Введение к работе
Актуальность проблемы. Лекарственные препараты на основе рекомбинантных белков все более широко используются в клинической практике. 8 настоящее время подавляющее большинство новых белковых препаратов медицинского назначения получается выделением из генетически трансформированных клеток. Среди большого количества микробиологических систем, доступных для продуцирования рекомбинантных белков, грамм-отрицательная бактерия Escherichia coli является одной из широко используемых.
Экспрессия рекомбинантных белков в Е. coli может достигать 50% от всего клеточного белка. Но клеточный аппарат бактериальных систем, за редким исключением, не способствует полной ренатурации рекомбинантного белка. При так называемой "сверхэкспрессии" белка часто образуются тела включения - нерастворимые агрегаты целевого рекомбинантного белка и его комплексы с клеточными белками и небелковыми компонентами, что дает возможность легко отделить целевой белок от водорастворимых клеточных компонентов. Но для получения биологически активного белка необходимо его ренатурировать. Методы выделения, очистки и ренатурации сильно различаются для каждого получаемого рекомбинантного белка. Наличие клеточных примесей - нуклеиновых кислот, гидрофобных компонентов и клеточных белков, снижает эффективность ренатурации, являющейся ключевой стадией получения рекомбинантного белка в биологически активной форме. Поэтому выбор методов выделения и очистки белка определяет правильное и эффективное протекание ренатурации и производительность всего процесса получения рекомбинантного белка. Таким образом, исследование ренатурации является самостоятельной сложной задачей.
Объекты настоящего исследования - рекомбинантные человеческие белки цитокины - гамма-интерферон (у-ИФН), фактор некроза опухолей-альфа (а-ФНО) и интерлейкин-3 (ИЛ-3) - перспективны с точки зрения их медицинского применения. Часто природные белки имеют характеристики, осложняющие их использование, например, низкая стабильность у-ИФН или высокая токсичность а-ФНО. Создание соответствующих белков-аналогов является актуальной задачей для их внедрения в клиническую практику.
Работа выполнена в соответствии с планом работ по федеральной целевой программе "Государственная поддержка интеграции высшей школы и фундаментальной науки."
Цель работы. Целью работы была разработка эффективных методов выделения, очистки и ренатурации рекомбинантных белков, экспрессируемых в Е. coli: а-ФНО дикого и мутантного (с пониженной токсичностью) типов, у-ИФН и ИЛ-3; получение аналогов у-ИФН, обладающих повышенной стабильностью и биологической активностью. Особое внимание
уделялось изучению факторов, влияющих на ренатурацию названных рекомбинантных белков.
Научная новизна, Впераые для создания стабильных аналогов у-ИФН человека применен подход, сочетающий введение внутримолекулярной дисульфидной связи и модифицирование структуры С-концевой области.
Изучены особенности и найдены общие закономерности ренатурации у-ИФН, ИЛ-3, гибридного белка - предшественника инсулина человека. Предложен метод поиска оптимальных условий ренатурации на основе анализа вторичной структуры денатурированных белков. Систематизированы подходы к поиску условий ренатурации рекомбинантных белков.
Показано отрицательное влияние некоторых клеточных компонентов и положительное влияние некоторых искусственных добавок на ренатурацию вышеперечисленных белков.
Практическая значимость, В ходе работы получены у-ИФН дикого типа и 4 аналога (комбинации с введением дисульфидной связи, С-концевого укорочения и концевой замены), а-ФНО дикого и мутантного (R32H) типов, ИЛ-3. Показано повышение стабильности и биологической активности полученных аналогов у-ИФН.
Стабильные аналоги у-ИФН, низкотоксичный аналог а-ФНО и ИЛ-3 представляют интерес для проведения клинических испытаний. Оптимизация ренатурации гибридного белка - предшественника инсулина человека может быть использована при разработке эффективной технологии производства человеческого инсулина.
Разработаны высокоэффективные и унифицированные методики получения высокочистых биологически активных рекомбинантных белков в препаративных количествах. Предложены методы удаления гидрофобных клеточных компонентов и нуклеиновых кислот, отрицательно влияющих на ренатурацию.
Предложенные подходы могут быть использованы при выделении, очистке и поиске условий ренатурации других рекомбинантных белков.
Положения, выносимые на защиту.
-
Разработка схем выделения, очистки и ренатурации рекомбинантных белков из биомассы трансформированных клеток Е. coli. Исследование закономерностей ренатурации.
-
Выбор подхода к увеличению активности и стабильности у-ИФН.
3) Разработка унифицированной схемы получения рекомбинантных белков-
цитокинов а-ФНО, у-ИФН и ИЛ-3.
Апробация работы. Материалы работы доложены на IV чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2-12.11.1998; на научно-технической конференции "Фундаментальные и прикладные вопросы биотехнологии и медицины." ГосНИИОЧБ, Санкт-Петербург, 19-20. 04. 2000; на V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 13-20. 11. 2000.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, 4 работы приняты к печати.
Объем работы. Диссертационная работа изложена на 137 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводоз, списка цитируемой литературы из 190 наименований и содержит 13 таблиц и 42 рисунка.