с новым биофармацевтическим составом.
По результатам проведения исследований по гранулированию компонентов вакцины разработаны изменения в фармакопейную статью предприятия (ФСП) Р N001465/01-220708 «Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой», которые проходят экспертизу в Министерстве здравоохранения Российской Федерации.
Проведенные исследования явились научной базой для разработки методических рекомендаций:
«Концентрирование протективных антигенов холерного вибриона методом тангенциальной фильтрации», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 18 марта
2011 г.) и утверждённые директором института 11 июня 2011 г.;
«Аппаратное культивирование атоксигенных штаммов холерного вибриона - продуцентов О-антигенов», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 8 от 26 декабря
2012 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 27 декабря 2012 г.;
«Способ масштабированного получения холерного токсина и рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (Протокол № 8 от 19 июня 2013 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 20 июня 2013 г.;
«Масштабируемая технология стерилизующей фильтрации антигенных компонентов и готового препарата прототипной химической вакцины», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (Протокол № 8 от 19 июня 2013 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 20 июня 2013 г.;
«Фракционирование холерогена-анатоксина холерного вибриона методом тангенциальной ультрафильтрации», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 3 от 20 мая 2014 г.) и утверждённые директором института 21 мая 2014 г.
«Лиофилизация протективных антигенов холерных вибрионов», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 1 от 26 февраля 2016 г.) и утверждённые директором института 26 февраля 2016 г.
Для производства вакцины из атоксигенных штаммов холерных вибрионов разработаны проекты следующей нормативной документации, одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 7 от 11 декабря 2012 г.):
регламент производства «Вакцина холерная химическая, таблетки, покрытые кишечнораство-римой оболочкой»;
фармакопейная статья предприятия «Вакцина холерная химическая, таблетки, покрытые ки-шечнорастворимой оболочкой»;
инструкция по применению вакцины холерной химической, таблетки, покрытые кишечнорас-творимой оболочкой.
Теоретическая значимость исследования обоснована тем, что:
на основе анализе сведений научной литературы и нормативных документов, касающихся аппаратурного оформления процессов очистки биологических аэрозолей и способов контроля защитной эффективности этих систем научно обоснованы и доказаны критерии для создания системы очистки и выявлена применимость физических методов контроля ее работы;
получены результаты, позволяющие получить частное решение дифференциальных уравнений, описывающих кинетику синтеза протективных антигенов, и уточнить входящие параметры и величины в существующие решения указанных уравнений;
научно-обоснованы и доказаны оптимальные параметры процессов гранулирования компонентов таблеточной смеси холерной химической вакцины и нанесения покрытия на ее готовую лекарственную форму;
изучены закономерности процесса периодического культивирования холерных вибрионов с лимитацией по углеродному субстрату.
Материалы диссертации используются при проведении занятий с аспирантами, обучающимися по научной специальности 03.01.06 «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)» в Саратовском государственном аграрном университете имени Н.И. Вавилова.
Методология и методы исследования. Предметом исследования служила технология
производства холерной химической вакцины. Объектом исследования являлись
биотехнологические процессы производства вакцины: культивирование холерных вибрионов, выделение протективных антигенов и их стерилизация, сублимационная сушка иммуногенов вакцины, процессы гранулирования компонентов таблеточной смеси, их прессования и нанесения покрытия на таблетку. Теоретической базой диссертационной работы послужили публикации
отечественных и зарубежных исследователей, а также материалы нормативно-технической документации по вопросам, раскрываемым в данном исследовании. Положения, выносимые на защиту.
-
Сконструированная система очистки от микроорганизмов, отходящих из биореактора газов, базирующая на удалении холерных вибрионов фильтрацией, гарантирует биологическую безопасность персонала и среды обитания при проведении процесса культивирования вирулентных штаммов возбудителя холеры.
-
Применение способа контроля системы очистки от микроорганизмов, отходящих из биореактора газов, на защитную эффективность по значениям количества частиц аэрозоля диэтилгексил-себационата до и после фильтрующих элементов позволяет сократить процедуру ее проверки с 2-3 дней до 2-3 часов.
-
Математическое моделирование периодического культивирования штамма V. cholerae М-41 серовара Огава и штамма V. cholerae 569В серовара Инаба позволило разработать управление процессом выращивания микроорганизмов с лимитацией по углеродному субстрату.
-
Фильтрационные технологии концентрирования, выделения, очистки и стерилизации антигенных компонентов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной дают возможность получать кондиционные протективные антигены при минимизации их потерь.
-
Применение процедуры «отжига» холерогена-анатоксина, заключающейся в нагреве замороженного до минус 55 оС препарата до минус 20 оС, выдержки при ней в течение часа с последующим охлаждением до минус 55 оС и одновременным началом процесс сублимации, позволяет достичь полного отвердевания холерогена-анатоксина.
-
Гранулирование ингредиентов холерной химической вакцины в псевдоожиженном слое с новым биофармацевтическим составом уменьшают потери при прессовании таблеток в 10 раз.
-
Выявленные диапазоны давления прессования (от 8 до 12 кН) таблеток холерной вакцины обеспечивают нормируемое время растворения таблетки в тесте «распадаемость».
-
Экспериментально обоснованная технология нанесения водных систем кишечнорастворимо-го покрытия на таблетку в машинах барабанного типа улучшает условия труда работников и уменьшает экологическую нагрузку на среду обитания.
9. Разработанная экспериментально-производственная технология производства холерной хи
мической вакцины с использованием атоксигенных штаммов V. cholerae позволяет получать про-
тективные антигены в препаративных количествах.
Степень достоверности результатов работы основывается на значительном объеме полученных экспериментальных данных, их соответствии теоретическим положениям, статистической обработке данных экспериментов, а также выполнением работы на сертифицированном и метрологически поверенном оборудовании. Выводы из проведенных исследований теоретически и экспериментально обоснованы и отражают цель и задачи диссертации.
Апробация результатов. Результаты экспериментов докладывались на ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2009-2015) и были представлены на научных конференциях различного уровня: «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2010, 2011, 2012), «Вавиловские чтения-2010» (Саратов, 2010), «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010), «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (Нижний Новгород, 2011, 2014), «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011), «Математическое и компьютерное моделирование в биологии и химии. Перспективы развития» (Казань, 2012); «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации
в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Саратов, 2012), «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2013, 2014); «Биотехнология: реальность и перспективы» (Саратов, 2013, 2014), «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины» (Ставрополь, 2014), а также на совещаниях специалистов Роспотребнадзора «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2010, 2011, 2013, 2014), международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011).
Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы и задач исследования, прямом участии в отыскании действенных решений сформулированных задач, в реализации экспериментов и обработке полученных опытных данных, подготовке научных публикаций, программ для ЭВМ и патентов на изобретение, разработке нормативной документации. Отдельные экспериментальные исследования выполнены совместно с к.б.н. Ливановой Л.Ф., к.м.н. Беляковой Н.И., к.м.н. Громовой О.В., к.м.н. Клоковой О.Д., к.б.н. Лобовиковой О.А., к.м.н. Шульгиной И.В, к.б.н. Волох О.А., к.б.н. Ульяновым А.Ю., к.б.н. Алешиной Ю.А., к.б.н. Васиным Ю.Г., к.т.н. Морозовым К.М., к.т.н Задохиным С.Н., к.т.н. Перепелицой А.И., за что автор выносит им огромную благодарность.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательских тем 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923), 48-2-14 «Разработка и внедрение в производство МИБП новых решений, направленных на повышение качества препаратов и эффективности технологических процессов» (номер госрегистрации: 01201457722) и «Разработка современных безопасных химических вакцин против холеры и создание универсальной технологии их производства», выполненной согласно распоряжению Правительства Российской Федерации № 1426-р от 02.10.2009 г. о выделении финансовых средств на проведение научно-исследовательских работ, направленных на разработку новых средств диагностики и профилактики тропических болезней.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 65 работ, из них 20 статей в журналах из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», 3 статьи в других журналах, 36 публикаций в сборниках и материалах конференций. Получено 4 патента на изобретения, 2 свидетельства о государственной регистрации программы для ЭВМ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих в себя материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка используемых литературных источников, включающего 459 наименований и приложений. Работа изложена на 328 страницах и иллюстрирована 62 рисунками, 85 таблицами.
Очистка биологических аэрозолей в биотехнологических процессах
Коллективом экспериментаторов исследовано влияние продолжительности культивирования и качества инокулята на характеристики V. cholerae 569В Инаба, полученных в результате глубинного аппаратного выращивания. Наибольшее содержание антигенов было при достижении холерными вибрионами стационарной стадии размножения. Увеличение времени процесса не давало повышения количества клеток V. cholerae и содержания О-антигена, при этом концентрация токсина становилась меньше. Также, выявлена целесообразность поддержания оптимальных значений рН и температуры. Это позволяет активизировать секрецию антигенов [89].
Проведенные исследования по воздействию разных значений температур и аэрации на синтез токсина с использованием пяти штаммов холерных вибрионов дали следующие результаты. Выделение токсина присутствовало при температурах от 29 до 37 оС, наибольшая продукция выявлена при 33 оС. Повышение уровня подачи воздуха в культуральную среду дает увеличение выхода токсина [100].
Лавровской В.М. с соавт. экспериментально обоснована технология глубинного аппаратного выращивания клеток V. cholerae с введением в ходе процесса раствора аммиака для установки требуемого рН. Кроме того, исследовано воздействие разных уровней аэрирования микробной культуры на выход биомассы и антигенов. Повышенный уровень аэрирования дал увеличение интенсивности размножения клеток V. cholerae, а также секреции токсина и О-антигена. Кроме того, выявлена целесообразность окончания выращивания холерных вибрионов после 9-10 ч от начала процесса, так как далее происходит уменьшение количества антигенов [96].
Швейцарские ученые разработали процесс производства токсина при выращивании штамма холерного вибриона 569 Инаба в культиваторе емкостью 10 дм3. Экспериментально обоснованы технологические характеристики культивирования: количество инокулята - десять миллионов холерных вибрионов; число оборотов перемешивающего устройства - 550 rpm; аэрирование воздухом в количестве 1,0 хмин; температура культуральной жидкости - 30 оС; продолжительность дм3 среды культивирования - 17 ч [323]. Jang Н. et al. выявлено, что повышение выхода токсина при культивировании штамма холерного вибриона 569 Инаба достигается установлением температуры процесса 32 оC, а также корректированием значения рН 7,8 за счет введения 10% растворов аммиака или соляной кислоты. Уменьшение, а также повышение температуры культуральной среды снижает уровень секреции токсина. Наибольший выход антигена происходит при 35 % содержании кислорода в среде выращивания. Продолжительность выращивания определена не более 12 ч [343].
Исследователями установлены оптимальные температура процесса культивирования штамма холерного вибриона КМ 234 О1 серогруппы в среде из гидролизата казеина и его продолжительность, при которых наблюдается максимальный выход токсина. Эти величины составили соответственно 30 оС и 8 ч [42-44].
Navratil M. et al. реализованы прогностические модели синтеза холерного токсина при культивировании холерного вибриона. Данные модели позволили корректировать скорость размножения клеток V. cholerae, выделение токсина управлением расхода глюкозы при ее введении в культуральную среду [391].
Значительное количество ученых придерживаются мнения, что наибольшая продукция антигенов, секретируемых холерными вибрионами при периодическом глубинном выращивании, наблюдается при смене бактериями логарифмической стадии размножения на стационарную [398,399,454].
Есть данные о разработке технологии выращивания клеток V. cholerae с добавлением глюкозы в ходе проведения процесса. Авторами выявлена желательность ее подачи в среду выращивания при достижении холерными вибрионами логарифмической стадии размножения [269,384].
Между тем, некоторыми исследованиями выявлено, что чрезмерное введение глюкозы при осуществлении глубинного выращивания клеток V. cholerae дает критическое уменьшение рН культуральной среды, и как следствие этого, снижение скорости размножения холерных вибрионов и выделения антигенов [384,424,427].
Сотрудниками института «Микроб» исследована возможность получения антигенов рядом штаммов холерного вибриона: 2415 О1 серогруппы – для получения соматического антигена, токсина I типа и пилей адгезии; КМ 93 не О1/не О139 серо-группы – В-субъединицы холерного токсина; КМ 234 О1 серогруппы – токсина II типа; КМ 137, КМ 138 и КМ 230 – соматического антигена О139. Температура процесса культивирования, который проходил в колбах на шюттель-аппарате, составляла 37 оС. У всех взятых для экспериментов микробных культур выявлен период их перехода в стационарную фазу размножения: 8 ч для КМ 93 и КМ 234; 9 ч для КМ 137, КМ 138 и КМ 230; 10 ч для 2415 и КМ 206. Продолжение процесса сверх этого срока приводило к лизису микробной популяции [61].
В продолжение этих исследований проведено периодическое культивирование аппаратным способом. Температура культуральной среды при выращивании V. cholerae КМ 137 и КМ 234 была 37 оС, для других 30 оС. Для штаммов КМ 206 и 2415 выявлена целесообразность поддержания рН культуральной жидкости в пределах 7,2-7,8, окончания процесса на 12 часов выращивания, так как увеличение этого периода приводило к лизису холерных вибрионов. Кроме того, авторы констатировали, что дополнительное введение глюкозы при протекании процесса увеличивает логарифмиче скую стадию размножения. Для штамма KM137 время окончания процесса культивирования составляло 11-12 ч от его начала. Периодическое введение раствора глюкозы при достижении холерными вибрионами логарифмической стадии размножения дало возможность повысить удельную скорость размножения, а также уменьшить период удвоения. Для культивирования штамма КМ 93 использован отъемно-доливной метод, который дал возможность получить большее количество холерных вибрионов и В-субъединицы холерного токсина. Выращивание холерного вибриона KM 234 выявило, что повышение уровня снабжения кислородом растущей культуры приводит к более глубокой утилизации питательных компонентов и, как следствие этого, к повышенному росту холерных вибрионов и секреции токсина [31].
Биологические методы
Изготовление таблеток из порошков предполагает получение их, как правило, двумя способами: прямым сжатием порошков, или сначала гранулирование таблеточной смеси, а затем прессование [39,203]. Для большинства сухих лекарственных субстанций присущи неудовлетворительные для таблетирования характеристики слабая текучесть и прессуемость; большое количество маленьких, а часто пылевидных частиц; слеживаемость при хранении; повышенная впитываемость влаги [136]. Улучшить эти показатели возможно добавлением ряда вспомогательных ингредиентов и гранулированием [40].
Жуйкова Н.Н., ссылаясь на исследования York P., приводит следующий факт 41,5 % производителей таблетированных лекарственных форм используют прямое прессование и 47,2 % применяют предварительное гранулирование, с последующим таблетированием [60]. Без сомнения, получение таблеток прямым прессованием обладает рядом достоинств, к которым, в первую очередь, относится снижение времени производства, а также уменьшение капитальных, трудовых и энергетических затрат. Данные преимущества возникают за счет меньшего количества технологических этапов, а соответственно, и оборудования [39,60,76,77,203]. Для хорошей прессуемости активные фармацевтические ингредиенты должны иметь кристаллическую структуру и компактный размер частиц, при этом аморфные или игольчатые порошки, как правило, таблетируются плохо [36].
В научной литературе имеются примеры удачного использования прямого прессования при получении таблеток. В частности, изготовление таблеток рибофлавина возможно при добавлении к активной лекарственной субстанции равных количеств порошков целлацефата и микрокристаллической целлюлозы [328,329]. При применении в качестве наполнителей натрий гликолят крахмала, микрокристаллической целлюлозы, диоксида кремния, лактозы моногидрата, лактозы в комбинации с Коллидон 25 и Коллидон CL (лудипресс) и магния стеарата обосновано получение таблеток ра-миприла [53]. Таблетки бисакодила были получены при следующем составе вспомогательных веществ: лудипресс, аэросил и кальция стеарат [57]. Включение в состав таблеточной смеси тропоксина лудипресса дало возможность получения качественных таблеток [72].
Однако, по мнению Георгиевского В.П., метод прямого прессования в изготовлении таблетированных форм препаратов может использоваться для небольшого количества лекарственных веществ [39]. Аналогичного взгляда придерживается Жуйкова Н.Н. [60]. Данной точке зрения имеются ряд подтверждений.
Стоянов Э.В. с соавт. в статье, посвященной разработке технологии прямого прессования таблеток метформина пролонгированного действия, резюмируют «во многих случаях, когда активные ингредиенты лекарственных средств обладают низкой текучестью или плохо поддаются прессованию, метод прямого прессования не годится» [231].
В частности, внесение вспомогательных веществ в лекарственные субстанции для получения таблеток эстифана, амиронина и галавита методом прямого прессования не дало требуемого результата. В связи с этим, было применено предварительное гранулирование таблеточной смеси [15,77]. Применение гранулирования биофармацевтической композиции нитроглицерина перед ее таблетированием дало возможность повысить твердость и прочность, а также избавиться от существенных разбросов по массе таблетки и количеству в ней лекарственного компонента [34,157,162]. Исследование применимости прямого прессования, с использованием ряда вспомогательных компонентов, при производстве таблеток «Мелифлос» не дало положительных результатов: таблетируемая смесь прилипала к пуансонам пресс-машины, таблетки не проходили испытания на распадаемость. Применение гранулирования позволило устранить эти недостатки [263,264]. Использование прямого прессования при изготовлении таблеток «Леоком», коришпана и коралгина приводило к пониженной твердости, истираемости и несоответствию нормируемых характеристик по распадаемости, что было устранено гранулированием [101,256].
Ряд исследователей, основываясь только на результатах контроля технологических показателей лекарственных субстанций, определяют целесообразность предварительного гранулирования перед прессованием таблеток. Такие выводы были сделаны при отработке технологии получения таблеток глигисцина [104,206], рутана и прови-дина [73,74].
Среди имеющихся видов гранулирования можно выделить три основных способа: гранулирование в псевдоожиженном, иногда называют «кипящем», слое; сухое и влажное (продавливанием) гранулирование [39,203]. Сухое гранулирование используют обычно в тех случаях, если активная фармацевтическая субстанция теряет свои специфические свойства при контакте с водой. В основу этого положено выполнение ряда последовательных операций: смешивание порошков компонентов, смачивание связующими веществами, сушка полученной субстанции, ее предварительное прессование, получение гранул продавливанием через листы с определенными диаметрами отверстий и таблетирование на пресс-машинах [39,203]. Имеются примеры успешного, и неуспешного использования данного способа для изготовления лекарственных препаратов. Его использование позволило повысить сыпучесть лекарственной субстанции парацетомола, что дало возможность производить таблетки хорошей прочности [344]. Однако, Shlieout et al. указывали на то, что использование сырья обладающего недостаточной сыпучестью влечет за собой разнородность гранул и существенное содержание в материале комков [434]. Hadzovic E. выявил преимущественность изготовления таблеток теофиллина прямым прессованием в сравнении с применением предварительного сухого гранулирования, так как препараты обладали плохой растворимостью [331].
Исследователями установлена невозможность изготовления гранулятов порошков без специальных добавок, при этом существует потребность их правильного выбора [356,357]. В частности, применение углекислого магния в разных пропорциях не дало требуемого результата, а использование 5 % микрокристаллической целлюлозы дает возможность приготовить гранулы, пригодные для производства таблеток, соответствующих показателям Европейской Фармакопеи [356]. Приготовление гранул три-азавинина с применением лактозы усилило ломкость спрессованной субстанции и дало при размоле увеличение фракции в виде пыли, использовании микрокристаллической целлюлозы привело к значительному повышению прочности спрессованной субстанции и увеличению при размоле числа мелких гранул. Ввиду этого признано нецелесообразным применение сухого гранулирования [261,262].
Сухое гранулирование, по мнению авторов [194,332,394], реализуемо не при всех величинах насыпной плотности активных и вспомогательных компонентов, кроме того необходима достаточная текучесть их композиции. Использование карбокси-полиметилена для связывания компонентов лекарственных субстанций теофилина и кетопрофена дало возможность производить гранулы, подходящие для насыпания в капсулы [375].
Изготовление таблетированных лекарственных форм с применением влажного гранулирования предполагает проведение ряда технологических процедур: смешивание лекарственных компонентов и вспомогательных веществ, увлажнение, получение гранул продавливанием через поверхность с отверстиями, сушка и непосредственно таблетирование. Зуев А.П. с соавт. в качестве аргумента нецелесообразности его применения приводили следующие недостатки таблеток, изготовленных с использованием влажного гранулирования: низкая прочность и порозность, что приводит к трудно
Экспериментальная оценка возможности применения физического метода испытания системы очистки отходящих газов от биореактора на эффективность очистки от микроорганизмов
Обращает внимание небольшое значение показателя NП . Эти значения могут привести к большой случайной составляющей погрешности, из-за статистической природы попадания частиц DEHS в измерительный прибор. При возникновении такой ситуации ГОСТ Р ИСО 14644-1 [259] предлагает прибегать к процедуре последовательного пробоотбора. Ее применение обосновано вышеназванными обстоятельствами. С целью минимизации погрешности, объем пробы аэрозоля DEHS, при определении количества частиц на выходе из испытуемого элемента, должен быть на таком уровне, чтобы измерительный прибор выявлял, как минимум, двадцать частиц. Это влечет за собой следующее. При контроле фильтров сверхтонкой очистки газов отбираемый для анализа объем из потока газа на выходе из испытуемого элемента с количеством не менее двадцати частиц становится, как правило, неприемлемо большим. Также время определения количества частиц на выходе из испытуемого элемента оказывается непозволительно продолжительным. Поэтому, с целью уменьшения продолжительности контроля используется процедура последовательного пробоотбора. Процедура последовательного пробоотбора построена на основе установления порогов доверительных интервалов, а также статистическом характере измерения частиц при малых значениях последних. Содержание процедуры заключается в постоянном отборе анализируемого газа с последующим сопоставлением числа частиц, измеренных прибором в режиме «on-line», с пороговыми величинами (опорными значениями счета). Они находятся по соотношениям для наибольшего и наименьшего порогов сопоставления, опираясь на предполагаемое число частиц: для наибольшего порога сопоставления Св=3,96+1,03 Е для наименьшего порога сопоставления Сн=-3,96+1,03Е С опорные значения счета, Е предполагаемое число частиц.
ГОСТ Р ИСО 14644-1 предполагает применение графического или табличного способов сопоставления Е и измеренного количества частиц. При непревышении величины последнего параметра наименьшего порога сопоставления Сн задерживающая способность фильтра признается отвечающей установленным величинам и процедура заканчивается. В ситуации, когда измеренное количество частиц превышает величину наибольшего порога сопоставления Св, фильтр бракуется. В случае нахождения измеренного количества частиц между Св и Сн процедура последовательного пробоотбора осуществляется до момента отбора пробы с числом частиц, равным 20. По результатам сопоставления делается вывод о возможности, или невозможности применения фильтра.
Далее приведены ход и результаты выполнения процедуры по следующим первоначальным данным: планируемые значения Е и КП равны 99,9995 и 0,0005 % соответственно; количество частиц в одном м3 аэрозоля перед входом в фильтр 106; планируемое количество аэрозольных частиц после выхода из фильтра N =5 частиц/ . расход аэрозоля, поступающего в измеритель частиц О = 0,0283 м / х- /мин Далее определили наименьшее количество аэрозоля V0, требуемого для поступления в измерительный прибор при обнаружении 20 частиц с планируемыми значениями Еи КП: N0 5 и рассчитали продолжительность процедуры проверки фильтра при достижении количества частиц на выходе из испытуемого элемента равного 20: г0= = = 141 мин. Q 0,0283 Продолжительность испытания следует признать неприемлемо великой. Таким образом, налицо целесообразность применения процедуры последовательного пробоотбора. В таблице 3.4 показаны данные испытаний фильтра ФС-КС-1-254/А3-280 с использованием полной процедуры последовательного пробоотбора (при достижении на выходе из фильтра 20 аэрозольных частиц). Их рассмотрение дает основание говорить о возможности использования испытуемого элемента. Причем этот вывод можно сделать по окончании доли времени 0,0019. В абсолютном выражении эта величина составляет порядка 10 секунд с момента начала пробоотбора. Следует отметить, что применение процедуры последовательного пробоотбора при испытаниях фильтров, установленных в места их использования, дало аналогичные результаты.
Недостижение требуемой величины защитной эффективности, если продолжительность испытания не превышает долю времени для заданных значений количества частиц Достижение требуемой величины защитной эффективности, если продолжительность испытания превышает долю времени для заданных значений количества частиц
Предложенное техническое решение по обеззараживанию биоаэрозоля проявило себя недейственным при сильном пенообразовании, образующемся в процессе выращивания клеток холеры в культиваторе с количеством среды выращивания, равным 50 % его полного объема. Это объясняется тем, что пена забивала линию отвода газов системы обеззараживания. С целью уменьшения количества пены в культиваторе приходилось снижать скорость вращения перемешивающего устройства, а также количество воздуха, вводимого для аэрирования. Это вызывало уменьшение концентрации О2 в среде выращивания. Названный факт приводил к достаточному ощутимому, до 3 раз, падению конечного «выхода» клеток V. cholerae, а соответственно и целевых продуктов процесса. Данное обстоятельство существенно ухудшает эффективность производства вакцины. Вышеназванное определило значительную практическую составляющую в технических или технологических решениях по снижению уровня пены при выращивании холерных вибрионов.
Устройство производственного культиватора не дает возможности применять механические способы борьбы с пенообразованием. Это принудило нас сделать упор на применение жидких антипенников. Необходимо сказать о том, что к этим веществам выдвигаются несколько условий их использования. К основным из них следует отнести: наличие разрешительных документов, подтверждающих их безопасность и дающих право употребления в технологических процессах приготовления препаратов, принимаемых человеком, а также отсутствие воздействия на фильтрационные процедуры. Основываясь на последнем условии, применение традиционно используемого для этих целей растительного масла, признано нецелесообразным. Осуществленный мониторинг отечественного и зарубежного рынка антипенников, выявил преимущественность применения пеногасителя «Антиспумин TZ», производимого немецкой компанией «Ашланд». Это вещество состоит из смеси природных жирных кислот, а также полиалкиленгликолевых эфиров. На этот антивспениватель выдано Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека свидетельство о государственной регистрации [236], разрешающее его использование как антипенника для производства препаратов, употребляемых человеком.
В ходе культивирования штаммов холерных вибрионов 569В Инаба и М-41 Огава критическое повышение уровня пены происходит обычно спустя 4-5 часов от старта процесса. Данное время характеризуется началом экспоненциальной стадии размножения микробной популяции. Следующий пик сильного образования пены приходился на 6-7 часы.
В ходе исследований выявлено, что добавление, максимально до 6 см3, антипенника оперативно, за 1-2 мин, давало ликвидацию пены. Следует сказать о том, что при выращивании клеточных культур не было нужды уменьшать скорость вращения перемешивающего устройства, а также количество воздуха, вводимого для аэрирования. Напротив, при уменьшении содержания О2 в среде выращивания получалось достигать поддержания минимального требуемого количества О2 за счет восстановления режимов аэрации-перемешивания. В совокупности это привело к увеличению «выхода» клеток V. cholerae до, в ряде случаев, 100 млрд м.к./см3, что даже превышало регламентные значения. Полученный положительный эффект от использования «Антис-пумин TZ» дал нам основание определить возможность проведения процесса культивирования с большим объемом культуральной среды. Выявлено, что ее увеличение с 150 дм3 до 180 дм3 не приводит к потере работоспособности системы обеззараживания выводимого из культиватора биоаэрозоля. Проведение процесса при количествах культуральной среды более 180 дм3 давало обтурирование пеной линии отвода газов системы обеззараживания, в силу того, что добавление антипенника не успевало устранить обильное пенообразование.
Проверка итогов моделирования при выращивании производственных штаммов холерных вибрионов
В производственном процессе изготовления коммерческой холерной химической вакцины на стадии концентрирования О-антигена, получаемого после культивирования штамма V. cholerae М41 серовара Огава, применялись половолоконные установки с рейтингом задержания макромолекул 20 кДа. Данная технология, внедренная в начале ХХI века [56,122], обладала недостатками, присущими тупиковым процессам фильтрации: большие потери выделяемого продукта, маленькая удельная скорость процесса. Проведенный обзор литературы выявил предпочтительность проведения этих процессов, используя фильтрацию в тангенциальном потоке жидкости на плоскорамных элементах. В связи со сказанным, была предпринята попытка концентрирования О-антигена этим методом, применяя в работе плоскорамные ультрафильтрационные элементы с НОММ 20 кДа (эффективная поверхность фильтрации – 0,1 м2), установленные в аппарат марки АСФ-009. Данный аппарат, а также ультрафильтрационный модуль изготовлены российской компанией «Владисарт». Сначала требовалось экспериментально обосновать процедуру стерилизации.
Производитель в документации [245] рекомендует применять растворы мети-ленгликоля и пергидроля с содержанием активных веществ от 2 до 3 % и от 5 до 6 % соответственно, а также одномолярный раствор едкого натра. Предпочтение использования какого-либо из названных веществ, а также параметры стерилизации устанавливаются, как следует из документации, экспериментально для конкретного вида обрабатываемого продукта.
Вышеназванные химические вещества применяли в количестве, обеспечивающим полное заполнение стерилизующим средством собранной установки, а также емкости 10 дм3 на половину вместимости. Дезинфекцию осуществляли рециркуляцией с давлениями, создаваемыми фильтрационной машиной на входе и выходе фильтруемого продукта – 1,5 бар и 0,5 бар соответственно.
Согласно ФСП на холерную химическую вакцину [24] остаточное количество метиленгликоля в препарате допускается не более 0,2 %. В связи с этим, осуществляли освобождение фильтрационной машины с установленным в нее ультрафильтрационным элементом от химических веществ, применяя стерильную воду фармакопейного качества объемом от 4,5 до 5,5 дм3, с дальнейшим определением дезинфектанта.
Исходя из сведений таблицы 5.1, применение для дезинфекции названных веществ гарантирует стерильность фильтрационной установки. Необходимо отметить, что концентрация метиленгликоля по окончании процедуры промывки была существенно ниже установленных величин.
Следующим этапом определили скорость отведения по линии пермеата воды, применяя не бывший ранее в работе ультрафильтрационный элемент с эффективной поверхностью фильтрации 0,1 м2, используя следующие величины тепловых и барометрических параметров процесса: температура фильтруемой жидкости – 8 оС; давление, создаваемое фильтрационной машиной на входе и выходе фильтруемого продукта – 1,5 бар и 0,5 бар соответственно. Значение данной характеристики составило примерно 16 дм3/ч.
Исследуя потенциальность применения способа проточной ультрафильтрации для концентрирования О-антигена штамма холерного вибриона М41 серовара Огава, процедуру останавливали, достигая сокращение объема исходного продукта в 10 раз, количество которого составляло 10 дм3.
Полученные сведения по процессу концентрирования О-антигена позволяют констатировать установление постоянного расхода отведения пермеата после 1 ч от начала процедуры, величина которой составила 20 см3/мин при первоначальном значении этого параметра 30 см3/мин. Полностью вся процедура заняла 7 ч. Удельный расход отведения пермеата был равен 12,85 дм3/м2/ч.
Характеристики препаратов, полученных в исследованиях по потенциальности применения способа проточной ультрафильтрации для концентрирования О-антигена штамма холерного вибриона М41 серовара Огава с применением плоскорамных ультрафильтрационных элементов с НОММ 20 кДа, а также по традиционным приемам изложены в таблице 5.2.
Активность О-антигена в сепарированной культуральной жидкости в РДП была равно 8 по обратному титру. Ретентат обладал следующими характеристиками: рН примерно 7,2; обратный титр О-антигена в РДП – 64. В пермеате О-антиген не обнаружен. Также можно говорить об отсутствии О-антигена в промывочной воде после пропускания рециркуляцией через ультрафильтрационный элемент водой фармакопейного качества объемом 0,5 дм3 в течение 0,5 ч. Сказанное позволяет сделать вывод об отсутствии сорбции О-антигена на ультрафильтрационном элементе.
В последующем концентраты О-антигенов, произведенные в соответствии с регламентной технологией, а также с применением плоскорамных ультрафильтрационных элементов, подвергнуты дальнейшей переработке в соответствии с установленными производственными процедурами: осаждение препарата сернокислым аммонием, освобождение от ионов этой соли, пастеризация и сублимация. При этом для сравнения использовались препараты, получаемые одномоментно с двух производственных культиваторов, условно названных номерами 1 и 2. Свойства лиофилизатов показаны в таблице 5.3.
Примечание. Т – величина характеристики препаратов, произведенных по традиционной технологии, ПУ – величина характеристики препаратов, произведенных при применении способа проточной ультрафильтрации, Д – величина характеристики по нормативным документам.
Рассмотрение сведений таблицы 5.3 позволяет констатировать, что характеристики лиофилизатов О-антигенов, произведенных при применении способа проточной ультрафильтрации, соответствуют установленным регламентом производства. Следует отметить, что содержание целевого продукта и его удельное количество при использовании способа проточной ультрафильтрации (согласно пропорции – вес лиофилизата к объему вещества, освобожденного от ионов сернокислого аммония) больше, чем у лиофилиза-тов, произведенных с применением традиционной технологии.
Затем проверяли целесообразность пятнадцати- и двадцатикратного уменьшения количества исходного продукта при концентрировании. Объем сепарированной культу-ральной жидкости, взятой для исследований, и параметры процесса не менялись. Полностью вся процедура заняла 7,5 и 8 ч соответственно. Удельный расход отведения перме-ата был равен 12,66 и 12,2 дм3/м2/ч. Значения этих характеристик сопоставимы с резуль 122
татами, выявленными при уменьшении количества исходного продукта в 10 раз. Данные исследований изложены в таблицах 5.4 и 5.5. Выявлено отсутствие целевого продукта в пермеате и его наличие в промывной жидкости. Последнее обстоятельство, на наш взгляд, говорит о сорбции О-антигена на ультрафильтрационном элементе. Напрашивается логичный вывод о нецелесообразности пятнадцати- и двадцатикратного уменьшения количества исходного продукта при концентрировании в силу возникающих потерь и соответственно меньшей экономичности производства.
На заключительном шаге экспериментального обоснования применения фильтрации в тангенциальном потоке жидкости на плоскорамных элементах с НОММ 20 кДа для концентрирования О-антигена имелась потребность разработки процедур очистки ультрафильтрационных элементов, а также их хранения при перерывах в работе. С целью очистки ультрафильтрационных элементов применяли раствор пергидроля с содержанием основного вещества от 5 до 6 %. Процедуру осуществляли аналогично процессу дезинфекции: рециркуляция в течение получаса дезинфектанта при давлениях, создаваемых фильтрационной машиной на входе и выходе фильтруемого продукта – 1,5 бар и 0,5 бар соответственно, с последующей отмывкой водой фармакопейного качества объемом от 4,5 до 5,5 дм3. Расход воды по линии пермеата, по окончании процесса составлял от 15 до 16 дм3/ч. Эта цифра сопоставима с данными, установленными при использовании не бывшего в работе ультрафильтрационного элемента. По окончании процесса пергидроль в пробах отсутствовал. Для консервации ультрафильтрационных элементов применяли метиленгликоль с содержанием активного вещества от 2 до 3 %, используя методические приемы проведения процесса, отработанные для осуществления процедуры стерилизации. Была показана применимость этих приемов для осуществления консервации.
Подводя итог экспериментам по обоснованию возможности концентрирования О-антигена фильтрацией в тангенциальном потоке жидкости на плоскорамных элементах с НОММ 20 кДа можно говорить о том, что данный способ может быть применен для выполнения этой технологической операции.
По данным литературы [6,8] О-антиген V. cholerae обладает молекулярной массой от 800 до 1000 кДа. Исходя из этого, представлялось разумным провести исследования по возможности применения ультрафильтрационных элементов с порогом отсечки более 20 кДа для концентрирования названного иммуногена.