Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
2.1.Аэромоноз. Общая характеристика болезни 10
2.1.1. Патогенез и клиническая картина заболевания 12
2.1.2.Влияние аэромонад на состояние ПОЛ и АОЗ у некоторых видов культивируемых рыб 16
2.1.3. Антиоксидантное действие токоферолов 21
2.1.4. Диагностика 23
2.1.5. Меры борьбы и профилактика 24
Собственные исследования
3. Материалы и методы 28
4. Результаты исследований
4.1. Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ) рыб в естественной среде и искусственных условиях содержания 34
4.2. Антиоксидантная защита карпов при экспериментальном аэромонозе 37
4.3. Разработка рецептуры препарата для лечения аэромоноза карповых рыб 42
4.3.1. Технологический процесс изготовления препарата «Витарол-Е».. 44
4.3.2. Технические требования 49
4.4. Антибактериальные и антиоксидантные свойства препарата йода и «Витарола-Е» при аэромонозе (in vitro и in vivo) 49
4.5. Изучение токсичности препарата «Витарол-Е» для рыб 54
4.6. Испытание профилактической эффективности «Витарола-Е» в аквариальных условиях 56
4.7. Биологические свойства аэромонад, выделенных от рыб 58
4.7.1. Морфология и культуральные свойства аэромонад 58
4.7.2. Биохимические свойства аэромонад 62
4.8. Биологические свойства аэромонад, выделенных из воды 76
4.8.1. Культурально-морфологические свойства аэромонад выделенных из воды 77
4.9. Патогенные свойства аэромонад 80
4.10. Испытание терапевтической эффективности «Витарола-Е» в производственных условиях 82
4.11. Сравнительный анализ эффективности антимикробного действия нитрофуранов и «Витарола-Е» в условиях товарного карповодства 89
5.Обсуждение 92
6. Выводы 104
7. Практические предложения 106
8. Список использованной литературы 107
9. Приложения 122
- Патогенез и клиническая картина заболевания
- Материалы и методы
- Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ) рыб в естественной среде и искусственных условиях содержания
Введение к работе
Актуальность проблемы. Аквакультура - искусственное выращивание рыб, гидробионтов, растений в контролируемых и управляемых человеком условиях. Из всех продовольственных отраслей это наиболее динамично развивающийся сектор (Мамонтов Ю.П., 2006).
Уплотненное содержание, неправильное кормление, техногенные факторы, стрессы различного характера оказывают негативное влияние на организм животных и рыб, что, как правило, приводит к угнетению иммунной системы и возникновению различных патологических процессов (Федоров Ю.Н., 2003; Бычкова Л.И., Юхименко Л.Н., 2007). И только у некоторой части рыб, при этом, развиваются адаптивные реакции, направленные на сохранение вида и, довольно длительное время отрицательно сказывающиеся на их продуктивности (Leung K.Y.et.al., 1994, Mikryakov B.R., 1999, Kozinska A. et.al., 2000).
Многолетний опыт использования противомикробных лекарственных средств при бактериальных болезнях рыб показал, что некоторые из них со временем оказываются малоэффективными. Поэтому в последнее время предпочтение отдают лекарственным средствам и кормовым добавкам, обеспечивающим нормализацию неспецифической резистентности макроорганизма (Новоскольцева Т.М., 2002; Leszek G. et.al., 2004).
Другим важным механизмом, обеспечивающим высокую резистентность животного организма к неблагоприятным внешним и внутренним факторам является антиоксидантная защита (АОЗ) (Regoli F. et.al., 1995; Sakai M et.al., 2001; Wink D.A. et al., 2001). Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и АОЗ находятся в динамическом равновесии. Их нарушение приводит к развитию у рыб различных патологий (Богдан В.В., 2002, Герунова Л.К.,2004).
Аэромоноз рыб семейства карповых – сложный патологический процесс, затрагивающий различные стороны обмена веществ, вызываемый условнопатогенной бактерией Aeromonas и сопровождающийся гибелью до 70% поголовья рыб (Афанасьев В.И., 1979; Грищенко Л.И., 2007; Асадчая Р.Л.,2008). В современной практике рыбоводства для профилактики и борьбы с аэромонозом пресноводных рыб, широко используют различные антибактериальные лекарственные средства, вопросам же коррекции про- и антиоксидантных процессов уделяется еще недостаточно внимания.
Цель работы - изучить изменения в течении свободнорадикальных процессов и системе антиоксидантной защиты в норме и при заболевании рыб аэромонозом, усовершенствовать меры борьбы и профилактики болезни путем повышения естественной резистентности организма рыб, с использованием антиоксидантных и антибактериальных препаратов.
Задачи исследований:
- определить значение показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у рыб семейства карповых в норме и при аэромонозе;
- разработать рецептуру препарата на основе йодсодержащих веществ в комплексе с минеральными веществами и антиоксидантами и определить возможность коррекции состояния антиоксидантной системы защиты у карповых рыб при аэромонозе;
- разработать лабораторный регламент по производству, контролю и применению препарата «Витарол-Е» против аэромоноза карповых рыб;
- изучить сравнительную терапевтическую и профилактическую эффективность разработанного препарата in vitro и in vivo;
- в разных регионах РФ выделить от карпов, с подозрением на заболевание аэромонозом, культуры бактерий, изучить основные биологические свойства;
- провести сравнительный анализ патогенности аэромонад, изолированных из внутренних органов рыб и рыбохозяйственных водоемов;
- испытать в условиях неблагополучного по аэромонозу карпов хозяйства терапевтическую эффективность разработанного комплексного препарата.
Научная новизна. Определены показатели, характеризующие состояние процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у рыб в норме, а также при спонтанном и экспериментальном аэромонозе.
Впервые показана эффективность витамина Е, природного биоантиоксиданта, для стабилизации параметров антиоксидантной защиты у карповых рыб при аэромонозе.
Проведена идентификация выделенных штаммов аэромонад в рыбхозах Московской, Владимирской, Калужской, Липецкой, Ростовской, Тверской областей по морфологическим, культурально-биохимическим и биологическим свойствам. Установлено, что наиболее вирулентными свойствами обладают виды A.sobria, A.hydrophila.
Получен патент РФ на изобретение №2344824 от 27 января 2009 года: «Препарат для лечения инфекционных заболеваний рыб бактериальной этиологии и способ лечения инфекционных заболеваний рыб бактериальной этиологии».
Практическая ценность. Разработана лекарственная форма препарата «Витарол-Е», обладающего выраженными антиоксидантными и антибактериальными свойствами.
Препарат «Витарол-Е» испытан комиссионно и показал высокую эффективность при аэромонозе карпов в рыбоводческом хозяйстве «Нарские острова» Московской области. Препарат используется также в других рыбоводческих хозяйствах.
Разработаны «Методические рекомендации по ветеринарному контролю, диагностике и профилактике опасных заболеваний рыб в аквакультуре», рассмотренные и одобренные на секции «Инфекционная патология», протокол №4 и утвержденные Российской академией сельскохозяйственных наук 01 ноября 2006 года. «Методические наставления по определению уровня свободнорадикального окисления и состояния системы антиоксидантной защиты организма рыб», рассмотренные и одобренные на Ученом Совете ВИЭВ 19 января 2010 года, протокол № 1.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004г.); 4-ой Национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005г.); международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 2005: современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» (Ялта, 2005г.); заседании научно-консультативного Совета по болезням рыб Межведомственной Ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2009г.); заседаниях Ученого совета ВИЭВ (2004-2009гг.); межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (2010г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных трудов, в том числе патент РФ, 2 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 20 таблицами, 14 рисунками. Список литературы включает 147 публикаций, в том числе 75 иностранных.
Патогенез и клиническая картина заболевания
Патогенез, вызываемый аэромонадами, является многофакторным. При совместном действии факторы вирулентности могут значительно усиливать патогенное влияние бактерий (Leung K.Y., 1994)
Проникая в организм рыб, бактерии разносятся кровью во все органы и ткани, обусловливая септицемию. Инкубационный период составляет 7-30 дней. Выделяемые аэромонадами биотоксины оказывают патогенное действие на сосудистые стенки, клетки и ткани, вызывают серозно-геморрагическое воспаление кожи, выпотевание транссудата и экссудата в рыхлую клетчатку и брюшную полость, дистрофические и некробиотические изменения в паренхиматозных органах (Quinn D.M. et.al., 1993; Грищенко Л.И., 2007). Вирулентность аэромонад связана со способностью
продуцировать целый ряд негативных факторов, таких как цитотоксины: гемолизины, протеазы, нуклеазы (Ljungh et.al., 1986; Cahill, 1990). Исследователи Департамента генетики и клеточной биологии (Малазия) Yadav М. с соавторами установили, что цитотоксин-образующие штаммы чаще выделяются от рыб, больных аэромонозом. Гемолизин-продуцирующие штаммы выделяются как от больных, так и от здоровых рыб. Также было показано, что патогенность аэромонад может быть связана с наличием у штаммов A.hydrophila цитотоксинов (Yadav М. et. al., 1992). Эти токсины повышают восприимчивость рыб, вызывают нарушения функций тканей, геморрагии в органах, септицимию, в результате создаются условия для развития заболевания (Ansary А., 1992).
Выявлена взаимосвязь активизации процессов СРО липидов при развитии инфекционных заболеваний рыб. Так, при экспериментальном заражении карпов культурой бактерий Aeromonas hydrophila происходят существенные изменения физико-химических свойств липидов селезенки, крови, почек, жабр, мозга, печени, мышц. Уровень изменения содержания липидов при различной интенсивности заражения в мышцах и головном мозге, селезенке и крови выше, чем в печени и жабрах. Высокое содержание общих липидов в тканях зараженных рыб сочетается с повышенным уровнем фосфолипидов, триацилглицеринов и холестерина. В тканях инфицированных рыб (по сравнению с незараженными) увеличена относительная доля олеиновой и линолевой кислот, а количество пента- и гексаеновых кислот уменьшается в 1,5-2 раза.
Клинические признаки болезни: брюшная водянка, пучеглазие, точечные и пятнистые кровоизлияния на поверхности тела, со временем переходящие в язвенные поражения, покраснение ануса, разрушение плавников, отсутствие слизи на поверхности тела (Thune R.L. et.al., 1993).
Различают острое, подострое и хроническое течение болезни с последовательным переходом из одной стадии в другую.
Острое течение наблюдается в начале вспышки заболевания сопровождается массовой гибелью рыб (до 70%) и характеризуется кровоизлияниями, ерошением чешуи, экзофтальмией, асцитом, водянкой (Асадчая Р.Л., 2008). На брюшке, плавниках, боковых стенках туловища отмечают покраснения кожи разных размеров и формы, очаговое или диффузное ерошение чешуи за счет скопления транссудата в подчешуйных кармашках, одно- или двухстороннее пучеглазие. Брюшко увеличено в объеме, флюктуирует, при пробном проколе из него вытекает экссудат желто-соломенного цвета с кровянистым оттенком. У зеркальных и голых карпов на коже образуются везикулы (пузырьки), заполненные прозрачной или кровянистой жидкостью. Анус выпячен, слизистая его гиперемирована при надавливании на брюшко из него выделяются слизистые шнуры. Жабры нередко анемичны или застойно гиперемированы. Больные рыбы угнетены малоподвижны, держатся у поверхности воды в береговой зоне, теряют координацию движений и погибают (Просяная В.В. и др., 1986).
Для подострого течения болезни характерно снижение смертности рыб. При этом на фоне признаков острого течения (очагового ерошения чешуи, пучеглазия, асцита) отмечают появление язв на теле рыб. В стаде может быть различное соотношение больных рыб с разными формами болезни. Нарушение поведения рыб соответствует тяжести заболевания.
Хроническое течение чаще наблюдают в конце лета, осенью и зимой-оно сопровождается выздоровлением части рыб. Гибель рыб при этом практически прекращается, за исключением случаев осложнений и действия неблагоприятных факторов внешней среды. Характерным для этой стадии болезни является наличие язв на теле, нередко проникающих в глубокие слои мускулатуры вплоть до оголения костей. Язвы имеют различную форму с некрозом ткани на дне и ободком грануляционной ткани ярко-розового или бело-серого цвета. У выздоравливающих рыб язвы заживают с образованием рубца. Отмечают деформацию туловища. Поведение рыб не отличается от поведения здоровых (Юхименко Л.Н. и другие, 1997).
Материалы и методы
Работа выполнена в 2002 - 2010 гг. в лаборатории ихтиопатологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко, на опытно-экспериментальной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ, о. Лисий Тверской области и в неблагополучных по аэромонозу карпов рыбоводных хозяйствах Московской, Владимирской, Калужской, Липецкой, Ростовской и Тверской областей в рамках задания 02.01.18. РНТП «Изучить эпизоотическое состояние рыбоводческих хозяйств по вирусным и бактериальным инфекциям».
Объектом исследования служили рыбы разных видов и возраста из естественных водоемов и прудов рыбоводческих хозяйств. Для проведения лабораторных экспериментов рыб завозили в аквариальную лаборатории из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. После адаптации, в течение 14 дней, рыб использовали в экспериментах.
Кормление рыб проводили гранулированными концентрированными кормами, выпускаемыми на комбикормовых заводах, по рецептам К-ПО, К-111. Суточная норма кормления составляла не более 5% корма к массе рыб. Учет поедаемости кормов проводили визуально. Механическую и биологическую очистку воды в аквариумах проводили с помощью наружных фильтров Tetra XI200 (пр-во Германия)
Всего в опытах было использовано 5040 экз. карпов (Cyprinus carpio L.) средней штучной массой от 30 до ЮООгр.; 510 экз. карасей {Carassius carassius L.) массой от 50 до 500 гр., 50 экз. лещей {Abramis brama L.) массой от 500 до 1500 гр., 40 экз. плотвы (Rutilus nitihis L.) массой от 50 до 100 гр., 40 экз. красноперки (S.erythrophthalmus L.) массой от 100 до 500 гр.; 280 экз. радужной форели (Oncorhynchus mykiss L.) массой от 300 до 700 гр.
Первичные посевы делали из крови, паренхиматозных органов рыб с клиническими признаками аэромоноза и прудовой воды. Рыбу стерильно вскрывали, патматериал засевали на плотные питательные среды: МПА, TSA и селективные среды: Шмитц-Шанделье, Риппея-Кабелли.
Для исключения болезней вирусной природы работа проводилась совместно с ихтиовирусологами к.б.н. Завьяловой Е.А. и к.в.н. Пичугиной Т.Д., за что автор им искренне благодарен.
В опытах по изучению биологических свойств возбудителей аэромоноза было использовано 173 изолята аэромонад, из них 97 выделены нами от больных рыб и 76 - из воды. Морфологические, культуральные и биохимические свойства аэромонад изучали на жидких, полужидких и плотных питательных средах.
Посевы инкубировали в термостате при температуре 25-26С, в течение 18-24 часов. Выросшие колонии пересевали на среду Клиглера, которая позволяла дифференцировать бактерии по их способности ферментировать глюкозу и лактозу, образовывать сероводород. Результаты учитывали после инкубации при 26 С в течение 24-48 часов. Затем со среды отбирали культуры ферментирующие глюкозу и не ферментирующие лактозу.
При положительной реакции на оксидазу культуры пересевали на среду Хью-Лейфсона для определения ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях. Оксидазоположительные культуры, ферментирующие глюкозу, рассевали на дифферециально-диагностические среды («пестрый ряд Гисса»).
Определение ферментативной активности аэромонад проводили также с использованием Системы индикаторной бумажной (СИБ), производства ФГУП «НПО «Микроген», г.Москва.
Определение редукции нитратов в нитриты проводили согласно ускоренной методике Касаткина (1960) и Зырянова (1976). Дезоксирибонуклеазную активность микробов определяли по Джефферис с соавторами (1957) и Смит с соавторами (1969). Уреазу и фенилаланиндезаминазу у бактерий выявляли по Эдеррер с соавторами (1971), индолообразование определяли по Грациану, а также реактивом Ковача (В.М.Никитин Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов, 1986).
Дифференциацию микроорганизмов и типирование до вида проводили согласно руководству по определению бактерий Берги (1997).
Для сохранения исходных свойств штаммов их засевали в питательную среду бедную по количеству белка, разливали в ампулы, запаивали и хранили при 4С (Скородумов Д.И. и др. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных, 2005).
Чувствительность изолированных аэромонад к некоторым антимикробным препаратам, йодсодержащему соединению и «Витарол-Е» определяли методом диффузии в агар с применением дисков и путем серийных разведений в жидкой питательной среде по общепринятым в микробиологии методам.
Постановку проб с помощью дисков проводили в чашках Петри на средах для определения чувствительности к антимикробным препаратам -АГВ и агар Мюллера-Хинтона, по поверхности которых равномерно распределяли суспензии испытуемых 24-часовых культур бактерий. Затем на поверхность агара помещали диски, пропитанные антибактериальными веществами, на расстоянии 2,5 см от центра чашки, по 5-6 дисков. Засеянные чашки с дисками инкубировали при температуре 26С в течение 16-18 часов, после чего учитывали зону задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. При зоне диаметром до 10 мм штамм характеризовали как устойчивый; 11-15 мм - как малочувствительный; 15-25 мм как чувствительный и свыше 25 мм - высокочувствительный. Использовали набор дисков для определения чувствительности энтеробактерий к противомикробным препаратам (расширенный) научно-исследовательского центра фармакотерапии (НИЦФ).
Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ) рыб в естественной среде и искусственных условиях содержания
Патогенез аэромоноза карпов — сложный процесс, затрагивающий различные стороны обмена веществ. Изучение про- и антиоксидантных процессов имеет важное значение для определения физиологического состояния организма здоровых рыб и выявления сравнительных изменений при заболевании аэромонозом.
На данном этапе работы было изучено течение процессов ПОЛ и АОЗ у рыб в естественных и рыбохозяйственных водоемах, в норме и при гипоксии.
Исследования проводили летом 2004-2006 года в аквариальной лаборатории, в рыбоводных хозяйствах Московской области, а также на Опытно-экспериментальной базе ВИЭВ им.Я.Р.Коваленко, о.Лисий (Тверская обл., Вышневолоцкое водохранилище).
Материалом для исследований служили пробы крови от рыб двух- и трех лет: карп (Cyprinus carpio L.)-200 шт., лещ (Abramis brama L.) — 50 шт., плотва (Rutilus rutilus L.) - 40 шт., красноперка (S.erythrophthalmus L.) - 40 шт.
Для определения естественного течения процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты брали кровь от клинически здоровых рыб, при оптимальном насыщении воды кислородом, во время контрольных обловов. Гипоксические состояния учитывали по содержанию растворенного кислорода в воде - снижение от 7 - 5 мг/л до 1,5 мг/л и менее определяли с помощью термооксиметра ЭКОТЕСТ 2000. Учитывали также внешние проявления гипоксии - беспокойство рыбы, учащенное сокращение жаберных крышек, заглатывание воздуха у поверхности воды, присутствие снулой рыбы.
Для предохранения цельной крови от свертывания добавляли к ней 1% -ный раствор гепарина, и доставляли в лабораторию в герметически закрытых стеклянных пробирках, в термосе со льдом.
Пробы крови, полученные от рыб, параллельно исследовали на процесс ПОЛ и уровень антиоксидантов в организме. Для этого определяли содержание малонового диальдегида, каталазы, пероксидазы, церулоплазмина, уровень общих фосфолипидов в крови.
Показатели уровня свободно-радикальных реакций в естественной среде обитания рыб, при оптимальных условиях содержания представлены в таблице 1.
Количество малонового диальдегида, антиокислительных ферментов, уровень общих фосфолипидов имеют различия в зависимости от вида рыб. Максимальное содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов МДА крови отмечали у карпов. Накопление конечных продуктов ПОЛ у карпа мы связываем с тем, что культивируемый объект подвержен интенсивному влиянию негативных факторов извне. Таких, как высокие плотности посадки, кормление недоброкачественными кормами, чрезмерное содержание органики, которые могут вызывать предзаморные состояния. Между тем условия обитания рыб естественных водоемов - наиболее благоприятные.
Из табличных данных видно, что расхождение значений уровня антиокислительных энзимов у карпов и рыб-обитателей естественных водоемов находится в пределах 30%, в то время как содержание конечных
продуктов ПОЛ у карпов до 50%. Это может служить показателем истощения системы АОЗ организма вследствие испытанного высокого напряжения указанных процессов.
Зависимость количества перекисей липидов, общих фосфолипидов и ферментов защиты в образцах проб крови от содержания кислорода в воде представлена в таблице 2.
Результаты исследований проб крови рыб, находящихся в условиях недостатка кислорода показали, что у всех видов рыб происходит активация процесса ПОЛ и снижение уровня общих фосфолипидов. Уменьшение количества общих фосфолипидов является характерным показателем окисления липидов в биомембранах клеток.
Как видно из таблицы 2 , содержание ферментов антиоксидантной защиты увеличилось. Усиление функционирования системы АОЗ направлено на ингибирование окислительной активности и поддержание состояния системы в пределах физиологической нормы. Необходимо также отметить, что у рыб в естественной среде обитания значения показателей антиокислительных энзимов на 30-44% превысили значения у выращиваемых рыб. Таким образом, усиление ПОЛ приводит к увеличению выработки антиоксидантов. Показатели системы АОЗ и небольшой сдвиг уровня общих фосфолипидов у рыб в естественных водоемах, свидетельствует о высоких барьерных функциях организма, и выступает как составляющий фактор общей резистентности.
Похожие диссертации на Разработка комплексного препарата "Витарол-Е" для антиоксидантной и антибактериальной защиты карповых рыб при аэромонозе
