Введение к работе
Актуальность темы. Парвовирус свиней (ПВС) относится к категории важных патогенов, вызывающих нарушения репродуктивной функции свиноматок и наносящих значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам [Maldonado et al., 2005]. Болезнь клинически проявляется только у супоросных свиноматок и характеризуется малочисленными помётами, гибелью эмбрионов и плодов с рассасыванием и мумификацией, рождением мёртвых плодов, бесплодием, прохолостами и реже абортами [Орлянкин и др., 1986; Сергеев и др., 2007]. У животных других возрастных групп заболевание обычно протекает в латентной форме, но может вызывать кожные поражения у поросят, интерстициальный нефрит у свиней убойного возраста и негнойный миокардит у поросят-сосунов [Kresse et al., 1985; Lager et al.,1994; Whitaker et al.,1990; Drolet et al., 2002; Bolt et al.,1997]. Установлено, что ПВС усиливает проявление клинических признаков синдрома послеотъёмного мультисистемного истощения (СПМИ), одним из возбудителей которого является цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2). Наличие двух вирусов приводит к значительному усугублению болезни, вплоть до тяжёлого системного заболевания с летальным исходом [Krakowka et al., 2000].
Для определения ПВС методом реакции гемагглютинации (РГА) на исследование направляют мумифицированные плоды, внутренние органы абортированных плодов длиной не более 15см (до 65-го дня развития). Плоды старше 70-дневного возраста (длиной более 17см) и мёртворожденные поросята не пригодны для выявления вируса, поскольку содержат вирусный антиген, связанный с антителами [Орлянкин и др., 1985; Straw et al., 1999].
В последнее время для диагностики широко применяют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на ферментативной амплификации специфических участков генома [Гребенникова и др., 2008; Molitor et al.,1991]. Данный метод чувствительный, специфичный, прост в исполнении и, кроме того, позволяет выявлять вирус, несмотря на его связанность с антителами.
Также широкое распространение получает метод ПЦР в реальном времени, который обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР, сокращая время проведения анализа и снижая риск контаминации. Также ПЦР в реальном времени позволяет проводить количественный анализ.
Таким образом, разработка комплекса методов молекулярной диагностики ПВИС на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени, а также разработка теста, позволяющего одновременно выявлять и дифференцировать ПВС и ЦВС-2, являются актуальными направлениями ветеринарной диагностики.
Цель и задачи исследований. Цель исследований: разработка комплекса методов молекулярной диагностики ПВИС и дифференцирования ПВС и ЦВС-2. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработать диагностическую ПЦР тест-систему для выявления ПВС на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена неструктурного белка NS1.
-
Разработать диагностическую ПЦР тест-систему в реальном времени для выявления ПВС на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена неструктурного белка NS1.
-
Провести сравнительный анализ диагностических тест-систем на основе ПЦР, ПЦР в реальном времени и метода РГА.
-
Разработать тест-систему на основе множественной ПЦР в реальном времени для одновременного обнаружения и дифференцирования ПВС и ЦВС-2.
-
Разработать рекомбинантные положительные контроли для использования в качественном и количественном анализе.
-
С помощью разработанных тест-систем провести исследование образцов от животных.
Научная новизна работы.
Проведен сравнительный анализ последовательностей геномов различных штаммов ПВС. Разработаны специфические праймеры и зонды на консервативный участок генома данного вируса.
Впервые в РФ предложен способ диагностики ПВИС на основе молекулярных методов ПЦР и ПЦР в реальном времени.
Впервые в РФ разработана методика количественного определения ПВС в образцах от животных на основе ПЦР в реальном времени.
Впервые в РФ разработан множественный вариант ПЦР в реальном времени, позволяющий одновременно выявлять ПВС и ЦВС-2.
Практическая значимость работы.
Разработан комплекс методов молекулярной диагностики ПВИС и дифференцирования ПВС и ЦВС-2.
Разработанная «Тест-система для обнаружения парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции» сертифицирована во Всероссийском Государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»). Инструкция по применению от 21.05.2009, СТО 42418073-002-2007. Данная тест-система широко применяется на территории РФ с 2007г.
«Тест – система для обнаружения парвовируса свиней методом ПЦР в реальном времени» успешно прошла доклинические исследования и клинические испытания с использованием образцов от животных. Подготовлена необходимая нормативная документация для регистрации в РФ.
По результатам доклинических исследований «Тест – система для обнаружения и дифференцирования ПВС и ЦВС-2 методом множественной ПЦР в реальном времени» показала высокую чувствительность и специфичность и может быть представлена для широких клинических испытаний с использованием образцов от животных.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Возможность выявления ПВС с помощью диагностической ПЦР тест-системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена неструктурного белка NS1.
-
Возможность выявления ПВС с помощью диагностической ПЦР тест-системы в реальном времени на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена неструктурного белка NS1.
-
Высокая диагностическая чувствительность разработанных тест-систем на основе ПЦР, ПЦР в реальном времени в сравнении с методом РГА.
-
Возможность одновременного выявления ПВС и ЦВС-2 с помощью диагностической тест - системы на основе множественной ПЦР в реальном времени.
-
Возможность применения рекомбинантных положительных контролей для качественного и количественного обнаружения ПВС и ЦВС-2 в тест-системах на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени.
-
Возможность использования тест - систем на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для диагностики ПВИС.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы отражены в итоговых отчётах ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России за 2005-2011 гг. Материалы доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России за 2005-2011 гг., а также на заседании отдела прикладной вирусологии ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России 28 марта 2012г.
Публикации научных исследований. По результатам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста и содержат: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 161 источник, в том числе 18 отечественных и 143 зарубежных авторов.
