Введение к работе
Актуальность темы.
Подсолнечник {Helianthus annuus L.) является чрезвычайно важной масличной культурой для России, ежегодная площадь посевов которой составляет более 7 млн. гектаров. Подобные объёмы возделывания приводят к необходимости создания растений, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам. Однако в популяции культурного подсолнечника наблюдается низкая вариабельность ценных сельскохозяйственных признаков, что делает процесс селекции традиционными методами всё более трудоёмким и малоэффективным.
Применение методов генетической инженерии может значительно дополнить имеющийся спектр признаков и позволит решить широкий круг практических и фундаментальных задач.
Несмотря на тот факт, что A. tumefaciens является давно описанным естественным патогеном подсолнечника, существует ряд факторов, ограничивающих эффективность генетической трансформации этого растения. Прежде всего «бутылочным горлышком» данного процесса является низкий уровень регенерации побегов in vitro, а другим значимым фактором является процесс селективного отбора трансгенных побегов. К настоящему времени все трансгенные растения подсолнечника были получены с применением канамициновой селекции, однако многими авторами была отмечена её низкая эффективность, связанная с получением большой доли химерных побегов и ложных трансформантов (Schrammeijer В. и др. 1990, Escandon A.S., Hahne G. 1991, Knittel N., и др. 1991, Bidney D.L. и др. 1992, Radonic L.M. и др. 2008). Также было отмечено ингибирующее действие канамицина на процесс эмбриогенеза подсолнечника в культуре in vitro (Radonic L.M. и др. 2006).
В свете описанных проблем, разработка эффективной системы регенерации и использование фосфинотрицина при селекции клеток подсолнечника in vitro является актуальным.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы была разработка эффективного метода
регенерации in vitro побегов подсолнечника (Helianthus annuus L.) и создание на
его основе трансгенных растений, несущих ген bar
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: 1. Определить для каждого из исследуемых генотипов тип экспланта с
целью получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для
разработки системы генетической трансформации;
Определить компетентность к агробактериальной трансформации выбранного типа экспланта подсолнечника, используя для оценки маркерный ген mMA(GUS);
Получить трансгенные растения подсолнечника, несущие ген bar и определить наличие экспрессии данного гена.
Научная новизна и практическая значимость.
Разработана эффективная система стерилизации семян подсолнечника, позволяющая получать 100 % стерильных семян со 100 % всхожестью, что позволяет проводить их массовое проращивание в культуре in vitro;
Разработан экспресс-метод оценки качества семян подсолнечника, который может быть использован как в производстве, так и в лабораторных условиях;
Разработан высокоэффективный метод регенерации подсолнечника in vitro, в котором в качестве источников эксплантов используются зрелые зародыши (семена). Метод позволяет получать с одного семени подсолнечника четыре экспланта с высоким регенерационным потенциалом. Частота регенерации побегов на данном типе экспланта составила от 83,5 до 90,3 %;
Разработан эффективный способ индукции множественного побегообразования подсолнечника in vitro, основанный на удалении основного побега экспланта, что позволило индуцировать развитие от 2-х и более побегов на эксплант с частотой 78 %. На настоящий момент - это наиболее эффективный способ регенерации эксплантов подсолнечника. Разработанный способ индукции множественной регенерации побегов может быть использован при клональном микроразмножении ценного материала;
Были определены параметры селекции клеток подсолнечника in vitro с использованием фосфинотрицина в качестве селективного агента. Было показано, что фосфинотрицин может эффективно применяться в селекции как в условиях in vitro, так и in planta;
Впервые получены трансгенные растения подсолнечника, экспрессирующие ген bar, и показана их высокая устойчивость к фосфинотрицину in vitro (200 мг/л) и гербициду Баста (3 л/га) в условиях теплицы;
Полученные трансгенные образцы подсолнечника, устойчивые к действию фосфинотрицина, являются ценным исходным материалом и, в дальнейшем, могут служить донорами устойчивости при селекции новых сортов и гибридов;
Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений подсолнечника с другими хозяйственно-ценными генами.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IX Международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященному 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009); на 1st Workshop on plant molecular biotechnology XV biotechnology summer school (Gdansk. Poland, 2009); на II международной научной конференции «Генетически модифицированные (биотехнологические) растения: перспективы использования и проблемы биобезопасности» (Киев, Украина, 2009); на 8 European sunflower biotechnology conference SUNBIO 2010 (Antalya, Turkey, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано двенадцать печатных работ, в том числе три статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и глава в монографии.
Структура и объем работы. Диссертация включает: введение; обзор литературы; описание материалов и методов исследования; результаты и их обсуждение; выводы; список литературы; приложение.
Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 56 рисунков и 177 библиографических ссылок.
