Введение к работе
Актуальность работы. Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка высокоэффективных препаратов иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты имеют ряд преимуществ перед свободными (нативными) ферментами: более высокую стабильность, возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов, способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов и многократное их применение.
Среди гидролитических ферментов -фруктофуранозидаза (2,1--D-фруктофуранозид-фруктогидролаза, инвертаза, К.Ф. 3.2.1.26) занимает важное место ввиду возможности ее использования в реакциях гидролиза сахарозы с целью получения инвертного сиропа, широко используемого в пищевой промышленности. Однако ферментативный процесс получения инвертных сиропов имеет ряд недостатков: нестабильность активности фермента, его высокая стоимость, однократность использования. Эти недостатки можно устранить с помощью иммобилизации -фруктофуранозидазы.
На сегодняшний день изучаются различные методы иммобилизации -фруктофуранозидазы, такие как физическая сорбция на гидрофобных адсорбентах, включение в гидрофобные гели, ковалентная иммобилизация на нейлоне и др. Предлагаемые способы иммобилизации, как отечественных, так и зарубежных исследователей, чаще всего основаны на ковалентном присоединении фермента к носителю с использованием дополнительных агентов (глутаровый альдегид, ангидрид и др.), что усложняет процесс, а также имеют достаточно высокую стоимость носителя. При этом свойства иммобилизованного препарата и кинетические характеристики реакции гидролиза сахарозы недостаточно изучены. Большинство работ по выбору наиболее перспективных носителей для иммобилизации -фруктофуранозидазы принадлежат зарубежным исследователям: Huang Chen-ta и Lee Wen-Chien (1994), Basha S.Y., Palanivelu P. (2000), Belcarz A., Ginalska G. (2002) и другим ученым. В России известные способы получения инвертного сиропа с применением иммобиллизованного фермента инвертазы немногочисленны, предусматривают применение дорогостоящих носителей для иммобилизации, не могут быть рекомендованы к применению в промышленных масштабах из-за малого выхода конечного продукта. Все выше изложенное свидетельствует об актуальности исследований в данном направлении.
Перспективным способом получения инвертного сиропа является гидролиз сахарозы иммобилизованной -фруктофуранозидазой Kluyveromyces marxianus Y-303, каталитическая активность которой в 2-3 раза превышает активность -фруктофуранозидаз известных и описанных в литературе продуцентов.
Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежского государственного университета инженерных технологий по проблеме «Научные основы и практическое применение биокаталитических технологий в биоконверсии природных полимеров» и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники».
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось получение иммобилизованного ферментного препарата -фрукто-фуранозидазы Kluyveromyces marxianus Y-303 с максимальным сохранением активности и стабильности фермента и разработка битехнологии инвертного сиропа с его применением.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
– получение высокоочищенного ферментного препарата -фруктофуранозидазы Kluyveromyces marxianus Y-303;
– выбор и обоснование применения эффективного носителя для иммобилизации -фруктофуранозидазы;
– оптимизация условий иммобилизации -фруктофуранозидазы;
– сравнительная характеристика физико-химических свойств свободной и иммобилизованной -фруктофуранозидазы, кинетических и термодинамических параметров кислотной и термической инактивации фермента;
– изучение кинетических характеристик реакции гидролиза сахарозы имобилизованным ферментом;
– разработка биотехнологии инвертного сиропа с применением иммобилизованной -фруктофуранозидазы.
Научная новизна. Впервые получен иммобилизованный ферментный препарат -фруктофуранозидазы Kl. marxianus Y-303 на волокнистом ионообменнике марки ФИБАН А-6 и исследованы физико-химические и каталитические свойства иммобилизованного фермента. Выявлены закономерности процесса термической и кислотной инактивации фермента. Изучены кинетические характеристики ферментативного гидролиза сахарозы иммобилизованным ферментным препаратом, установлено увеличение кратности использования фермента в реакции гидролиза сахарозы и сохранение высокой каталитической активности при длительном его хранении.
Научная новизна технических решений подтверждена патентом РФ «Способ получения иммобилизованной -фруктофуранозидазы» № 2327738 от 27.06.2008 г.
Практическая значимость работы. Получен высокостабильный биокатализатор путем адсорбционной иммобилизации -фруктофуранозидазы на волокнистом ионообменнике марки ФИБАН А-6, отличающийся многократностью использования в нескольких реакционных циклах и стабильностью при длительном хранении. Разработана биотехнология инвертного сиропа с применением иммобилизованной инвертазы, позволяющая удешевить стоимость целевого продукта.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях Воронежского государственного университета инженерных технологий (2004, 2005, 2012 гг.)
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 6 работ, в том числе 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК, получен патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка используемой литературы и представлена на 135 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 21 рисунок и
15 таблиц. Библиография содержит 202 наименования, в том числе 117 зарубежных авторов.
Похожие диссертации на Разработка технологии иммобилизованной -фруктофуранозидазы, исследование ее физико-химических свойств и практическое применение
