Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Вирус папилломы человека 10
1.2. Структура, функции и свойства онкобелков е7 15
1.3. Структура, функции и свойства белков теплового шока 21
1.4. Литературная справка по белкам е7-бтш70 27
2. Собственные исследования 34
2.1. Материалы и методы исследований 34
2.1.1. Используемые штаммы 34
2.1.2. Растворы, реактивы 34
2.1.3. Хроматографическая очистка 39
2.1.4. Методы контроля качества 42
2.2. Результаты исследований 47
2.2.1. Разработка технологии очистки гибридных белков 47
2.2.1.1. Изучение примесного профиля е7-бтш70, стратегия хроматографической очистки и стабилизации белков в растворе 47
2.2.1.2. Металл-хелат аффинная хроматография как стадия «захвата» гибридных белков из клеточного лизата 53
2.2.1.3. Анионообменная хроматография как стадия «тонкой» очистки е7-бтш70 58
2.2.1.4. Концентрирование и перевод гибридных белков в буфер афи 62
2.2.2. Активная фармацевтическая субстанция 64
2.2.2.1. Фармацевтическая разработка афи 64
2.2.2.2. Контроль афи – спецификация, аналитические методики, валидация, анализы серий 75
2.2.2.3. Выбор первичной упаковки афи 76
2.2.2.4. Исследование стабильности афи 79
2.2.3. Готовая лекарственная форма 81
2.2.3.1. Фармацевтическая разработка глф 81
2.2.3.2. Вспомогательные вещества 86
2.2.3.3. Описание производственного процесса ГЛФ 92
2.2.3.4. Контроль глф – спецификация, аналитические методики 95
2.2.3.5. Выбор первичной упаковки глф 96
2.2.3.6. Исследования стабильности глф 100
2.2.4. Расчёт экономической эффективности производства 104
3. Обсуждение полученных результатов 111
4. Выводы 116
5. Практическое использование полученных результатов 117
6. Рекомендации по использованию научных выводов 118
7. Список использованной литературы 119
- Структура, функции и свойства онкобелков е7
- Растворы, реактивы
- Металл-хелат аффинная хроматография как стадия «захвата» гибридных белков из клеточного лизата
- Описание производственного процесса ГЛФ
Структура, функции и свойства онкобелков е7
Папилломавирусы человека, ВПЧ (Human Papillomavirus, HPV) — группа вирусов из рода папилломавирусов, рода А семейства паповирусов (Papovaviridae). Передаются только от человека к человеку, приводят к изменению характера роста эпителиальных тканей и образованию папиллом за счёт заражения базальных клеток эпидермиса. Дифференцирующие клетки шиповатого и зернистого слоёв эпидермиса выступают местом экспрессии белков и сборки вирусов [10]. Папилломавирусы представлены вирусами сферической формы, диаметром 52-55 нм, без суперкапсида. Капсид кубического типа симметрии состоит из 72 капсомеров. Геном вируса представлен кольцевидной замкнутой двухцепочечной ДНК с молекулярной массой 5 х 10-6 Да, образован приблизительно 8000 парами оснований, разделенных на 6 ранних генов (E, early), ответственных за репликацию, регуляцию транскрипции вирусного генома и трансформацию клеток, и 2 поздних (L, late) гена, контролирующих образование капсида, см. рисунок 2. Различия в последовательностях ранних и поздних генов обуславливают классификацию папилломавирусов. Рисунок 2. А - Структура генома вируса папилломы человека 16 типа. Ранние гены – Е1, Е2, Е4, Е5, Е6, Е7, поздние гены – L1, L2. Б, В – структура капсида ВПЧ.
Инфицирование половых органов и анальной области папилломавирусом несёт высокий риск развития доброкачественных и злокачественных неоплазий и проявляется в форме двух заболеваний – кондиломы и дисплазии, при этом, злокачественность неоплазий обусловлена свойствами ранних генов. Идентификация типа папилломавирусов в организме пациента позволяет установить клинический исход и определить наиболее эффективную терапию. Так, известно, что папилломавирусы 2 и 27 типов опосредуют появление «простых» бородавок, 6 и 11 типов связаны с незлокачественными папилломами и кондиломами аногенитальной области и гортани, а 16 и 18 типов – с карциномами. Другие типы ВПЧ также могут приводить к инвазивному раку или карциномам [11]. Несмотря на тот факт, что большинство злокачественных новообразований причисляют к полиэтиологическим заболеваниям, именно вирусным факторам онкогенеза придается особое значение. Патогенез рака шейки матки, рака полового члена, а также рака мочевого пузыря, по мнению многих авторов, связана с инфицированием именно папилломавирусом. В последние годы появилось множество информации о возможном участии ВПЧ в онкологической патологии лёгких. Литературные данные свидетельствуют, что два ранних гена Е6 и Е7 являются онкогенами, способными изменять клеточный цикл за счёт связывания с белками-супрессорами р53 и pRb. Показано, что прочность связывания и степень инактивации белков-супрессоров напрямую влияют на вероятность перевода незлокачественной папилломы в злокачественное новообразование. Продуктами экспрессия онкогенов Е6 и Е7 являются онкопротеины Е6 и Е7, играющие критическую роль в патогенезе опухолевого роста при инфицировании ВПЧ 16 и 18 типов и приводящие к подавлению механизмов иммунного контроля активности ВПЧ [12].
ВПЧ является одной из наиболее распространённых инфекций, передающихся половым путём, так, в мире ежегодно около 250 000 женщин умирает от рака шейки матки, что указывает на чрезвычайную важность поиска эффективных методов лечения инфекции [13] [14]
Стоит отметить, что ВПЧ поражает не только лиц из группы риска, но и большинство ведущих половую жизнь мужчин и женщин. Около 90% женщин заражаются папилломавирусом уже через два года после начала половой жизни, при этом, четверть из них заражаются даже при наличии одного постоянного партнера. У 99,7% женщин с гистологически подтвержденным диагнозом рака шейки матки диагностируют ВПЧ инфекцию [14]. Последние исследования подтверждают, что у 85% пациенток с кондиломами вульвы и промежности существуют признаки папилломавирусной инфекции во влагалище или на шейке матки. Более того, у 10-25% из них выявляются ассоциированные с ВПЧ заболевания – цервикальные интраэпителиальные неоплазии различной степени тяжести [11] [15]. Зачастую папилломавирусная инфекция сочетается с другими заболеваниями, передающимися половым путем [15]. Наиболее существенным являются бактериальный вагиноз, урогенитальный хламидиоз, микоплазмоз, цитомегаловирусная и герпетическая инфекции. Таким образом, среди наиболее значимых заболеваний урогенитального тракта, ассоциированных с ВПЧ, можно выделить: хронический эндоцервицит и вагинит, кондиломы шейки матки и наружних половых органов, цервикальные внутриэпителиальные неоплазии I, II и III типов, рак шейки матки (плоскоклеточный, аденокарцинома), внутриэпителиальные неоплазии вульвы и вагины I, II и III типов, а также интраэпителиальные неоплазии пениса, анальную интраэпителиальную неоплазию.
На настоящий момент не существует комплексной терапии пациентов с ВПЧ-ассоциированной инфекцией. Тем не менее, разработан ряд принципов, позволяющий достигать положительных результатов при лечении [16] [11].
Первый принцип можно определить, как «принцип деструкции», направленный на механическую обработку неопластических образований. «Принцип деструкции» основан на применении цитотоксических препаратов (подофиллин, подофиллотоксин, 5-фторурацил и др.), химической декструкции (трихлоруксусная кислота, солкодерм и др.) и физической деструкция (криодеструкция, лазеродеструкция, диатермокоагуляция, электрохирургический метод, фотодинамическая терапия).
Вторичный иммунодефицит, сопряжённый с развитием ВПЧ-инфекции обосновывает использование иммуномодуляторов различных групп и механизмов действия, лежащих в основе второго принципа терапии ассоциированных с ВПЧ заболеваний. Иммунобиологические препараты позволяют повысить эффективность терапии, снизить частоту рецидивов и ускорить элиминацию вируса из организма [17].
Растворы, реактивы
Очистку лизата проводили, принимая во внимание структурные гибридной молекулы, используя АТФ-аффинную и никель-хелат аффинную хроматографии. Чистота фракций элюата Е7(16)-БТШ70, собранных после очистки на металл-хелатной колоне, была оценена методом электрофореза с окрашиванием серебром в не восстанавливающих условиях (рисунок 8). Видно, что наряду с целевым белком, выявлены как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные примеси, вероятно, представленные продуктами олигомеризации мономера Е7(16)-БТШ70. Чистота мономера не превышала 70%. Результаты оценки чистоты элюатов, полученных после очистки на АТФ-аффинной колонне, схожи с полученными для металл хелатной (данные не приведены). Рисунок 8.Электрофореграмма фракции Е7(16)-БТШ70 после металл-хелат аффинной хроматографии. А – молекулярный маркер, Б – 10 мкг, В – 1000 нг, Г – 15 нг. Отмечены значения масс молекулярного маркера и массы целевой полосы Е7(16)-БТШ70.
Наличие большого количества низкомолекулярных примесей в хроматографических фракциях при очистке может быть обусловлено как крайней нестабильностью белка, приводящей к его деградации в растворе в ходе гидролиза, так и его склонностью к взаимодействию с короткими пептидами гидрофобной природы, способными накапливаться в лизате при дезинтеграции биомассы.
Примесный профиль был идентифицирован методом MS MALDI TOF. Для наработки образцов примесей использовался метод электрофореза в ПААГ с последующей окраской кумасси. Было установлено, что примесный профиль Е7(16)-БТШ70 представлен фрагментами целевого белка совместно с фрагментами белков штамма-продуцента. При идентификации пептидов, не соответствующих исходной аминокислотной последовательности Е7(16)-БТШ70, были обнаружены такие белки штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, как фактор элонгации трансляции 1-альфа (TEF1a), рибосомальные протеины L26bp и 33b, гликогенные ферменты дрожжей UGP1p, UTP1p и проч. Параметр достоверности превышал значение 87, результат был определен надежно (p 0.05). Для получения фракции мономера со степенью чистоты более 97% было решено использовать восстанавливающие агенты и проводить хроматографическую очистку в денатурирующих условиях, агенты добавляли в исходный материал. Контроль наличия мономера осуществляли методом эксклюзионной хроматографии, определяя отличия в профиле элюции исследуемых образцов. В предшествующих экспериментах было определено, что время удерживания пика соответствует диапазону от 31 до 32 минуты (данные не приведены). В эксперименте изучалось влияние следующих агентов: 30 мМ L-глутатион восстановленный, 30 мМ L-цистин, 0,01% полисорбат 80, 0,3% натрия лаурилсульфат, 40 мМ дитиотреитол, и их комбинаций. Результаты отражены на рисунке 9. Рисунок 9. Профиль элюции эксклюзионной ВЭЖХ Е7(16)-БТШ70, полученный при скрининге различных агентов. Чёрный – исходный образец, стандарт сравнения, Е7_БТШ70, розовый – L-глутатион восстановленный, зелёный – цистин, голубой – полисорбат 80, коричневый – SDS, синий – SDS+DTT. Показано, что практически полное восстановление мономера достигается парой SDS и DTT. Для оценки подлинности целевого белка, были собраны и проанализированы фракции элюата, предварительно обработанного SDS и DTT. Результаты контроля чистоты элюата приведены на рисунке 10. Рисунок 10. Профиль электрофоретического разделения элюента мономера Е7(16)-БТШ70. Слева направо: молекулярный маркёр, Е7-БТШ70 до разделения, элюент мономера Е7-БТШ70 с добавлением DTT.
Результат электрофоретического разделения показал, что предварительная обработка парой SDS+DTT приводит к значительному сокращению количества низкомолекулярных примесей и продуктов олигомеризации, позволяя добиться степени чистоты мономера равной 97,5%. В качестве дополнительных методов контроля полученной фракции Е7(16)-БТШ70 были использованы MS MALDI TOF, опция «пептидный фингерпринт» - определение аминокислотной последовательности искомого белка и иммуноблоттинг с окраской специфичными к Е7 и БТШ70 антителами - оценки подлинности. Элюат мономера подвергли триптическому гидролизу, после чего сняли масс-спектр. Спектрограмма триптического гидролизата Е7(16)-БТШ70 представлена на рисунке 11. В качестве критериев достоверности опции «пептидный фингерпринт» были выбраны следующие: количество «совпавших» пептидов в предположении одного белка, перекрывание «совпавшими» пептидами последовательности белка, паттерны протеолиза.
Металл-хелат аффинная хроматография как стадия «захвата» гибридных белков из клеточного лизата
Для приготовления вакцины объёмом 10 мл к объёму адъюванта, рассчитанного так, чтобы конечное значение концентрации составляло 0,8 мг/мл, добавляли субстанции Е7(16)-БТШ70 и субстанции Е7(18)БТШ70 до достижения концентраций действующих веществ величины 0,2 мг/мл, после чего объём вакцины доводили буфером до 10 мл. После внесения компонентов вакцину помещали на перемешивание при 2-8 оС в течение 60 минут при скорости перемешивания 300 об/мин. На основании проведённых исследований было подобранно массовое соотношение «Е7(16)-БТШ70 / Е7(18)-БТШ70 / адъювант», составляющее «1 / 1 / 4». Массовая доза гидроокиси алюминия, определённая для введения в состав вакцины, укладывается в нормы, определённые FDA (0,85 мг алюминия/доза) [105] и WHO (1,25 мг алюминия/доза) [106].
Для приготовления вакцины с адъювантом Титер Макс ГолдTM объёмом 10 мл к 5 мл адъюванта добавляли объёмы субстанции Е7(16)-БТШ70 и субстанции Е7(18)-БТШ70 до достижения концентраций действующих веществ величины 0,2 мг/мл, после чего объём вакцины доводили буфером до 10 мл. Перемешивание производили в стерильной стеклянной ёмкости в течение 10 минут при скорости 300 об/мин. В соответствии с рекомендациями производителя объём адъюванта составлял 50% от конечного объёма вакцины. Количество свободного и связанного адъювантом белка не оценивалось.
Для приготовления вакцины с адъювантом АдъюплексTM объёмом 10 мл к 2 мл адъюванта добавляли объёмы субстанции (Е7(16)-БТШ70 и субстанции Е7(18)-БТШ70 до достижения концентраций действующих веществ величины 0,2 мг/мл, после чего доводили объём вакцины буфером до 10 мл. После внесения компонентов вакцину помещали на перемешивание в течение 10 минут при скорости перемешивания 300 об/мин. В соответствии с рекомендациями производителя объём адъюванта составлял 20% от конечного объёма вакцины. Количество свободного и связанного адъювантом белка не оценивалось.
В сравнительном исследовании иммунологических свойств белков Е7-БТШ70 и их комбинаций с адъювантами, направленном на обоснование введения в состав вакцины адъювантов, проводили однократную иммунизацию мышей линии С57BL/6, описание исследуемых композиций приведено в таблице 10. Помимо трёх серий с адъювантами для иммунизации использовали растворы белков и гидроокиси алюминия.
Анализ экспрессии поверхностных и внутриклеточных факторов проводили при помощи маркеров, представленных комбинированными и индивидуальными антителами. Маркёр F4/80 является общим маркером моноцитов [107], расширение этого фенотипа до CD14/F4/80 позволяет охарактеризовать моноциты, прошедшие окончательную дифференцировку [108]. Постоянство уровня моноцитов может использоваться как подтверждение отсутствия воспалительных процессов. Фенотипы CD8 и CD4 являются классическими для цитотоксических Т-лифоцитов и Т-хелперов соответственно [109]. Колебания их численности характеризуют «клеточную» или «гуморальную» форму иммунного ответа. CD4/IFN – маркёр, характеризующий фенотип субпопуляции T-хелперов первого типа, стимулирующий клеточные факторы специфического и неспецифического иммунитета, основным выделяемым цитокином является интерферон гамма [110]. Фенотип CD3/NK1.1 характеризует активированные NK-клетки, осуществляющие стимуляцию клеточного звена иммунитета [111]. CD16/CD32 характеризует способность клеток к межклеточной кооперации в иммунном ответе [112]. Терапевтическая вакцина для лечения заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 16 и 18 типов, должна обеспечивать стимуляцию Т-клеточного иммунитета в отношении онкобелка Е7, направленную на подавление уже присутствующей в организме инфекции и элиминацию вируса из организма. Таким образом, активация макрофагов, натуральных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также образование цитокинов являются ключевыми показателями при оценке иммуногенности вакцины [113].
Определено, что несмотря на значительную экспрессию Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и гамма интерферона в селезёнке, приходящуюся на 14 сутки после введения, раствор белков без адъюванта не способен обеспечить стимуляцию продолжительного иммунного ответа, демонстрируя низкие показатели при контроле на 21 сутки (рисунок 22). Фармакодинамический эффект, достигаемый при введении раствора гидроокиси алюминия, также является непродолжительным. На этом фоне, сорбция Е7-БТШ70 на гидроокись алюминия обеспечивает выраженную стимуляцию клеточного звена иммунитета вплоть до 21 суток, включая основные маркеры CD14/F4/80, CD8, CD3/NK1.1 и CD4/IFN, в то время как композиции, содержащие Адъюплекс и ТитерМакс Голд, не способны стимулировать экспрессию цитотоксических Т-лимфоцитов, обладая низкими значениями также по остальным исследуемым показателям.
Описание производственного процесса ГЛФ
В научной литературе имеется ряд информации о способах получения и изучении иммуногенности гибридных белков Е7-БТШ70, однако, наряду с проблемами низкой продуктивности при культивировании в E. Coli, авторы не приводят подробной информации по способам очистки целевых белков и не освещают особенности их последующей стабилизации в растворе. Стабильных фармацевтических субстанций и готовых форм с действующими веществами Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70 на сегодняшний день не разработано. По этой причине разработка технологии очистки, а также получение композиционного состава АФИ и ГЛФ, обеспечивающего стабильность белков при хранении, являются актуальным задачами.
На начальном этапе разработки технологии хроматографической очистки гибридных белков Е7-БТШ70 использовали аффинную хроматографию. Чистота целевых фракций после очистки с использованием аффинных сорбентов не превышала 70%, демонстрируя наличие как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных примесей. Было определено, что при приблизительно одинаковом количестве олигомеров в целевых фракциях, IMAC Sepharose FF обладает большей эффективностью при удалении низкомолекулярных примесей.
Идентификация примесного профиля показала, что низкомолекулярные примеси представлены продуктами деградации целевого белка и фрагментами белков штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, высокомолекулярные примеси – это продукты олигомеризации Е7-БТШ70. Наличие примесных пептидов может быть обусловлено шаперонной активностью онкопротеина Е7 и белка теплового шока 70. Результаты хроматографической очистки, полученные при использовании SDS и DTT, доказали повышенную склонность Е7-БТШ70 к олигомеризации и образованию межмолекулярных взаимодействий с низкомолекулярными белками. На этом основании, при дальнейшей оптимизации очистки гибридных белков было решено тестировать влияние диссоциирующих и хаотропных агентов. Для удаления дисульфидных «мостиков» тестировали восстанавливающие агенты: восстановленный L-глутатион (GSH), дитиотреитол (DTT) и цистин; для устранения нежелательных гидрофобных взаимодействий применяли мочевину.
Оптимизация компонентного состава буферных растворов на стадии «захвата» белка металл-хелат аффинной хроматографией путём введения в состав буферных растворов глутатиона и глицерина позволила увеличить чистоту целевых форм Е7-БТШ70 на 15% по сравнению с результатами, полученными при использовании исходных буферных растворов. Для дополнительной очистки использовали анионообменную хроматографию. Сравнение результатов очистки продемонстрировало лучшую разрешающую способность между целевым и примесными пиками для сорбента Q HP Sepharose. Показано, что использование буферных растворов VHP Q A2 и B2 позволяет увеличить чистоту целевого белка до 90% при остаточном количестве олигомеров, не превышающем 6%.
Для увеличения степени чистоты материала было решено подвергнуть его доочистке на этом же сорбенте при пониженных значениях рН. Было определено, что при значении рН буферных растворов равном 5.0, практически все примесные белки переходят в нулевой объём, чистота суммарной целевой фракции составляет более 95%, приблизительное содержание олигомеров - 4%. Для перевода Е7-БТШ70 в буфер хранения проводили концентрирование на Q HP Sepharose с последующим использованием гель-фильтрационной ВЭЖХ на сорбенте Superdex 200. Дальнейшая задача, заключалась в определении композиционного состава субстанций Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70, гарантирующих стабильность белков при хранении. В ходе изучения стабильности белков Е7-БТШ70 в растворе было показано, что значения рН, выходящие из диапазона 6.8-7.4 негативно влияют на стабильность белков, провоцируя протекание процессов гидролиза, приводящих к образованию низкомолекулярных примесей. Комбинация 50 мг/мл сахарозы и 0,005 мг/мл полисорбата 80, позволила получить стабильные АФИ, сохраняющие показатели качества в пределах спецификации в течение 12 месяцев при хранении на -20 оС. Выбранные ВВ являются безвредными в предложенных концентрациях, обеспечивают стабильность действующих веществ и допущены к применению в парентеральных препаратах рядом международных регуляторов. Долгосрочные испытания показали, что компонентный состав, определённый для АФИ Е7(16)-БТШ70, подходит и субстанции белка Е7(18)-БТШ70, подтверждая близость их физико-химических свойств.
В качестве первичной упаковки использовали стерильные пластиковые контейнеры из полиэтилентерефталат-гликоля номинальным объёмом 5, 30 и 250 мл с крышкой из полиэтилена высокой плотности производства Nalgene. Соответствие требованиям нормативных документов, устойчивость контейнеров к замораживанию, наряду данными по стабильности обосновывают использование контейнеров ПЭТФ в качестве первичной упаковки АФИ 16 и 18 типов.
При разработке компонентного состава ГЛФ было решено взять за основу ранее разработанный состав АФИ, как обеспечивающий стабильное хранение гибридных белков. В иммунологических экспериментах тестировали три адъюванта – гидроокись алюминия, АдъюплексTM и Титер Макс ГолдTM. В сорбционных экспериментах было показано, что при достижении соотношения «1,3/1» и более, белок полностью сорбируется на гидроокись алюминия. В сравнительном исследовании иммунологических свойств белков Е7-БТШ70 и их комбинаций с адъювантами, направленном на обоснование введения в состав вакцины адъювантов, проводили однократную иммунизацию мышей линии С57BL/6. Определено, что несмотря на значительную экспрессию Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и гамма интерферона в селезёнке, приходящуюся на 14 сутки после введения, раствор белков без адъюванта не способен обеспечить стимуляцию продолжительного иммунного ответа, демонстрируя низкие показатели при контроле на 21 сутки . Фармакодинамический эффект, достигаемый при введении раствора гидроокиси алюминия, также является непродолжительным. На этом фоне, сорбция Е7-БТШ70 на гидроокись алюминия обеспечивает выраженную стимуляцию клеточного звена иммунитета вплоть до 21 суток, включая основные исследуемые маркеры.Композиции, содержащие Адъюплекс и ТитерМакс Голд, не способны стимулировать экспрессию цитотоксических Т-лимфоцитов, обладая низкими значениями также и по остальным исследуемым показателям. Полученные результаты послужили основанием для введения в состав вакцины адъюванта гидроокиси алюминия в содержании 400 мкг/доза.
Для фасовки ГЛФ были выбраны стеклянные вакцинные шприцы предварительного наполнения с длиной иглы 1" и диаметром иглы 25G, в качестве элемента укупорки использовали эластомерный плунжер с полистироловым поршнем. Наиболее совместимой с различными возрастными категориями пациентов является игла длиной 1". Диаметр 25G, наибольший из рекомендованных для в/м вакцинации, обеспечивает надлежащее введение сорбированных препаратов широким возрастным группам. Все компоненты первичной упаковки ГЛФ соответствуют требованиям текущих версий USP, EP и JP.
В соответствии с разработанным проектом ФСП на вакцину было проведено исследование стабильности трёх опытно-промышленных серий по всем показателям ФСП. Установлено, что все показатели качества трёх серий вакцины соответствуют требованиям НД на протяжении всего срока хранения с продлением до трёх месяцев при хранении на заявленной температуре 2-8 оС, что подтверждает стабильность вакцины.