Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 10
1.1. Гидрогеназы: строение, свойства, функции .10
1.1.1. Роль гидрогеназ in vivo. 11
1.1.2. Классификация гидрогеназ на основе строения активного центра
1.1.2.1. [Fe]-гидрогеназы .19
1.1.2.2. [FeFe]- гидрогеназы .20
1.1.2.3. [NiFe]- гидрогеназы
1.1.2.3.1. Строение [NiFe]- гидрогеназ 23
1.1.2.3.2. Активный центр. Каталитический цикл 27
1.1.2.3.3. Инактивация гидрогеназ .29
1.2. Гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina BBS 32
1.2.1. Общая характеристика Thiocapsa roseopersicina BBS 32
1.2.2. Гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina BBS
1.2.2.1. HupSL-гидрогеназа 35
1.2.2.2. HupUV-гидрогеназа 36
1.2.2.3. Hox 1-гидрогеназа 37
1.2.2.4. Hox 2-гидрогеназа 38
1.2.2.5. HynSL-гидрогеназа 39
1.2.3. Созревание гидрогеназ в Thiocapsa roseopersicina 41
1.3. Биосенсоры 42
1.3.1 Общие принципы строения 42
1.3.2. Преобразователи сигнала 43
1.3.3. Чувствительные (распознающие) элементы 45
1.3.4. Ферментные электрохимические сенсоры
1.3.4.1. Прямой и медиаторный биоэлектрокатализ 49
1.3.4.2. Методы иммобилизации ферментов 51
Материалы и методы .57
2.1. Культуры микроорганизмов 57
2.1. Культивирование микроорганизмов
2.3. Получение биомассы 58
2.4. Газовая хроматография 58
2.5. Определение видовой принадлежности микроорганизмов 59 2.6. Методы долговременного хранения T. roseopersicina 60
2.6.1. Лиофилизация 60
2.6.2. Тест на ускоренное хранение 61
2.6.3. Хранение при низких температурах (-80С) 2.7. Выделение и очистка гидрогеназы 63
2.8. Измерение гидрогеназной активности .65
2.9. Изготовление ферментных электродов 65
2.10. Электрохимические измерения 66
3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Определение видовой пренадлежности 68
3.2. Культивирование штамма-продуцента .68
3.3. Долговременное хранение T. roseopersicina BBS .
3.3.1. Хранение T. roseopersicina при низких температурах (-80С). 71
3.3.2. Лиофильное высушивание T. roseopersicina 73
3.3.2.1. Прогнозирование сроков хранения культуры. 75
3.3.2.2. Оценка гидрогеназной активности клеток после хранения культуры в лиофилизированном виде. 80
3.4. Выделение и очистка гидрогеназы из T. roseopersicina BBS 80
3.5. Оценка электрохимических характеристик ферментного электрода на основе гидрогеназы T.roseopersicina BBS .88
3.5.1. Метод электрохимических измерений 88
3.5.2. Кинетические характеристики катализа иммобилизованной на электрод гидрогеназой .90
3.5.3. Биоэлектрокатализ гидрогеназами в присутствии промотора – нейтрального красного .93
3.5.4. Электрохимическе характеристики электрода с иммобилизованной гидрогеназой, полученной по модифицированной схеме очистки 94
3.5.5. Исследование зависимости электрохимических характеристик ферментных электродов от парциального давления водорода .95
3.5.6. Влияние метана и двуокиси углерода на электрохимическую активность гидрогеназных электродов .100
3.5.7. Измерение водорода непосредственно в среде культивирования микроорганизмов .105
Заключение 109
Выводы 113
Список литературы .114
Благодарности
- Классификация гидрогеназ на основе строения активного центра
- Культивирование микроорганизмов
- Долговременное хранение T. roseopersicina BBS
- Биоэлектрокатализ гидрогеназами в присутствии промотора – нейтрального красного
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время все более широкое распространение получают сенсоры, в качестве распознающего элемента которых выступает биологический объект. Их действие основано на важнейших химических реакциях живых организмов: антитело/антиген, фермент/субстрат, рецептор/гормон. Поскольку данные реакции высокоспецифичны, указанные сенсоры крайне чувствительны и селективны. Чаще всего в качестве чувствительных элементов сенсоров используют ферменты. Для таких сенсоров могут быть использованы преобразователи различных типов (Evtugyn, 2014), но в большей части выпускаемых в промышленности биосенсоров в настоящее время используют электрохимические преобразователи, что обусловлено их невысокой стоимостью, простотой изготовления и использования (Эггинс, 2005).
Возможность применения фермента в качестве чувствительного элемента биосенсора определяют его доступность (простота и дешевизна выделения и очистки), стабильность при хранении и иммобилизации, наличие удобных для аппаратурного оформления способов регистрации сигнала, достигаемые аналитические характеристики определения субстрата либо эффектора. Поэтому для создания сенсора необходима комплексная работа по оптимизации всех указанных этапов.
В качестве чувствительного элемента для детекции водорода может быть использован фермент гидрогеназа, который in vivo отвечает за образование/поглощение водорода клетками. Хотя гидрогеназы катализируют довольно простую реакцию, однако она используется в различных метаболических путях у широкого спектра микроорганизмов (Vignais, Billoud, 2007). В последние десятилетия все больше возрастает интерес к гидрогеназам, наблюдается значительный прогресс в изучении данной группы ферментов. Понимание строения, функционирования и их роли в клетке помимо фундаментального значения имеет и практическую значимость. Поскольку данные ферменты принимают активное участие в процессе анаэробной коррозии, то их изучение будет способствовать борьбе с этим процессом. Также открываются все новые возможности практического применения гидрогеназ, в числе которых можно выделить следующие: образование водорода в фотокаталитических системах, получение энергии в топливных элементах за счет использования гидрогеназных электродов, очистка сточных вод, зараженных тяжелыми металлами, регенерации кофакторов, биосинтез химических веществ, меченных дейтерием или тритием (Гоготов и др., 2010).
HynSL гидрогеназа пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina BBS в
последние годы привлекает к себе внимание биотехнологов в связи со своей
стабильностью. Данный фермент с широким температурным диапазоном вплоть до 80С
(Gogotov et al., 1978) способен к катализу в присутствии О2 (Morozov et al., 2006), в сравнении с платиной более устойчив к действию таких каталитических ядов, как сероводород и угарный газ (Зорин и др., 1986), хорошо иммобилизуется. Исходя из вышеуказанных характеристик, данный фермент перспективен для использования в качестве чувствительного элемента биосенсора.
Таким образом, в качестве чувствительного элемента в сенсорах на водород может выступать фермент. Современные технологии изготовления электрохимических сенсоров, в частности трафаретная печать, дают возможность миниатюризировать сенсорные структуры, а также менять форму и материал основы, варьируя их в зависимости от потребностей заказчика.
Цель работы состояла в создании научных основ технологии получения электрохимических биосенсоров на основе гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina BBS.
Задачи:
-
Разработать и оптимизировать условия культивирования штамма-продуцента Thiocapsa roseopersicina BBS.
-
Подобрать методы и условия для долговременного хранения T. roseopersicina BBS.
-
Оценить выживаемость T. roseopersicina BBS в лиофилизированной форме с применением кинетического аппарата (тест на ускоренное хранение).
-
Выделить чистый препарат HynSL гидрогеназы из T. roseopersicina BBS для дальнейшего использования в качестве сенсорного элемента на водород.
-
Создать с использованием выделенного фермента комбинированную сенсорную систему.
-
Исследовать возможность прямого анализа H2 в среде культивирования с применением разработанного электрохимического биосенсора.
Научная новизна. Оптимизированная схема лиофильного высушивания позволила получить сублимированный препарат с высокой выживаемостью пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina BBS, при том, что лиофилизация считается непригодной для хранения данной группы микроорганизмов. Показано соответствие кинетической модели выживаемости микроорганизмов экспериментальным данным, что позволило прогнозировать сроки хранения лиофилизированной культуры. Предложена модифицированная схема очистки гидрогеназы T. roseopersicina BBS, исключающая использование на последней стадии препаративного электрофореза, что дает возможность масштабировать выделение фермента с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием показанных носителей. Показана
принципиальная возможность использования гидрогеназного электрода на основе HynSL
гидрогеназы T. roseopersicina BBS в качестве сенсора на водород. Разработана технология
измерения Н2 в двух режимах - потенциометрическом и амперометрическом. Установлено
отсутствие влияния двуокиси углерода и метана на работу сенсора. Разработаны
технологические операции для анализа водорода непосредственно в среде
культивирования микроорганизмов.
Практическая значимость работы. Разработанные технологические операции
культивирования Thiocapsa roseopersicina BBS и выделения гидрогеназы из данного
микроорганизма позволяют снизить стоимость получения фермента. Оптимизированная
методика лиофильного высушивания может быть использована для длительного хранения
родственных групп микроорганизмов, поскольку является более экономичной в сравнении
с рекомендуемой для пурпурных серных бактерий криоконсервацией. Разработанные
научные основы технологии производства водородных биосенсоров в дальнейшем могут
быть использованы для производства сенсоров, используемых в различных сферах
деятельности человека, таких как медицина (детекция концентрации водорода в
выдыхаемом воздухе, как показатель состояния желудочно-кишечного тракта),
биотехнология (детекция образования биоводорода, контроль состояния сообщества
метантенков), научные исследования, промышленная безопасность (контроль
довзрывоопасных концентраций водорода в рабочих помещениях) и т.п.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на VIII всероссийской научной молодежной школе с международным участием «Возобновляемые источники энергии» (Москва, 2012), на Международном форуме Reenfor-2013 «Возобновляемая энергетика. Пути повышения энергетической и экономической эффективности» (Москва, 2013), на XXVII зимней молодежной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2015), на XXII и XXIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2015, 2016), на 7-й международной конференции «Photosynthesis Research for Sustainability» (Пущино, 2016).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения полученных данных, заключения, выводов, приложения. Список литературы включает 254 источник, 216 из которых англоязычные. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 6 таблицами.
Классификация гидрогеназ на основе строения активного центра
Данный тип гидрогеназ был открыт позже других и в данный момент несколько хуже изучен. Несколько лет назад считалось, что гидрогеназы такого типа не содержат атомов металла в активном центре, поэтому их называли «неметаллическими» (Berkessel, 2001). В настоящее время показано, что ферменты этой группы представляют собой гомодимер, который содержит атом железа в активном центре (рис. 3), но не содержит FeS- кластеров (Shima, Thauer, 2007). Fe представляет собой каталитически активную составляющую железо-гуанилил-пиридинолового кофактора (Iron-Guanylyl Pyridinol Cofactor; FE9). Кофактор может быть отделен при денатурации фермента в присутствии меркаптоэтанола, он чувствителен к воздействию света и температуры, что препятствует получению его в чистом виде (Lyon et al., 2004). Атом железа в кофакторе соединен с двумя СО-лигандами, ацильной группы пиридинола, атомом азота цистеина и одним неустановленным лигандом (Stiebritz, Reiher, 2012). Предположительно шестая координационная позиция предназначена для связи с Н2 и его конкурентным ингибитором CO (Shima et al., 2008).
Данные тип гидрогеназ участвует в одном из этапов восстановления углекислоты до метана. Эти цитоплазматические гидрогеназы обнаружены только у представителей домена архей, у которых они синтезируются лишь в условиях недостатка никеля (Thauer, 1998; Shima, Thauer, 2007). [FeFe]- гидрогеназы. [FeFe]- гидрогеназы в отличие от двух других классов гидрогеназ, которые обычно представляют собой димеры, могут иметь различное количество субъединиц. Описаны ферменты, состоящие из одной, двух, трех и четырех субъединиц (Meyer, 2007). Для данной группы характерны высокая чувствительность к кислороду и высокая каталитическая активность. Это единственные гидрогеназы, найденные у эукариотических организмов (Adams, 1990; Vignais, Colbeau, 2004).
Все изученные к настоящему времени [FeFe]-гидрогеназы имеют схожую архитектуру. Для них характерно модульное строение, они состоят из активного сайта (Н-кластера) и вспомогательных FeS-кластеров, иначе F-кластеров (Vignais et al., 2001). Крайне консервативным являются 3 участка Н-кластера - 3 мотива, обозначенных как L1 (TSCCPxW), L2 (MPCxxKxxE), and L3 (ExMACxxGCxxGGGxP). По этим трем мотивам легко идентифицировать [FeFe]- гидрогеназы и отличать их от сиквенсов HydA гомологов (Mulder et al., 2011). В активном сайте ферментов данного типа находится 6 атомов железа: нестандартный 2Fe кластер соединен с типичным [4Fe-4S]-кластером с помощью цистеинового лиганда, соединенного с белком (Vignais et al., 2001). Каждый атом железа в этом кластере координирован терминально расположенными CN и СО лигандами. Атомы железа связаны между собой дитиолатом (стандартно 1,3-пропандитиолат -SCH2CH2CH2S-, либо 1,3-дитиолометиламин -SCH2NHCH2S-, Nicolet et al., 2001). Третий СО лиганд либо соединяет 2 атома железа, либо соединен терминально с дистальным атомом железа. Предполагают, что его позиция зависит от редокс-состояния 2Fe-кластера. Два атома железа часто обозначают как проксимальный и дистальный (относительно [4Fe-4S]-кластера и белкового остова (Siegbahn et al., 2007). При инкубировании фермента в атмосфере угарного газа дополнительный СО лиганд присоединеняется к вакантному координационному сайту дистального атома железа, что приводит к инактивации фермента (Lemon, Peters, 2001). Предположительно, этот координационный сайт является местом связывания водорода либо протона (Vignais, Billoud, 2007). Активный сайт, погруженный вглубь молекулы, соединен с поверхностью с помощью гидрофобных каналов (Vignais, Colbeau, 2004).
Самые значительные различия в строении [FeFe]-гидрогеназ проявляются в организации вспомогательных FeS–кластеров, которые, предположительно, играют роль в регуляции переноса электронов к и/или от Н-кластера (Mulder et al., 2011). Наиболее просто устроенные ферменты, которые не содержат доменов с F-кластерами, а только Н-кластер, были обнаружены у некоторых водорослей, включая Chlamydomonas reinhardti, Scenedesmus obliquus (Florin et al., 2001; Happe, Kaminski, 2002; Forestier et al., 2003). Показано, что вспомогательные домены [FeFe]-гидрогеназ состоят из одного или комбинации следующих типов (Mulder et al., 2011): 1. Два [4Fe-4S]-домена, схожих по строению с бактериальным ферредоксином. 2. Короткий домен, содержащий [4Fe-4S]-кластер с лигандами: 3 цистеина и гистидин. 3. Схожий с ферредоксином растений [2Fe-2S]-содержащий домен. 4. Тиоредоксин-подобный [2Fe-2S]-содержащий домен, гомологичный NuoE-субъединице NADH: убихинон-оксидоредуктазы. У разных [FeFe]-гидрогеназ наблюдают различные комбинации данных «модулей» (рис. 4). В настоящее время предложена классификация [FeFe]-гидрогеназ, основанная на строении F-кластеров (Meyer, 2007). Физиологическая роль различных комбинаций пока не совсем понятна. Известно, что фермент может проявлять активность и взаимодействовать с ферредоксинами и без F-кластеров, поскольку есть подобные, содержащие только Н-кластер, гидрогеназы водрослей и получены ферменты путем трансгенных делеций F-кластерных доменов (King et al., 2006). Можно предположить, что различные конфигурации данных доменов дают возможность проводить специфические метаболические взаимодействия, иметь определенное внутриклеточное положение, взаимодействовать с редокс-партнером (Mulder et al., 2011). Однако на данный момент мало данных, подтверждающих это предположение.
Культивирование микроорганизмов
В ферментных электрохимических сенсорах используется явление биоэлектрокатализа – использования ферментов для ускорения электродных процессов, поскольку скорость ферментативного превращения веществ значительно выше электрохимического (Дамаскин, Петрий, 1987). Соответственно, по способу передачи электрона с активного центра фермента на электрод выделяют прямой и медиаторный биоэлектрокатализ.
Далеко не все ферменты способны передавать электроны непосредственно на электрод (прямой биоэлектрокатализ), что обусловлено большим расстоянием между редокс-активным центром и электродом. Для детекции сигнала от таких ферментов с помощью электрохимических методов перспективно использовать медиаторы (Chaubey, Malhotra, 2002; Silveira, Almeida, 2013). Под медиатором понимается низкомолекулярная редокс-пара, которая переносит электроны от редокс-центра фермента к поверхности индикаторного электрода. В каталитическом цикле медиатор сначала реагирует с восстановленным ферментом и затем диффундирует к поверхности электрода, где подвергается быстрой электрохимической реакции с переносом заряда (Биосенсоры..., 1992). В качестве медиаторов могут выступать природные и синтетические соединения, такие как небольшие белки, например цитохромы, ряд коферментов (НАДН, ФАДН2 и др), редокс-красители, органические и неорганические молекулы и ионы (Биосенсоры..., 1992; Silveira, Almeida, 2013). Для эффективного выполнения своих функций медиаторы должны обладать рядом свойств (Chaubey, Malhotra, 2002) : 1. быстро реагировать с ферментом; 2. электрохимическое превращение медиатора должно быть быстрым и обратимым; 3. разница редокс потенциалов медиатора и редокс-активной группы в активном центре фермента не должна быть чрезвычайно высокой; 4. медиатор должен быть устойчив как в окисленной, так и в восстановленной формах; 5. восстановленный медиатор не должен окисляться кислородом; Медиаторы могут находиться в растворе, могут быть иммобилизованы вместе с ферментами на электроде (Chaubey, Malhotra, 2002; Moyo et al., 2012; Silveira, Almeida, 2013). Для иммобилизации могут быть использованы различные методы, ниже они будут рассмотрены подробнее.
Использование медиаторов в биосенсорах дает ряд преимуществ (Chaubey, Malhotra, 2002): 1. Измерения меньше зависят от концентрации кислорода; 2. Рабочий потенциал ферментного электрода определяется окислительным потенциалом медиатора; 3. При использовании медиатора с низким значением окислительного потенциала, можно избежать влияния многих нежелательных соединений; 4. Если окисление или восстановление медиатора не связано с протонами, то на работу такого ферментного электрода до определенной степени не должен влиять рН среды;
Для гидрогеназ показано, что ввиду низкого равновесного потенциала самой реакции, фермент способен восстанавливать большое число медиаторов, например: метилвиологен, бензилвиологен, НАДН, НАДФН, ферри/ферроцианид. Кроме того, в качестве медиатора возможно использовать цитохром с?, (Кондратьева, Гоготов, 1981). Наиболее применимым из этих медиаторов является метилвиологен (N,N -диметил-у,у -дипиридил, Yagi et al., 1975).
Явление прямого биоэлектрокатализа впервые было продемонстрировано сравнительно недавно, в 80-х годах двадцатого века. Несколько групп ученых независимо, примерно в одно время опубликовали работы, в которых сообщалось о способности лакказы и цитохрома с напрямую переносить электроны на электрод (Eddowes, Hill, 1977; Yeh, Kuwana, 1977; Березин и др., 1978). В одной из первых работ в этой области такая же возможность была показана и для гидрогеназы (Yaropolov et al., 1984). В настоящее время способность к прямому биоэлектрокатализу была показана для целого ряда ферментов таких как лакказы, пероксидазы, каталазы, оксидазы (Ferapontova et al., 2005).
Хотя на данный момент в литературе можно встретить много примеров, все же способность к прямому переносу электронов характерна для небольшого количества ферментов. Долгое время такой процесс вообще считали невозможным (Frew, Hill, 1988; Silveira, Almeida, 2013). Одна из главных причин кроется в строении молекулы ферментов, потому как активный центр большинства из них расположен внутри глобулы полипептида. В таком случае передача электрона напрямую к электроду и от него невозможна без значительных изменений в конформации (Wollenberger et al., 2008). Для прямого переноса редокс-активный центр должен быть расположен близко к поверхности белковой глобулы, либо у фермента должна быть система переноса электронов от активного центра к поверхности пептида. Так у гидрогеназ электроны передаются от активного центра на электрод через систему Fe-S-кластеров (Vignais, Billoud, 2007). Ферменты, способные к прямому биолектрокатализу, в клетке участвуют в путях переноса электронов. Строение таких ферментов предполагает передачу электрона от активного центра на редокс-активный центр другой молекулы (Ferapontova et al., 2005; Wollenberger et al., 2008).
Другой из причин, по которой явление прямого биоэлектрокатализа было продемонстрировано сравнительно недавно, является тот факт, что для эффективного его протекания требуется постоянное и надежное взаимодействие между электродом и ферментом. Эффективность прямого биоэлектрокатализа для растворенных молекул ферментов, как правило, низкая. Это объясняется крайне низкой скоростью диффузии биомолекул к поверхности электрода и значительными стерическими затруднениями (Frew, Hill, 1988). В тоже время процесс иммобилизации может негативно сказаться на активности и стабильности фермента за счет изменения его трехмерной структуры и резкого ограничения подвижности. Проблемы также могут возникнуть в случае непрочного и нестабильного связывания ферментов с поверхностью, их денатурации на электроде, неправильной ориентации при иммобилизации (Frew, Hill, 1988; Ferapontova et al., 2005; Secundo, 2013). Ориентация фермента на поверхности электрода крайне важна, поскольку для прямой передачи электрона фермент должен быть ориентирован редокс-активным центром к поверхности электрода. Структура поверхности электрода и состав раствора, в который он будет погружен, также играют роль (Frew, Hill, 1988).
Долговременное хранение T. roseopersicina BBS
На рисунке 32 представлена зависимость S/V от S, прямая отсекает на оси х отрезок – Km. Концентрацию Н2 в жидкости рассчитывали при помощи закона Генри. Из графика получаем Кm(каж)=0,09 мМ Н2, что соответствует 12% смеси подаваемой газовой смеси. Для растворенной гидрогеназы из T. roseopersicina BBS рассчитана Кm по метилвиологену, он составляет 1,6 10-3М (Карякин и др., 1984). Таким образом, полученное нами значение для иммобилизованного фермента в 18 раз больше Кm для растворенного фермента. Это может быть связано как с ограничениями в подвижности самого фермента при иммобилизации, проблемами при передаче электронов с дистального FeS-кластера на электрод, а также свойствами самого электрода, т.е. в нашем случае свойствами углеродной ткани.
В работах (Qian et al., 2002; Lutz, Fan, 2005) были также предложены модели датчиков на водород, на основе фермента гидрогеназы. Куайн с соавторами (Qian et al., 2002) иммобилизовали фермент между двумя слоями монтмориллонитовой глины с включенным полибутилвиологеном, которые были закреплены на стеклоуглеродном электроде. Верхний слой глины был покрыт целлюлозной пористой мембраной. Электрод помещали в буферный раствор, содержащий 2 мМ метилвиологена. В данной системе и метилвиологен и полибутилвиологен участвовали в переносе электронов с фермента на стеклоуглеродный электрод. При исследовании влияния концентрации Н2 на силу тока получили линейную зависимость от 1% до 100% водорода. Но для измерений концентраций ниже 1%, по мнению авторов, требуется либо увеличить площадь электрода, либо создать систему с большей чувствительностью.
Еще в одной схеме (Lutz, Fan, 2005) сенсора на водород в раствор для измерений добавляли гидрогеназу из Ralstonia eutropha и бензилвиологен. При окислении Н2 гидрогеназа восстанавливает бензилвиологен, который детектируют электрохимически в потенциостатическом режиме. Необходимость добавлять в раствор фермент и переносчик ограничивает области применения такого датчика, а так же повышает расход фермента на каждое измерение.
Предлагаемая нами схема измерений, в которой строение электрода подразумевает непосредственную передачу электронов на электрод, имеет преимущество над вышеописанными аналогами. Фермент в такой системе находится в иммобилизованной форме, не требуется внесение медиаторов в раствор. В сравнении с описанным выше предложенный нами электрод имеет более простое устройство, его возможно миниатюризировать, в частности, используя технологию трафаретной печати (screen-printed электроды). Это дешевый и простой в исполнении метод обеспечивает простоту массового производства, высокую воспроизводимость получаемого продукта и низкую стоимость, что дает возможность одноразового применения (Couto et al., 2016). Трафаретная печать, или screen-printing – это метод печати графических изображений и текста на различных поверхностях при помощи специальной формы (трафарета). Краска наносится на трафарет, затем проникает сквозь него посредством механического воздействия, ложась на поверхность. В качестве материала подложки для трафаретной печати могут быть использованы различные материалы, такие как бумага, текстиль, металл, кожа, керамика и синтетические материалы (Hobby, 1997). При использовании печатного станка можно получить большие тиражи не отличающихся друг от друга по свойствам сенсорных структур. Пример сенсорной структуры, которую можно получить с помощью такой методики, представлен на рисунке 33. Преимуществом такой технологии также является возможность изменения форм и размера электродов и самой сенсорной структуры путем замены трафаретов для печатного станка, а также возможность использовать различные материалы подложки, электродов и изолятора. Все вышеуказанные параметры возможно подбирать исходя из потребностей измерений.
Поскольку ферментный электрод предполагается помещать непосредственно в среду культивирования микроорганизмов, необходимо исследовать влияние образуемых микроорганизмами метаболитов на его работу. Так платина, используемая в качестве чувствительного элемента в электрохимических датчиках, даёт отклик на другие соединения, выделяемые микроорганизмами либо отравляется ими. Платиновые катализаторы отравляются окисью углерода в концентрации более 0,01%, а при содержании угарного газа 0,1 % платиновый электрод необратимо теряет 99% своей активности за 10 минут (Igarashi et al., 1995), сероводород отравляет платину в 100 раз эффективнее СО (Karyakin et al., 2005). Одними из основных продуктов анаэробного микробного сообщества могут быть метан и углекислый газ. Для подтверждения предположения о том, что метан и двуокись углерода не влияют на работу гидрогеназного электрода, проверили возможность данных газов вызывать анодные токи и снижать значения токов окисления водорода.
Как видно из рисунка 34, в атмосфере водорода при заданном потенциале 100 мВ относительно потенциала разомкнутой цепи плотность тока составила 150 мкА/см2. При замене водорода на метан при том же значении потенциала анодных токов не наблюдали. Зависимость плотности тока от времени в атмосфере водорода и двуокиси углерода имеет аналогичный вид. При подаче в ячейку молекулярного водорода, при заданном потенциале 150 мВ относительно потенциала разомкнутой цепи, регистрировали 310 мкА/см2, при смене барботруемого газа с водорода на CO2 анодные токи отсутствовали (рис. 35). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что исследуемые газы не вызывают положительных откликов ферментного сенсора, ток при заданном потенциале обусловлен исключительно окислением водорода.
Биоэлектрокатализ гидрогеназами в присутствии промотора – нейтрального красного
В литературе крайне мало данных о лиофильном высушивании фототрофных микроорганизмов. Согласно (The Prokaryotes…, 2006; Bergey s…, 2009) пурпурные серные бактерии не переносят лиофилизацию. При этом существует ограниченное количество работ, в которых представители этой группы были успешно сохранены с помощью данной методики (Malik, 1990; Kupletskaya, Netrusov, 2011). Так в работе (Malik, 1990) был лиофильно высушен типовой штамм того же вида T. roseopersicina. Нам удалось добиться более высокой выживаемости культуры в сравнении с опубликованными данными (Malik, 1990) при использовании более простой методики. В работе был использован кинетический аппарат, позволивший оценить динамику выживаемости клеток в процессе хранения. Подобных работ в литературе для фототрофных микроорганизмов обнаружено не было. Показано соответствие скорости отмирания клеток теоретической модели при хранении в течение года, рассчитано, что при таких условиях лиофильного высушивания и исходной концентрации клеток непосредственно после лиофилизации (2±0,5)108 кл/мл после 10 лет хранения количество жизнеспособных клеток останется в пределах 104 – 103 кл/мл. Наши данные согласуются с данными (Kupletskaya, Netrusov, 2011), авторы показали, что пурпурную серную бактерию Allochromatium minutissimum можно хранить в лиофилизированной форме более 50 лет.
Выбранные и усовершенствованные методики выделения и очистки гидрогеназы позволили получить высокостабильный и активный препарат фермента с удельной активностью 38 и 43,3 мкмоль H2/мин мг белка. Установлена возможность замены конечной ступени очистки фермента – препаративного электрофореза на хроматофокусирование. Ранее было показано, что при использовании для изготовления электродов препаратов фермента, не прошедших эту стадию очистки, максимальная активность электродов была в 3 раза ниже (Воронин, 2010). В работе, заменив препаративный электрофорез на хроматофокусирование, получили функционирующий гидрогеназный электрод с активностью, сопоставимой с активностью электродов, полученных на основе ферментного препарата, прошедшего стадию электрофореза. Резюмируя, можно заключить, что очистку фермента возможно масштабировать, используя препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию (Динариева и др., 2015).
В нашей работе мы модифицировали систему очистки белка и не использовали препаративный электрофорез. При этом (см. раздел 3.5.4.) мы получили функционирующий гидрогеназный электрод с активностью, сопоставимой с активностью электродов, полученных на основе стандартного метода очистки гидрогеназы (с препаративным электрофорезом).
Большинство выпускаемых на сегодняшний день датчиков на водород применяются для мониторинга состава воздуха промышленной зоны с целью обеспечения пожаро- и взрывобезопасных условий, они громоздки и имеют высокую стоимость. Анализаторы, которые возможно миниатюризировать, такие как термокаталитические и полупроводниковые сенсоры, требуют высокой минимальной рабочей температуры (от 100С), электрохимические сенсоры на основе различных твердых электролитов имеют также высокую рабочую температуру либо небольшой диапазон измерения (Добровольский и др., 2006). Электрохимические датчики на основе платины функционируют при комнатных температурах и выше, но платина отравляется такими веществами как сероводород и окись углерода (Igarashi et al., 1995; Karyakin et al., 2005), которые могут образовываться при микробной ферментации. Мембраны, используемые для защиты платины, снижают селективность сенсоров и могут обрастать микроорганизмами, что также сказывается на работе сенсора. Для измерения водорода в газовой фазе можно также использовать газовую хроматографию, но для этого требуется дорогостоящее оборудование, измерение идет дискретно, требуется отбор и ввод пробы оператором.
Альтернативой вышеописанным методам может служить измерение водорода с помощью биосенсоров на основе ферментов. В настоящее время это направление активно развивается, биосенсоры находят все большее применение в различных сферах деятельности человека (Reshetilov, 2007; Evtugyn, 2014). Таким образом, такие катализаторы как платина, имеющие ограниченные ресурсы, могут быть заменены на ферментные, получаемые на основе возобновляемых ресурсов. Для определения водорода используется фермент гидрогеназа. В работах (Qian et al., 2002; Lutz, Fan, 2005) предложено различное устройство сенсоров на водород с использованием очищенных препаратов гидрогеназ. В отличие от указанных предложенный нами сенсор на основе ферментного электрода имеет ряд преимуществ. Фермент находится в иммобилизированой форме, что более экономично, чем использование растворимой формы, увеличивает его стабильность. В процессе реакции электроны передаются непосредственно на электрод, что не требует добавления медиаторов в раствор (Кошкарова, Воронин, 2015). Также предложенный нами сенсор имеет более простое строение, его можно миниатюризировать в частности с применением технологии трафаретной печати, которая обеспечивает простоту массового производства, высокую воспроизводимость получаемого продукта и низкую стоимость, что дает возможность одноразового применения (Couto et al., 2016). К преимуществам стоит отнести также характеристики самого иммобилизованного фермента. Он устойчив к ингибиторному действию сульфида и угарного газа (Karyakin et al., 2002, Karyakin et al., 2005), устойчив к действию протеолитических ферментов (Kovacs et al., 1988), может функционировать при наличии кислорода в среде (Morozov et al., 2006), в то время как проблемой для биотехнологического применения большинства гидрогеназ является тот факт, что они необратимо инактивируются кислородом (Stiebritz, Reiher, 2012).
С помощью предложенного сенсора возможно будет проводить детекцию водорода непосредственно в жидкости, в частности в среде культивирования микроорганизмов, непрерывно записывая показания. Это менее трудоемко и затратно, чем наиболее часто используемая в микробиологии газовая хроматография. Использование трафаретной печати позволит изменять форму и размеры электродов в зависимости от поставленных целей и задач.
Разработанные научные основы технологии создания биосенсора на водород в дальнейшем могут быть использованы для разработки и производства водородных биосенсоров различной конструкции для применения в различных сферах деятельности человека от промышленности и медицины до научных исследований.