Введение к работе
Актуальность исследований. Одной из основных задач генетики сельскохозяйственных животных и связанных с ней разделов биотехнологии является установление детерминации биологически важных и хозяйственно-полезных признаков. Большинство таких признаков являются полигенными, не характеризуются четкой дискретностью и контролируются несколькими или многими генами (QTL - quantitative trait locus).
Как альтернатива количественной генетики, опирающейся на статистический анализ распределения по фенотипам, уже в 2 0х годах был предложен подход идентификации QTL с помощью простых сцепленных с ними маркеров. Однако, практическая реализация этого приема с учетом дефицита простых морфологических (биохимических маркеров) стала возможна лишь после появления ДНК-проб и разработки методов оптимального картирования (Tanksley, 1993; Blottmon et al., 1996).
Открытие полиморфных ДНК-маркеров коренным образом изменило и общую ситуацию с исследованием генома животных и растений. Появился мощный инструмент для описания гетерогенности геномной ДНК, контроля происхождения, оценки генетического расстояния. Первоначально, такие ДНК-пробы были связаны с кодирующей (уникальной) фракцией ДНК, а их выявление - с тестированием полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Однако, более информативными оказались маркеры, относящиеся к повторяющейся фракции геномной ДНК и прежде всего мини- и микросателлиты, образованные короткими последовательностями нуклеотидов ("core"), повторенными в геноме в виде тандема (Sertedaki, Lindsay, 1996).
Классификация современного набора полиморфных ДНК маркеров сложна, условна и связана как с принадлежностью к определенным фракциям хромосомной ДНК, так и с приемами их детекции. Каждый из ДНК зондов и приемов детекции имеет
свой спектр практического применения и преимущественное генетическое приложение (Levin et al., 1994; Мельникова и др., 1996) .
Так, геномная дактилоскопия (фингерпринтинг) - метод, основанный на обнаружении "core" минисателлитных последовательностей с помощью процедуры блот-гибридизации, является наиболее информативным для оценки генетического полиморфизма и может рассматриваться в качестве инструмента, позволяющего описать общую картину, отражающую состояние большого количества локусов, расположенных на всех хромосомах, облегчить поиск локус-специфичных маркеров. Это позволяет использовать метод для генотипирования животных, установления степени родства между ними (Troromelen et al., 1993 а,б), для выявления локусов сцепленных с наследственными заболеваниями неизвестной генной природы (Holmes, 1994), для поиска генов влияющих на формирование хозяйственно-полезных признаков (Plotsky et al., 1993), оценки гетерозиса (Haberfeld et al., 1996), интрогрессии новых генов (Yancovich et al., 1996). Перечисленные области применения метода требуют анализа большого количества животных и, как следствие, удобства применяемых методов и доступности используемых реактивов. В случае геномной дактилоскопии это в первую очередь касается возможности избежать использования радионуклидов, заменив их на не менее чувствительные компоненты И во-вторых, создание и отработка удобной для практического использования технологии.
Следует отметить, что описано относительно немного минисателлитных проб, позволяющих получить четкий рисунок фингерпринта применительно к геномной ДНК крупного рогатого скота, еще для меньшего их числа описана информативность для исследования гетерогенности генома. Прежде всего это минисателлит ДНК фага М13, универсальные пробы 33.6 и 33.15 и ряд их производных - pV47, pITZl (Haberfeld et al., 1996;
Muebscher et al., 1995). В ряде исследований для этих целей использовались и некоторые "core" олигонуклеотидные пробы (Trommelen et al., 1993а). Предполагается, что одной из перспективных проб для геномной дактилоскопии Bos taurus является олигонуклеотид (ЦАЦ)5 (Trommelen et al. , 1993а,б). Однако, нам известно лишь одно исследование, в котором сделана попытка оценки генетической информативности данной пробы применительно к внутрипородной, индивидуальной изменчивости (Trommelen et al., 1993а,б). Отметим, что практически все процитированные исследования выполнены в трудоемком и менее практически доступном изотопном варианте.
Вышесказанное и предопределило направление данного исследования, связанного с разработкой эффективного варианта геномной дактилоскопии применительно к Bos taurus и его трансформации для установления простых монолокусных маркеров .
Цель и задачи исследований. Целью работы была разработка и оптимизация нерадиоактивного варианта метода геномной дактилоскопии и его последующее использование для создания коллекции монолокусных полиморфных маркеров.
Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить информативность короткого олигонуклеотида (ЦАЦ)5 в качестве зонда для генотипирования крупного рогатого скота;
-
Сравнить различные варианты нерадиоактивного мече-ния зонда для геномной дактилоскопии и оптимизировать метод для его использования в широкомасштабных исследованиях;
-
Выделить и клонировать локусспецифичные маркеры;
4 . Определить нуклеотидную последовательность одного из монолокусных маркеров и подобрать праймеры для его направленной амплификации.
Научная новизна. Впервые проведена сравнительная оценка нескольких вариантов введения репортерных групп в короткий олигонуклеотид с целью получения высокоинформативных геномных оттисков. Разработан и оптимизирован нерадиоактивный вариант геномной дактилоскопии. На примере четырех пород крупного рогатого скота оценена информативность олиго-нуклеотида (ЦАЦ)5 в качестве зонда для геномной дактилоскопии. Выделены и клонированы локусспецифичные маркеры; для одного из них определена первичная структура и подобрана пара праймеров для направленной амплификации.
Научно-практическая значимость работы. Предложенный вариант нерадиоактивного мечения коротких олигонуклеотидов
МОТУ РФ Rt""t „пплг, ппл^„ тттп .i .III IIIII.IIII 1|Н I I l|l llllv гп„„г„
информативных зондов любой структуры. Разработанный метод широко использовался для установления отцовства (с 1989 по 1992 гг было выполнено свыше 1000 экспертиз) . На основе разработанного метода проводятся работы по получению моно-локусных полиморфных маркеров. Полная последовательность секвенированного микросателлита зарегистрирована Европейским институтом биоинформации под номером Y07737 (EMBL Nucleotide Sequence Database) .
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Информативность геномных оттисков, получаемых с помощью короткого олигонуклеотида (ЦАЦ)5 и возможность их использования для паспортизации животных.
-
Оптимальный вариант введения репортерных групп в состав зонда для геномной дактилоскопии, позволяющий сохранить высокую чувствительность характерную для изотопных методов.
3. Выделение и анализ монолокусных генетических марке
ров по результатам генотипирования животных.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: I Международной конференции
по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1994); Международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке геномов сельскохозяйственных животных" (Санкт-Петербург, Пушкин, 1994); II Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995); 9th North American Colloquium on Domestic Animal Cytogenetics & Gene Mapping (Texas, USA, 1995); II Международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам (Киев, 1996). По материалам исследований опубликовано девять научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, выводов и предложений, списка литературы, включающего 185 источников, в том числе 170 на иностранных языках. Изложена на 113 страницах машинописи, содержит 12 рисунков и 3 таблицы.