Введение к работе
Актуальность темы. Введение чужеродных генов животным, с использованием рекомбинантных конструкций, позволяет получить трансгенных особей, у которых введенные гены могут улучшать породные свойства животных, повышать устойчивость их организма к различным инфекционным заболеваниям, или получать животных-продуцентов физиологически активных продуктов, необходимых в медицине, ветеринарии, животноводстве.
Впервые использование белков в качестве фармацевтического препарата было апробировано в 20-е годы прошлого столетия на инсулине, выделенного из поджелудочной железы свиньи. Через 60 лет был получен человеческий инсулин с помощью рекомбинантных бактерий. Этот инсулин оказался качественным и был адаптирован для всех групп пациентов, страдающих диабетом.
В конце 20-го столетия в мире широко развернулись исследования по получению трансгенных животных. В 1987 Peshon J.J. et al. впервые продемонстрировал возможность получения рекомбинантных белков с молоком трансгных млекопитающих.
К началу 21-го столетия было получено уже более 100 лекарственных белков с молоком трансгенных животных, а также получен ряд рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы [Zhu L., van de Lavoir M.C. et al., 2005].
В настоящее время технология получения рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы является наиболее перспективной в силу объективных преимуществ, таких как значительно более короткого периода получения терапевтических белков в белке яйца куриц от момента трансфекции, возможное использование невирусных плазмид, получение токсичных для млекопитающих препаратов, более приближенный к человеческому профиль гликозилирования белков, стерильность продукта, сниженная иммуногенность, высокий выход и стабильность экзогенного белка.
Среди наиболее перспективных приемов получения трансгенной птицы в настоящее время выделяют технологии применения эмбриональных клеток и использование сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК, однако исследователи сталкиваются с проблемами нестабильности встраивания генов, поэтому разработка новых и совершенствование существующих методов трансфекции экзогенной ДНК является актуальной.
Целью исследований являлась разработка и усовершенствование биотенологических методов генетической трансформации эмбриональных клеток кур.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Усовершенствовать методы получения трансгенной химерной птицы при использовании первичных эмбриональных половых клеток.
-
Получить долгосрочные культуры эмбриональных примордиальных (ППК) и бластодермальных (ЭСК) клеток кур.
-
Усовершенствовать методы трансфекции геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) человека сперматозоидов петуха с помощью липосом.
-
Получить трансгенных кур с встроенным геном ГКСФ человека с использованием сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК.
-
Изучить характер экспрессии и наследования целевого гена у транс-генной птицы.
Научная новизна работы. Впервые в нашей стране получены трансген-ные куры с геном ГКСФ человека, и продемонстрирована экспрессия этого гена. Определены оптимальные режимы трансфекции гена ГКСФ человека в сперматозоиды петуха (количественный состав сперматозоидов, режимы обработки семени, подбор производителей). Продемонстрировано наследование введенного гена у потомков.
Показана возможность успешного культивирования первичных половых клеток (ППК) из гонад ранних эмбрионов птицы на митотически неактивном STO (мышиные эмбриональные фибробласты) монослое и разработан протокол длительного культивирования ППК, с целью их дальнейшего использования для трансфекции.
Впервые разработан метод получения трансгенных химерных эмбрионов птицы в результате трансплантации трансфецированных первичных ППК гонад в зародышевый диск реципиента, предварительно стерилизованного ультрафиолетовым облучением.
Практическая значимость работы. Результаты исследований, полученные при изучении оптимальных приемов культивирования in vitro эмбриональных клеток птицы, могут быть использованы при разработке технологии производства рекомбинантных белков.
Разработано наставление «Способ получения генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК», утвержденное на заседании секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН», протокол № 5, от 15 октября 2010 г. Предложенный способ отличается высокой эффективностью, простотой, дешевизной и быстротой исполнения.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчетных сессиях отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИПЗК им. Афанасьева В.А. (2007 - 2010), а также на VI симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2009); XVIII Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» (С.-Петербург, 2009); IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Н.Новгород, 2010); заседании секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН» (Дубровицы, 2010).
Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. приготовление микроинструментов для выделения и работы с первичными половыми и бластодермальными клетками птицы (изготовление стеклянных пипеток для инъекции трансфецированных клеток в эмбрион), приготовление питательных сред и рабочих растворов; выделение клеток из эмбрионов птицы, их культивирование, окрашивание и криоконсервация; получение семени от петухов, ее оценка, проведение трансфекции сперматозоидов и искусственного осеменения куриц; выделение ДНК из крови цыплят и тканей эмбрионов, проведение ПЦР диагностики; получение крови от птицы, приготовление сыворотки и проведение ИФА; анализ и обобщение полученных результатов исследований, написание статей, отчетов и докладов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в т.ч. 7 – в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов исследований, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 12 рисунками и содержит 8 страниц приложений. Список литературы включает 107 библиографических источника, в т.ч. 91 на иностранном языке.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту.
-
Использование препарата «Lipofectamin 2000» для трансфекции первичных ППК птицы чужеродным геном, с последующим переносом их в зону зародышевого серпа эмбрионов доноров, позволяет получить 25% трансгенных эмбрионов.
-
Смена среды и сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток являются лимитирующими факторами, влияющими на процесс пролиферации ППК при культивировании in vitro, при этом выявлена способность фидерных клеток линии STO поддерживать долгосрочную культуру ППК.
-
Максимальная эффективность получения трансгенной птицы с геном ГКСФ человека от числа рожденных потомков продемонстрирована при использовании препарата липосом «Lipofectamin 2000» и составила 33,3%.Установлена экспрессия гена ГКСФ человека в крови трансгенных кур. Наследование чужеродного гена наблюдалось от 25 до 50% у цыплят первого поколения.
