Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор
1.1. Вирусные болезни малины 14
1.2. Симптомы поражения ВККМ и круг хозяев 19
1.3. Генетическое разнообразие и распространение ВККМ 22
1.4. Изоляты ВККМ 25
1.5. Систематическое положение и молекулярные характеристики ВККМ .. 26
1.6. Методы диагностики ВККМ 31
1.7. Реакция амплификации по типу катящегося кольца (RCA) 34
1.8. Эффективность различных методов оздоровления растений малины от вируса кустистой карликовости 41
1.9. Перспективы создания устойчивых к ВККМ растений малины 44
1.10. Получение трансгенной устойчивости растений к вирусам 49
1.10.1. Методы трансформации растительных клеток 49
1.10.1. 1. Методы прямой трансформации клеток 49
1.10.1. 2. Трансформация с помощью векторов на основе Ti-плазмид 52
1.10.2. Основные принципы создания генетических конструкций для
создания трансгенных растений 55
1.10.3. Получение резистентности к вирусам на уровне генома 60
1.10.3.1. Пост-транскрипционное замолкание генов (PTGS) 64
ГЛАВА 2. Материалы, методы и условия исследования
2.1 Материалы, используемые в работе 69
2.1.1. Сорта ремонтантной малины, используемые в исследовании 69
2.1.2. Векторы, используемые для получения генетических конструкций 70
2.2.Методика клонального микроразмножения 72
2.3. Выделение тотальной РНК из растительного материала 73
2.4. Разработка методики анализа ВККМ на основе реакции амплификации по типу катящегося кольца (RCA) 74
2.4.1. Лигазная реакция 75
2.4.2. Реакция амплификации по принципу катящегося кольца в режиме реального времени (Realime RCA) 75
2.5. Создание генетических конструкций, содержащих фрагменты генов ВККМ 76
2.5.1. Получение вирусспецифичных фрагментов 76
2.5.2. Лигирование вирусспецифичных фрагментов ВККМ в бинарный вектор 77
2.5.3. Трансформация клеток E. сoli генетическими конструкциями на основе фрагментов генов ВККМ
2.5.3.1. Электропорация клеток E. сoli 78
2.5.3.2. Химическая трансформация клеток E. сoli 79
2.6.3. Выделение и анализ плазмидной ДНК 80
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Культивирование малины in vitro и характеристика исходного материала на наличие ВККМ 81
3.1.1. Культивирование новых ремонтантных сортов и форм малины in vitro 81
3.1.2. Встречаемость вируса кустистой карликовости малины при семенном и вегетативном размножении 85
3.2. Характеристика генетического родства местных изолятов ВККМ и подбор консервативных последовательностей гена полипротеина и гена транспортного белка 92
3.2.1. Создание генетических конструкций на основе фрагментов гена транспортного белка и гена белка оболочки ВККМ 93
3.2.2. Подбор консервативных последовательностей гена полипротеина и гена транспортного белка 103
3.3. Диагностика вируса кустистой карликовости малины с помощью реакции амплификации по принципу катящегося кольца 106
3.3.1. Характеристика циклизующихся проб, используемых для диагностики ВККМ методом RCА 106
3.3.2. Подбор положительных контролей для проведения RCA-диагностики ВККМ 112
3.3.3. Подбор ДНК-полимераз для проведения диагностики ВККМ с помощью реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с детекцией в режиме реального времени 113
3.3.3.1. Эффективноть Vent ДНК-полимеразы для проведения реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца 115
3.3.3.2. Эффективность использования Pfu ДНК-полимеразы для диагностики ВККМ с помощью реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца 130
3.3.3.3.Эффективность использования Taq ДНК-полимераз для проведения реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца 134
3.3.4. Сравнение эффективности применения циклизующихся проб RBDVcirP и RBDVcirМP для диагностики ВККМ с помощью реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с детекцией в режиме реального времени 146
3.3.5. Влияние белковых и полифенольных примесей в препарате тотальных нуклеиновых кислот на проведение диагностики ВККМ с помощью реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с
детекцией в режиме реального времени 149
Заключение 155
Выводы 159
Рекомендации производству 161
Список используемой литературы
- Систематическое положение и молекулярные характеристики ВККМ
- Векторы, используемые для получения генетических конструкций
- Встречаемость вируса кустистой карликовости малины при семенном и вегетативном размножении
- Эффективноть Vent ДНК-полимеразы для проведения реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца
Введение к работе
Актуальность. Вирус кустистой карликовости малины (ВККМ)
является одним из наиболее распространенных и вредоносных патогенов
малины (Converse, 1987; Martin, 1999). Распространение вируса с пыльцой
делает его очень трудно контролируемым (Murant and Jones, 1974). Для
контроля распространения и зараженности посадочного материала, контроля
оздоровления растений, селекции устойчивых и толерантных сортов
требуется эффективный метод анализа этого вируса. Так,
иммуноферментные методы не обеспечивают достаточной чувствительности, разработанный ранее метод на основе ОТ-ПЦР обладает более высокой чувствительностью, но требует высокой степени очистки препаратов нуклеиновых кислот, что делает анализ достаточно сложным, а также может привести к получению ложноотрицательных результатов (Немцова, 2007). Поэтому существует необходимость в разработке более надежного и эффективного способа выявления ВККМ и, таким образом, тема данной работы является актуальной.
Научная новизна. Впервые методика на основе реакции
амплификации по механизму катящегося кольца была разработана для
определения ВККМ (РНК-содержащего вируса растений). Было выявлено,
что данная методика обладает рядом преимуществ по сравнению со
стандартным методом ОТ-ПЦР: не требует проведения стадии обратной
транскрипции, вследствие чего является менее чувствительной к
органическим примесям, является более простой, надежной и обеспечивает
чувствительность на уровне единичных копий вирусспецифичных
последовательностей. Также впервые была оценена возможность
использования для RCA-анализа ДНК-полимераз отечественного
производства (Vent, Pfu, Taq полимераз). Были разработаны
высокоэффективные методики анализа с использованием Vent полимеразы и интеркалирующих красителей, а также с использованием Taq полимеразы и петлевых праймеров, содержащих флуорофор и гаситель.
Были клонированы фрагменты генов транспортного белка ВККМ. Проведено их секвенирование и подтверждено близкое генетическое сходство с белорусскими изолятами (BY22, BY8, BY1, BY3) и штаммом R15. Получен новый экспрессирующий бинарный вектор на основе pBin 19, в который были добавлены последовательности 35S-промотора и 35S-сигнала полиаденилирования. На его основе были созданы генетические конструкции с клонированными фрагментами генов транспортного белка ВККМ и белка оболочки в прямой и обратной ориентации, потенциально способные к формированию шпилечных структур. Данные конструкции могут быть использованы в дальнейшей работе по получению трансгенной устойчивости и изучению ее механизмов на модели ВККМ.
Цели и задачи исследования.
Целью данной работы являлась разработка новой высокоэффективной методики анализа вируса кустистой карликовости малины на основе реакции амплификации по механизму катящегося кольца для контроля за
распространением вируса, селекции на устойчивость к вирусу, изучения взаимодействия вирус-растение.
Для достижения цели исследования ставились следующие задачи:
-
Разработать циклизующиеся пробы на основе консервативных последовательностей генов ВККМ для обеспечения специфичности анализа.
-
Изучить возможность использования ДНК-полимераз Vent, Pfu, Taq отечественного производства для проведения реакции амплификации по механизму катящегося кольца.
-
Изучить динамику накопления продуктов реакции амплификации по механизму катящегося кольца в зависимости от количества праймеров, С-пробы и «положительного» контроля.
-
Выяснить влияние на ход RCA количества ДНК-полимераз, добавляемых в реакционную смесь.
-
Для Vent полимеразы определить оптимальные условия проведения анализа и чувствительность методики.
-
Для Taq полимеразы подобрать способ детекции и тип праймеров, чтобы избежать проявления 5’-3’ экзонуклеазной активности и повысить эффективность её использования в анализе на основе реакции амплификации по механизму катящегося кольца.
-
Оценить влияние растительных примесей и степени очистки препаратов нуклеиновых кислот малины на ход реакции амплификации по механизму катящегося кольца.
-
Определить сходство генетических последовательностей фрагмента гена транспортного белка местного изолята ВККМ с последовательностями других известных изолятов вируса.
-
Создать генетические конструкции на основе фрагментов генов ВККМ в экспрессирующем бинарном векторе для последующей агробактериальной трансформации.
Практическая и научная значимость исследований.
Разработаны методики анализа вируса кустистой карликовости малины на основе реакции амплификации по механизму катящегося кольца с двумя способами детекции и с использованием ДНК-полимераз Vent и Taq российских фирм-производителей. Органические примеси в препаратах нуклеиновых кислот не оказывают ингибирующего влияния на ход анализа, что значительно сокращает длительность анализа и позволяет использовать данные методики для массового скрининга ВККМ в полевых образцах и для селекции на устойчивость к вирусу. Разработанные способы анализа и генетические конструкции на основе фрагментов генов ВККМ могут быть использованы также в ходе изучения механизмов трансгенной устойчивости.
Методология и методы диссертационного исследования.
Диссертационное исследование выполнено с использованием классических и современных методов культуры in vitro растительных тканей, молекулярно-генетического анализа, а также генетической инженерии, на современном оборудовании. Полностью методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту:
-
Методика анализа ВККМ на основе реакции амплификации по механизму катящегося кольца с использованием Vent полимеразы.
-
Методика анализа ВККМ на основе реакции амплификации по механизму катящегося кольца с использованием Taq полимеразы и 5’-петлевыми праймерами и детекцией с помощью пары флуорофора-гасителя.
-
Циклизующиеся пробы, универсальные для всех известных изолятов ВККМ, подобранные на основе консервативных последовательностей гена транспортного белка и гена полипротеина ВККМ.
-
Генетические конструкции с фрагментами генов транспортного белка и белка оболочки ВККМ, полученные на основе экспрессирующего бинарного вектора для агробактериальной трансформации.
Работа поддержана грантами: 1. ФЦП «Кадры» 1.1. № 02.740.11.0285
«Проведение фундаментальных и прикладных исследований по
биотехнологии растений и животных и нанобиотехнологии и развитие
малого бизнеса на основе инновационных разработок» (2009 — 2011); 2.
Минобрнауки РФ, АВЦП 2.1.1./224. «Развитие фундаментальных
исследований по биотехнологии растений, животных, нанобиотехнологии» (2009 — 2011); 3. Минобрнауки РФ АВЦП 4.1912.2011 «Разработка инновационных биотехнологий для трансфера в медицину, селекцию, животноводство и растениеводство» (2012-2014). 4. Минобрнауки РФ № 41 в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности по Заданию № 2014/426.
Апробация работы.
Основные положения диссертации были опубликованы и представлены
на научных конференциях: региональная научно-практическая конференция
«Инновационный потенциал молодежи Брянской области: достижения и
перспективы», Брянская торгово-промышленная палата, 22 сентября 2011 г.;
международная научная конференция «Студент и научно-технический
прогресс», г. Новосибирск, 16-20 апреля 2011 г.; международная
конференция ученых «Трансфер инновационных биотехнологий в селекции
растений, экологии, растениеводстве, животноводстве», г. Брест, 28-30 июня
2012 г.; серебряная медаль на Всероссийском биотехнологическом форуме
"Биотехнология в развитии АПК регионов России. Программа "БИО - 2020",
г. Москва, ЦВК «Экспоцентр», 2012 г.; III и IV региональная научно-
практическая конференция молодых исследователей и специалистов
«Приоритетные направления современной науки: фундаментальные
проблемы, инновационные проекты», Брянск, 2012, 2013; международная
научно-практическая школа-семинар «Трансфер инновационных
биотехнологий в растениеводстве и земледелии», г. Санкт-Петербург, 27-30 апреля 2013; международная научная конференция «Биотехнологические приемы в сохранении биоразнообразия и селекции растений», г. Минск, 18-20 августа 2014 г.; XV международная конференция «Современные концепции научных исследований», г. Москва, 25-27 июня 2015 г.; международная научная конференция «Биотехнология: наука и практика», г.
Ялта, 23-27 сентября 2015 г.; конкурс «УМНИК» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.
Личный вклад автора. Результаты представленных в данной
диссертации исследований получены лично автором на кафедре биологии, а
также в лаборатории ИННО-центра биотехнологии и экологии Брянского
государственного университета им. акад. И. Г. Петровского.
Непосредственное участие автор принимал на каждом этапе исследования, начиная с планирования экспериментов и разработки программы исследования. Самостоятельно была проведена работа по введению в культуру in vitro сортов и генотипов малины, статистическая обработка результатов, а также проведен анализ вируса кустистой карликовости малины в полевых и пробирочных растениях. Кроме того, осуществлен подбор циклизующихся проб и праймеров для разработки методики RCA-анализа ВККМ, проведен ряд экспериментов по оптимизации условий проведения реакции амплификации по механизму катящегося кольца. Автор также принимал непосредственное участие в получении генетических конструкций с фрагментами генов вируса кустистой карликовости и в подготовке публикаций по теме диссертационного исследования.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы.
Систематическое положение и молекулярные характеристики ВККМ
Большая часть вирусных заболеваний рода Rubus имеет экономическое значение, так как приводит к снижению вегетативной продуктивности и урожайности побегов. Согласно литературным данным, наиболее опасными и распространенными в посадках малины, ежевики и их гибридов являются вирус некроза черной малины (ВНЧМ), вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), вирус мозаики листьев малины (ВМЛМ), вирус желтой сетчатости малины (ВЖСМ), вирус курчавости листьев малины (ВКЛМ) и вирус пятнистости листьев малины (ВПЛМ) (Stace-Smith, 1987; Jones, McGavin, 1998a; Martin, 1998б, 1999).
Существуют различные критерии классификации вирусных инфекций малины, но логичнее и эффективнее всего разделить все вирусы на группы, основываясь на способах их передачи (pak et al., 1997; Martin, 2002). Для вирусов, инфицирующих рода Rubus, известно три основных способа переноса: с помощью нематод, тли и пыльцы.
Вирусы, переносимые тлями рода Amphorophora при комплексной инфекции вызывают мозаичную болезнь малины. В Северной Америке данную болезнь вызывают вирус некроза черной малины (ВНЧМ) и вирус желтой сетчатости малины (ВЖСМ), переносимые A. agathonica (Stace-Smith, 1956; Halgren et al., 2007; McGavin et al., 2010a). Данные вирусы наносят наибольший ущерб черной малине (R. occidentalis), проявляя симптомы средней тяжести на красной малине и практически полное отсутствие симптомов на ежевике (Halgren et al., 2007). У черной малины комплексная инфекция вызывает развитие некрозов и отмирание побегов, что приводит к резкому сокращению площади насаждений. У ежевики мозаичная болезнь, как правило, протекает бессимптомно, однако возможно снижение урожайности и качества плодов (Stace-Smith, 1987). У некоторых сортов ежевики при инфицировании одним или несколькими вирусами, вызывающими мозаичную болезнь, совместно с вирусом кустистой карликовости развиваются такие симптомы, как израстание и хлорозы (Quito-Avila, 2011; Martin et al., 2013). В Европе мозаичную болезнь малины вызывает совместное поражение растений ВЖСМ и вирусом крапчатости листьев малины (ВКЛМ) (Jones, 1991). Симптомы болезни проявляются сильнее при инфицировании вирусами ВЖСМ и ВКЛМ одновременно с ВНЧМ, индивидуально или совместно с вирусом пятнистости листьев малины (ВПЛМ) (Martin, 2002; Besse et al., 2010). ВКЛМ и ВПЛМ, как отдельные инфекции, вызывают значительную деформацию, хлорозы и пятнистость листьев (Tzanetakis et al., 2007). Различие в вирусах, которые вызывают мозаичную болезнь малины в Северной Америке и Европе может быть связано с факторами окружающей среды, опасностью исследуемого изолята, или способностью вызывать смешанную инфекцию совместно с другими вирусами (Martin, 2002).
Переносчиками вирусов являются два вида тлей: A. agathonica в Северной Америке и А. idaei в Европе. Было выявлено, что на северо-западном побережье Тихого океана в Северной Америке для борьбы с переносимыми тлей вирусами эффективно использование гена AG1, отвечающего за устойчивость к Amphorophora agathonica. В начале 1990-х был обнаружен биотип A. agathonica, способный воспроизводиться на сортах, содержащих AG1, однако этот биотип не стал преобладающим в популяции малиновой тли данного региона (Daubeny, Anderson, 1993). В Европе до недавнего времени растения, несущие доминантные гены А1 и А10, проявляли резистентность к А. idaei. Но уже к 1993 более 75% тлей в Великобритании были способны преодолеть А1-устойчивость, а в 1997 году в Англии были выявлены тли, способные питаться на растениях, несущих ген А10, в Шотландии – в 2004 (Birch et al., 2002; Martin et al., 2013). Получение устойчивых к тлям растений является необходимым условием контроля за распространением мозаичной болезни малины, однако наличие нескольких биотипов тлей значительно усложняет селекционную работу (Birch et al., 2002).
В настоящее время известно восемь вирусов, передающихся нематодами и вызывающих серьезные заболевания растений рода Rubus: вирус мозаики резухи, вирус рашпелевидности листа черешни (ВРЛЧ), вирус скручивания листьев вишни (ВСЛВ), вирус кольцевой пятнистости малины (ВКПМ), вирус латентной кольцевой пятнистости земляники (ВЛКПЗ), вирус кольцевой пятнистости табака (ВКПТаб), вирус черной кольчатости томата (ВЧКТом), вирус кольцевой пятнистости томата (ВКПТом) (Jonczyk et al., 2004; Martin et al., 2013). Все восемь вирусов относятся к семейству Secoviridae, из которых ВРЛЧ принадлежит роду Cheravirus, родовая принадлежность ВЛКПЗ не определена, а остальные шесть видов входят в состав рода Nepovirus, подсемейство Comovirinae (Sanfaon et al., 2012).
Переносчиками данных вирусов являются нематоды родов Xiphinema и Longidorus, которые могут инфицировать широкий круг хозяев, например, ВКПТаб обнаружен в ежевике, ВКПТом – в красной и черной малине, ВРЛЧ – в красной малине, ВКПТом – в голубике и землянике (Ramsdell et al., 1987; Converse, Stace-Smith, 1987; MacKenzie et al., 1996; Tzanetakis et al., 2006). Симптомы инфекции включают в себя пятнистость листьев, реже листовые деформации, снижение продуктивности за счет появления рассыпающихся плодов, что приводит к значительному снижению урожайности (Stace-Smith, 1987).
Известны также два вируса растений рода Rubus, передающиеся с пыльцой: вирус кустистой карликовости малины (ВККМ) и вирус полосатости табака (ВПолТ).
ВПолТ имеет второстепенное значение, так как заболевание протекает бессимптомно и не приводит к значительному снижению урожайности, часто поражает растения совместно с ВККМ. Из-за отсутствия характерных симптомов инфекции до недавнего времени изоляты ВПолТ классифицировались как отдельные виды (вирус некротического шока земляники и латентный вирус черной малины) (Jones, Mayo, 1975; Martin et al., 2013). Методы борьбы с данным патогеном сходны с таковыми для ВККМ.
Векторы, используемые для получения генетических конструкций
Деградация мРНК происходит только в случае 100% гомологии между siRNA и родственной мРНК вируса. RISC-комплекс включает в себя эндонуклеазу Dicer, несколько вспомогательных белков (Ago1, 4, 6, 9; каталитические эндонуклеазы), РНК-связывающих белков (PDR), и несколько трансактивирующих РНК-связывающих белков (TRBP) (Schwarz et al., 2003; Gregory et al., 2005). Рестрицированная мРНК вируса затем может подвергаться воздействию клеточных экзонуклеаз. Однако, это не единственных способ деградации вирусной РНК. Показано, что на мРНК вируса возможно образование новых гомологичных последовательности РНК-мишени siRNA, отличающихся от исходных siRNA. Такой процесс получил название транзиентной интерференции (Sijen et al., 2001). Суть такой интерференции заключается в том, что siRNA, входящая в состав RISC-комплекса, сзывается с мРНК-мишенью и становится затравкой для РНК-зависисмой РНК-полимеразы, которая синтезирует новую цепь РНК, комплементарную вирусной. Новая дцРНК, как и исходная, распознается Dicer-подобными рибонуклеазами, в результате чего образуются новые (вторичные) молекулы siRNA. Таким образом, концентрация siRNA в клетке значительно увеличивается, что способствует быстрому распространению процесса посттранскрипционного замолкания генов.
РНК-сайленсинг препятствует размножению вирусов в растениях при помощи двух основных механизмов. В ходе первого происходит деградация как дцРНК, промежуточных продуктов саморепликации вирусов, так и исходных мРНК (автономно-клеточный сайленсинг), что приводит к увеличению накопления соответствующих siRNA. В ходе второго пути генерируется мобильный сигнал, который запускает деградацию гомологичных мРНК в отдаленных клетках (системный сайленсинг). Это системное звено антивирусного РНК-сайленсинга связано с совокупностью siRNA или дцРНК, их предшественниками, которые перемещаются между соседними клетками по плазмодесмам, а на большие расстояние по флоэме (Kalantidis et al., 2008).
Стабильность РНК сайленсинга основывается на энзиматическом метилировании siRNA. Данную реакцию катализирует фермент метилтрансфераза (HEN1), который метилирует 3 -конец siRNA и предотвращает полиуридилирование и последующую деградацию (Li et al., 2005).
Многие вирусы могут подавлять PTGS (Bclin et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Kasschau, Carrington, 1998; Voinnet et al., 1999). В частности, потивирус ВМТу (вирус мозаки турнепса) и тобамовирус ВПЖТ (вирус просветления жилок турнепса) полностью подавляют PTGS у арабидопсиса, в то время как ВМО только частично ингибирует PTGS (Mourrain et al., 2000). У некоторых вирусов были идентифицированы белки-ингибиторы PTGS, которые способны подавлять замолкание даже в отсутствии вируса.
С 1998 года, когда был найден первый вирусный супрессор сайленсинга, было установлено, что наиболее известные виды вирусов несут, по меньшей мере, один супрессор РНК-сайленсинга (Ding, Voinnet, 2007; Daz-Pendon, Ding, 2008). Открытие большого количество вирусных белков-супрессоров вызвало сомнения по поводу эффективности РНК-сайленсинга как основы устойчивости к вирусам в полевых условиях. Так как сайленсинг представляет собой последовательность-специфичное явление, устойчивость трансгенных растений к одному вирусу может быть нарушена другим, гетерологичным вирусом, способным инфицировать растения в полевых условиях. Гетерологический вирус с помощью белков – супрессоров может подавлять РНК-сайленсинг в растении в целом, в результате чего растение теряет первоначальную искусственно созданную резистентность. Кроме того, выявлен ряд экологических и физиологических факторов, которые могут влиять на механизм замолкания и, следовательно, на эффективность РНК-сайленсинга как основы устойчивости к вирусам в полевых условиях (Vassilakos, 2012).
Вирус кустистой карликовости малины является одним из наиболее вредоносных и широко распространенных патогенов малины. Контроль за его распространением в посадках обуславливает необходимость разработки современного метода его диагностики, обладающего достаточной чувствительностью и не требующего проведения стадии обратной транскрипции. Данным требованиям отвечает метод, основанных на реакции амплификации по принципу катящегося кольца. Преимуществами метода, по сравнению с другими методами диагностики ВККМ, является также возможность проведения анализа в более короткие сроки и высокая точность, так как с помощью RCA можно выявить даже однонуклеотидные замены.
Встречаемость вируса кустистой карликовости малины при семенном и вегетативном размножении
Полученные данные свидетельствуют о том, что ВККМ эффективно передается при вегетативном размножении растений, в том числе в условиях культивирования in vitro после выделения почечных эксплантов и вертикально в семьях гибридных сеянцев.
Поскольку вирус в естественных условиях передается с пыльцой на значительные расстояния, даже между разными видами рода Rubus, мероприятия по оздоровлению могут оказаться неэффективными. Кроме того, в настоящее время не известны источники резистентности к ВККМ среди сортов, родительских форм и диких видов рода Rubus. Все это в значительной степени осложняет селекцию на устойчивость к вирусу кустистой карликовости.
В полевых условиях симптомы поражения ВККМ обнаруживаются только после 5-6 лет плодоношения, поэтому возникает необходимость в разработке простых и дешевых экспресс-методик диагностики вируса на ранних этапах развития сеянцев. Разработанная методика диагностики с помощью ОТ-ПЦР эффективна для обнаружения вирусных последовательностей как в полевых растениях, так и в растениях, произрастающих в культуре in vitro. Тем не менее, наличие в ней лимитирующей стадии обратной транскрипции значительно увеличивает время проведения диагностики и, таким образом, не позволяет за короткое время достоверно оценивать сотни и тысячи гибридов, вовлеченных в селекционный процесс. Кроме того, анализ с помощью ОТ-ПЦР может приводить к получению ложноотрицательных результатов ввиду высокой чувствительности обратной транскриптазы к органическим примесям в исследуемых тканях. Поэтому на данный момент времени селекционеры производят отбор сеянцев по другим хозяйственно-ценным признакам, после чего такие сеянцы анализируются на наличие ВККМ. При такой схеме селекционного процесса велика вероятность потери сеянцев с высокой устойчивостью к вирусу (Евдокименко с соавт., 2013).
Для разработки циклизующихся проб для RCA – анализа ВККМ нами был проведен подбор консервативных последовательностей гена транспортного белка и гена полипротеина ВККМ. Такие последовательности были выделены на основе последовательностей 29 изолятов вируса кустистой карликовости малины, представленных в международном банке генов (GenBank) (приложение 4). Согласно базе данных GenBank, в настоящее время известны частичные последовательности 31 изолята ВККМ, причем последовательности гена полипротеина известны только для 12 изолятов, а последовательности гена транспортного белка для 13. Наиболее широко и подробно исследованы последовательности гена белка оболочки вируса, вследствие чего диагностика ВККМ главным образом основана на выявлении участков гена капсидного белка. Тем не менее, количество данных о последовательностях гена транспортного белка и гена полипротеина с каждым годом увеличивается, что позволяет разрабатывать новые способы диагностики.
Также был проведен анализ нуклеотидных последовательностей известных изолятов ВККМ, имеющихся в банке генов и определена степень их гомологии с клонированными фрагментами гена транспортного белка изолята ВККМ, распространенного в посадках ремонтантной малины Кокинского ОП. С помощью ОТ-ПЦР на РНК малины различных сортов синтезировались вирусспецифичные фрагменты РНК-2 вируса длиной 503 bp (праймеры RBDV-CP-5Sal и RBDV-СP+5Bam, комплементарные гену транспортного белка). Данные фрагменты элюировались из геля и были использованы для лигирования в pALA вектор. Полученный вектор с последовательностями ВККМ был клонирован в клетки E. coli, штамм JM109. Наличие специфичной вставки подтверждалось проведением рестрикционного анализа плазмидной ДНК клонов по сайтам BamHI и SalI, а также данными электрофореза продуктов ПЦР.
Клонированные фрагменты генов ВККМ были использованы для получения генетических конструкций на основе экспрессирующего бинарного вектора pBin19, в который были искусственно введены последовательности 35S промотора и сайта полиаденилирования. Также была определена степень гомологии клонированных фрагментов с последовательностями ВККМ, имеющимися в международном банке генов GenBank.
Генетические конструкции для экспрессии клонированных генов должны содержать следующие структурные элементы: целевой ген (или ген интереса), промотор и терминатор, узнаваемые ферментами систем транскрипции растительных клеток, а также селективный ген, позволяющий производить отбор трансформированных клеток (рис. 16) (Патрушев, 2004). бинарные вектора, позволяющие проводить клонирование в E. coli и трансформировать растения с помощью A. tumefaciens, поскольку в их состав входят соответствующие регуляторные элементы. Так, бинарный вектор pBin19 содержит Т-область, фланкированную левой и правой границей (LB и RB), которая в процессе трансформации переносится в геном растения. В Т-ДНК данного вектора расположен также селективный ген npt II, кодирующий последовательность неомицинфосфотрансферазы II и придающий трансформированным клеткам устойчивость к антибиотику канамицину. Npt II находится под контролем промотора и терминатора гена нопалинсинтазы (nos), позволяющих экспрессировать данный ген в эукариотических клетках. Для клонирования целевых генов в векторе pBin19 имеется полилинкер, расположенный внутри гена lacZ. Но около полилинкера отсутствует промотор эукариотического типа, поэтому данный вектор не является экспрессирующим для растений. Чтобы клонированные в данном векторе гены могли экспрессироваться, требуется ввести дополнительный промотор, способный функционировать в составе растительного генома.
Промотор является одним из основных регуляторных элементов бинарных векторов (Carter et al., 2002). «Сила» промотора, а, соответственно, возможность его использования в генной инженерии, определяется легкостью связывания с промотором фермента РНК-полимеразы и образования открытого комплекса, необходимого для инициации транскрипции (Патрушев, 2004). Одним из наиболее широко используемых является конститутивный 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (Frank et al., 1980), который активен во всех тканях растения на протяжении всего цикла развития.
Эффективноть Vent ДНК-полимеразы для проведения реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца
Из рисунка 48 видно, что ход кривых накопления флуоресцентного сигнала не является классическим для данной реакции амплификации, отсуствует ярко выраженная стадия плато, общий уровень флуоресценции невысокий. Не смотря на то, что при концентрации С-пробы RBDVcirMP 3х1012 молекул на реакционную смесь наблюдался рост уровня флуоресценции, исходя из вида кривых на рисунке 48 сложно сделать вывод о возможном наличии или отсутствии ВККМ в анализируемых образцах. Вероятно, низкую эффективность реакции амплификации в данном случае можно объяснить слабо выраженной вытесняющей активностью Taq-полимеразы, по сравнению с 5 3 экзонуклеазной активностью, уничтожающей продукт реакции, синтезированный на предыдущем обороте фермента по кольцевой матрице.
Эффективность RCA-анализа c помощью Taq-полимеразы можно повысить, используя в реакционной смеси праймеры PRC1LP и PRC2LP. При проведении RCA на 5-конце таких праймеров формируется петля, которая предотвращает экзонуклеазное расщепление 5-конца вновь ситезированной цепи ДНК полимеразой. В результате при прохождении ферментом полного оборота вокруг кольцевой матрицы синтез не прекращается, и образуется дочерняя молекула ДНК, многократно повторяющая матричную последовательность. С такой дочерней молекулой комплементарно взаимодействует обратный петлевой праймер, что со временем приводит к образованию большого количества двуцепочечных продуктов амплификации разной длины. С петлевыми праймерами PRC1LP и PRC2LP был проведен RCA-анализ, результаты которого представлены на рис. 49.
Из рисунка 49 следует, что в ходе RCA происходит нарастание уровня флуоресценции, однако эффективной детекции сигнала и, следовательно, надежной диагностике вируса кустистой карликовости малины препятствует высокая фоновая флуоресценция. Вероятно, причина такого явления заключается в использовании для проведения реакции амплификации избыточного количества праймеров. Из-за их значительной длины (71 и 74 нуклеотида) и наличия с структуре двунитевой петли происходит неспецифичное встраивание
Несмотря на затруднения при детекции нарастания флуоресцентного сигнала в режиме реального времени, эффективность петлевых праймеров при проведении реакции амплификации по механизму катящегося кольца с Taq-полимеразой подтверждается результатами гель-электрофореза продуктов реакции (рис. 50). На электрофореграмме наблюдались полосы, длина которых достигала примерно 700-800 bp. Это свидетельствует о том, что формирование петлевых структур праймерами препятствует проявлению экзонуклеазной активности фермента и позволяет Taq-полимеразе вытеснять вновь синтезируемую цель. Число оборотов полимеразы вокруг кольцевой матрицы увеличивается с 2-4 до 7-8, как в случае проведения реакции как с С-пробой RBDVcirP, так и RBDVcirMP.
Исходя из того, что большое количество праймеров в реакционной смеси препятствует эффективной детекции флуоресценции, нами была проведена реакция амплификации по механизму катящегося кольца с ДНК-полимеразой Taq и количеством праймеров PRC1LP и PRC2LP, уменьшенным с 40 до 20 пмоль. В качестве контроля, одновременно был также проведен RCA-анализ тех же образцов с использованием обычных праймеров PRC1 и PRC2 в количестве 20 и 40 пмоль. Результаты анализа представлены на рисунках 51-53. На данных рисунках на оси абсцисс обозначено время в минутах, на оси ординат - уровень флуоресценции в условных единицах.
Проведение такого RCA-анализа с ДНК-полимеразой Taq показало, что снижение количества праймеров PRC1 и PRC2 в реакционной смеси способствует сокращению времени, необходимого для выхода кривых накопления флуоресцентного сигнала на плато, что отражено на рисунках 51 и 52. Кроме того, уровень флуоресценции в 1,5 раза выше при использовании 20 пмоль праймеров вместо 40 пмоль. Тем не менее, ход кривых не является классическим, что затрудняет проведение диагностики на наличие вируса в исследуемых образцах.
Из рисунка 53 следует, что уровень флуоресценции значительно снижается при проведении RCA-анализа с Taq ДНК-полимеразой и 20 пмоль петлевых праймеров PRC1LP и PRC2LP, у кривых накопления сигнала отсутствуют все характерные области – экспоненциального роста и плато. Видимо, это связано с высоким уровнем фоновой флуоресценции, который не снижается при уменьшении количества праймеров в реакционной смеси. Таким образом, использование праймеров PRC1LP и PRC2LP для диагностики ВККМ может привести к ложноотрицательному результату при детекции сигнала в режиме реального времени, в то время как при проведении электрофоретической детекции обнаруживается накопление специфических продуктов реакции (рис. 54).
Кроме стандартной Taq-полимеразы существуют различные ее модификации. Например, Taq ДНК-полимераза Dream - усовершенствованная Taq-полимераза, характеризующаяся более высокой чувствительностью и процессивностью (производство «Fermentas», Thermo Fisher Scientific, США). Данный фермент позволяет синтезировать продукты ПЦР длиной до 6000 Ьр с геномной и до 20000 Ьр с вирусной ДНК с более высоким выходом (таблица 10).
Фермент Taq ДНК-полимераза Dream Taq ДНК-полимераза Максимальный размер продукта 6000 нуклеотидныхзвеньев с геномной и20000 звеньев свирусной ДНК 5000 нуклеотидныхзвеньев с геномной и10000 звеньев с вируснойДНК Выход +++++ ++ Точность действия 1 1 Чувствительность ++ + «Горячий старт» нет нет Концы ПЦР-продукта З -dA З -dA Встраивание dUTP нет да По сравнению с Taq ДНК-полимеразой На рисунке 55 представлены результаты RCA-анализа ВККМ c полимеразой DreamTaq. Как видно из рисунка, уровень флуоресценции невысокий, стадия плато не выражена. Значения флуоресценции для двух исследуемых образцов оказались ниже значения, соответствующего отрицательному контролю. Таким образом, можно сделать вывод о недостоверности полученных результатов анализа и неэффективности данной полимеразы для проведения RCA. При использовнании для анализа 3x1012 молекул циклизующейся пробы наблюдалось накопление незначительного количества продукта реакции, что отражено на электрофореграмме, представленной на рисунке 56. Тем не менее, количество синтезируемых ампликонов не является достаточным для надежной детекции роста флуоресценции при высокой фоновой флуоресценции, а, следовательно, и для диагностики ВККМ в анализируемых образцах.