Содержание к диссертации
Введение
1 Аналитический обзор 9
1.1 Состояние технологии производства биопрепаратов всовременных условиях 9
1.1.1 Получение препаратов стимулирующего действия 11
1.1.2 Получение препаратов гормонального действия 14
1.1.3 Получение препаратов азотфиксирующего действия 14
1.1.4 Биохимические основы действия биопрепаратов 19
1.1.5 Биопрепараты растительного происхождения на мировом рынке 31
1.2 Биотехнологические способы выращивания растительного сырья in vitro для получения биопрепаратов 32
1.2.1 Растительные клеточные культуры in vitro как источник био-логически активных веществ 32
1.2.2 Направления развития биотехнологических способовполучения биопрепаратов 36
1.3 Биотехнологические способы выращивания симбиотических клеточных культур in vitro для получения биопрепаратов 39
1.3.1 Симбиоз растительных клеточных культур in vitro с микро-организмами как источник биологически активных ве-ществ 39
1.3.2 Аэробные метилотрофные бактерии в симбиозе с высшими растениями. 39
1.4 Структурированные сорбенты в биотехнологических процессах 42
1.4.1 Применение структурированных нанобиокомпозитов для стимуляции роста растений in vitro 43
1.4.2 Получение товарных форм препаратов из растительногосырья на структурированных сорбентах 44
2 Методическая часть 46
2.1 Объект исследования 46
2.1.1 Характеристика растений 46
2.1.2 Характеристика бактерий рода Methylobacterium 48
2.1.3 Характеристика структурированных сорбентов 49
2.1.4 Питательные среды 50
2.2 Методы исследования 52
2.3 Оптимизация состава питательных сред и режимовкультивирования 60
3 Технология получения биопрепаратов с использованием клеточ-ных культур in vitro при иммобилизации на структурированных носителях 61
3.1 Стадия получения культуры растительных клеток и тканей in vitro 61
3.1.1 Отбор и стерилизация растительных эксплантов 62
3.1.2 Инициация каллусогенеза in vitro 66
3.2 Стадия выращивания культуры растительных клеток и тканей in vitro 70
3.3 Стадия каллусогенеза в симбиозе культуры растительныхклеток и тканей in vitro с метилобактериями Methylobacterium mesophilicum 71
3.4 Стадия получения биопрепаратов из растительной клеточнойкультуры in vitro с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum 72
3.4.1 Получение биопрепаратов стимулирующего иазотфиксирующего действия 72
3.4.2 Оценка стимулирующей активности биопрепаратов 80
3.4.3 Определение фитогормонов в экстрактах из культуры клеток растений in vitro 83
3.4.4 Получение биопрепаратов гормонального действия 84
3.5 Стадия получения препаративных форм 86
3.5.1 Исследование свойств структурированных носителей 86
3.5.2 Сушка порошкообразных биопрепаратов 88
3.5.3 Таблетирование сухих биопрепаратов 91
4 Практические применения полученных результатов и экономический эффект от их внедрения 93
4.1 Экологические проблемы и способы их решения 93
4.2 Технологический процесс получения биопрепаратов из расти-тельных клеточных культур in vitro с метилотрофными бактерия-ми на структурированных сорбентах 94
4.3 Рекомендации по применению структурированных носителей и рациональному использованию производственных ресурсов при получении биопрепаратов из растительных клеточных культур in vitro с метилотрофными бактериями 98
4.4 Экономические аспекты 108
Выводы 109
Библиографический список 111
- Получение препаратов азотфиксирующего действия
- Растительные клеточные культуры in vitro как источник био-логически активных веществ
- Характеристика бактерий рода Methylobacterium
- Стадия каллусогенеза в симбиозе культуры растительныхклеток и тканей in vitro с метилобактериями Methylobacterium mesophilicum
Получение препаратов азотфиксирующего действия
Препараты для повышения урожайности сельскохозяйственных куль-тур также получали на основе ассоциативных азотфиксаторов - бактерий рода Аzоsрirillит, обитающих в ризоплане или гистосфере корней и на зеле-ных частях растений. Фиксация азота в хозяйственно значимых величинах происходит в ассоциации азоспирилл с С4-растениями - кукурузой, сахар-ным тростником, просом. Во Вьетнаме и других южных странах в качестве зеленого удобрения используют водный папоротник Аzоllа, в полостях лис-тьев которого обитает азотфиксирующая цианобактерия Апаbаепа azоllа. Такой симбиотический комплекс интенсивно усваивает молекулярный азот. Азоллу выращивают в прудах и вывозят на рисовые поля, получая сущест-венную прибавку урожая [33, 34].
Применяются также свободноживущие азотфиксирующие цианобакте-рии для обогащения почв азотом. Показана принципиальная возможность по-лучать с их помощью из N2 аммиак в промышленных условиях. Для этого могут быть также использованы фототрофные пурпурные бактерии, которые способны к фиксации молекулярного азота в ходе фотосинтеза [33, 34].
Наиболее распространенный метод инокуляции бобовых растений - предпосевная обработка семян препаратами клубеньковых бактерий. Семе-на увлажняют 2,0 - 2,5 % воды (от их массы), прибавляют ризоторфин и тщательно перемешивают вручную (перелопачивание) или в машинах, предназначенных для протравливания семян. Расход ризоторфина - 200 г на гектарную норму любых семян бобовых. Обработку проводят в день посева. Другой способ инокуляции: ризоторфин суспендируют в воде и суспензией обрабатывают семена. По ТУ в ризоторфине должно содержаться не менее 2,5 млрд/г клеток клубеньковых бактерий. Доза, которая наносится на каж-дое семя: для гороха - 0,3 млн; сои - 0,5 млн; клевера, люцерны - 0,06 млн. Величина определяется числом семян, высеваемых на гектар [23]. Результа-ты использования ризоторфина показывают прибавку урожая культур: сои (зерно) – 2,5-3,0 ц/га, гороха (зерно) на 1,0-1,5 ц/га, люпина (зерно) – 1,0-1,5 ц/га, люцерны, клевера, сена – 5,0-10,0 ц/га [6, 35].
Количество фиксированного азота пропорционально количеству бакте-рий, попадающих на корень. Высокая степень исходной инокуляции опре-деляет большую вероятность попадания клубеньковых бактерий в зону рас-положения корня с учетом низкого коэффициента его инокуляции. Это свя-зано с тем, что в оболочке семян многих видов или сортов бобовых содер-жатся вещества фенольной природы, оказывающие ингибирующее действие на клубеньковые бактерии. Эпифитные микроорганизмы, особенно актино-мицеты и псевдомонады, также снижают их число. Кроме того, при прорас-тании семян большинства бобовых происходит «вынос» семядолей вместе с инокулятом на поверхность почвы, что также ведет к потере половины кле-ток бактерий. Прорастание семян в относительно сухой почве приводит к массовой гибели клубеньковых бактерий. «Противостоять» всем этим при-чинам может только очень большое число клеток, взятых для инокуляции [30-33]. Инокуляция семян с биологической точки зрения прием неудовлет-ворительный, но простой в исполнении и широко применяемый. К другим способам инокуляции относятся обработка корней проростков, нанесение культуры бактерий на цветки бобовых, внесение больших количеств препа-рата в почву. Удобной формой оказался гранулированный препарат, вноси-мый в почву вместе с семенами, но расход такого препарата достигает не-скольких десятков кг/га, что экономически не всегда оправдано. При внесе-нии суспензии клубеньковых бактерий в почву глубже расположения высе-ваемых семян нужны особые конструкции сеялок [23, 35]. Таким образом, применение препаратов азотфиксирующих микроорга-низмов рассматривается как способ обеспечения растений азотом с пре-имуществами хозяйственного, экологического и социального характера по сравнению с традиционным использованием азотных минеральных удобре-ний.
Метаболизм стимуляторов роста в высших растениях Стимуляторы, добавляемые в питательную среду в микроколичествах, позволяют увеличивать выход целевого продукта, сокращать продолжи-тельность процесса и удельный расход сырья. Механизм стимулирующего влияния компонентов может быть различным. Стимулятор часто является фактором роста, влияющим на физиологическую активность клеток. К ним относят: витамины; пептиды, аминокислоты, пурины, пиримидины, органи-ческие кислоты, углеводы и гормоны. Эффект объясняют несбалансирован-ностью состава питательной среды по факторам роста, либо неспособно-стью клеток синтезировать метаболиты в достаточном количестве [35, 36].
Современные исследования показывают, что при стрессе в растении включаются защитные механизмы, основанные на деградации биополимеров и липидов. Отмечают множественную роль этих процессов катаболизма [36-38]: - роль корректирующего фактора – деструкция обеспечивает устране-ние биополимеров с ошибочной или нарушенной структурой; - субстратная роль – процессы катаболизма снабжают синтез биополи-меров мономерными субстратами, а синтез липидов - ацетатом, что важно в условиях недостаточного насыщения клеток этими веществами; - энергетическая роль – при вовлечении мономерных продуктов и аце-тата в процессы дыхания образуются АТФ и НАД(Ф)Н, обеспечивающие протекание реакций синтеза сложных соединений из простых; - сигнальная функция – некоторые элиситоры - олигонуклеотиды, оли-гопептиды и олигосахариды – продукты деградации соответствующих по-лимеров, а также промежуточные продукты деградации липидов обладают свойствами гормонов или активаторов и ингибиторов различных процессов метаболизма и оказывают влияние на рост и морфогенез растений. В 1991 г. выдвинута концепция о сигнальных свойствах олигомерных промежуточных продуктов катаболизма, реализуемых путем воздействия на транскрипцию, трансляцию или на активность ранее образованных молекул ферментов, связанных с процессами синтеза (рисунок 1). Усиление деграда-ции и увеличение содержания промежуточных продуктов катаболизма акти-вирует синтез новых биополимеров вместо разрушающихся [37-39].
Интенсивность процессов деградации меняется в ходе онтогенеза и за-висит от условий существования растений: наиболее низкая - у покоящихся семян и клубней. Выход из состояния покоя активирует распад
Растительные клеточные культуры in vitro как источник био-логически активных веществ
Органический азот почвы может быть превращен в впроцессе аммонификации – разложения органического вещества гетеротрофными бактериями (родов Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Arthrobacter, Proteus). Пополнение пула нитратного азота почвы обеспечивают бактерии нитрификаторы, которые используют для жизнедеятельности энергию окисления аммония до нитрата (бактерии родов Nitromonas, Nitrococcus, Nitrosolobus). При этом происходит обратный процесс – денитрификация [2]. Общая мировая биологическая фиксация азота составляет 17,2107 т в год, что в 4 раза превышает химическое связывание азота. Организмы, спо-собные к усвоению азота воздуха, делят на группы [6]:
1) симбиотические азотфиксаторы – микроорганизмы, усваивающие атмосферы, только в симбиозе с высшим растением (бактерии рода Rhi-zobium - с бобовыми растениями: сначала бактерии проникают в клетку корневого волоска растения-хозяина, затем мигрируют в клетки коры и вы-зывают интенсивное деление инфицированных клеток, что приводит к обра-зованию клубеньков на корнях, а бактерии превращаются в крупные бакте-роиды);
2) не симбиотические азотфиксаторы – микроорганизмы, свободно живущие в почве и усваивающие азот воздуха;
3) ассоциативные азотфиксаторы – ризосферные микроорганизмы, обитающие на поверхности корневой системы злаков и других культур (наиболее изучены бактерии из рода Azospirillum, такой же способностью обладает ряд штаммов бактерий рода Methylobacterium) [26, 27].
Открытие азотфиксаторов привело к созданию бактериальных удобре-ний (нитрагин, ризотрофин, азотобактер и др.). Эти удобрения содержат ес-тественные почвенные организмы и позволяют увеличить накопление био-массы высшими растениями (разд. 1.1.3) [13, 35]. Перспективность такой технологии в том, что она позволяет частично заменить минеральные удобрения и снизить уровень загрязнения, вызван-ный их интенсивным использованием.
Метаболизм фитогормонов в высших растениях Фитогормоны - регуляторы роста растений. Взаимодействие между от-дельными клетками в растении осуществляется гидравлическим способом, электрическими сигналами и химически – с помощью фитогормонов, кото-рые осуществляют координацию взаимодействия клеток, тканей и органов в растении, регуляцию функций и обеспечивают целостность организма, за-пуск физиологических и морфогенетических программ. Фитогормоны опре-деляют ответные реакции растения на разные внешние воздействия [42, 43].
Группы фитогормонов включают ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизовую кислоту, этилен, брассиностероиды, жасмоновую и салициловую кислоты, а также полипептид системин. Очень редко фитогормоны функцио-нируют в одиночку, эмпирически трудно вычленить эффекты, оказываемые при их экзогенном применении. Даже если ткани обрабатываются одним фи-тогормоном, наблюдаемый эффект будет определяться также другими эндо-генными гормонами. Взаимодействие отдельных фитогормонов в организме растения может осуществляться как в процессе их синтеза, транспорта и ка-таболизма, так и на уровне механизма действия. Элементы рецепции и пере-дачи сигнала для фитогормонов могут быть общими [42-44]. Этилен и абсцизовая кислота являются ингибиторами роста растений. В стрессовых ситуациях, связанных с низкими температурами, затоплением, водным стрессом, облучением, засолением, снижается содержание активато-ров ауксинов, цитокининов, гиббереллинов. Накопление ингибиторов приво-дит к торможению активного состояния клеток и тканей in vitro, в которых снижается синтез белков, нуклеиновых кислот, и замедляется их рост [45-48].
Специфические особенности ИУК, отличающие ее от других фитогор-монов, можно описать пятью эффектами [46-48]: - индукция удлинения изолированных колеоптилей или отрезков стебля; - индукция деления клеток в каллусной культуре в присутствии цито-кинина; - стимуляция образования боковых корней у стеблевых черенков; - индукция образования этилена.
ИУК присутствует практически во всех тканях растительного организ-ма, и в наибольших количествах - в молодых почках и листьях, цветках, камбии, проводящей системе, семенах. Биосинтез ИУК наиболее активно идет в апикальных меристемах побегов, молодых листьях, развивающихся плодах. Набор ферментов для синтеза ауксина содержится в хлоропластах и митохондриях. На ранних этапах развития основным источником ИУК и других фитогормонов являются эндосперм и семядоли, которые обеспечи-вают гормонами формирующуюся корневую систему и надземную часть растений. Скорость перемещения ауксина по живым клеткам в растении 10 мм/ч [49, 50].
ИУК очень нестойкое вещество, быстро разлагается в растительных клет-ках, особенно под действием света и ферментативной системы ИУК – оксида-зы. Механизм поглощения ауксина клеткой включает две фазы [49, 50]: - обратимое поглощение по механизму, близкому к диффузии, между клеткой и окружающей средой устанавливается равновесие; - метаболическое накопление, при котором ауксин связывается с раз-личными компонентами клетки. Некоторые индольные соединения обладают сходным с ИУК физиологи-ческим действием и относятся к синтетическим аналогам ауксина. Производ-ные индола – индолил-3-пропионовая (ИПК) и индолил-3-маслянная (ИМК) кислоты крайне редко встречаются в природе. ИМК менее подвержена разру-шению в тканях и применяется для индукции корнеобразования [48-50].
Известно, что очень сильной ауксиновой активностью обладает неко-торые хлорзамещенные феноксипроизводные: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д); 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5 –Т) и др. Вы-сокая активность этих соединений объясняется их устойчивостью к разру-шению и связыванию. Производные нафтилалкилкарбоновых кислот: 1-нафтил-уксусная кислота (-НУК) (3) или ее калийная соль (КАНУ), 2-нафтокси-уксусная кислота (2-НОУК). -НУК хорошо проникает в расти-тельные ткани и легко в них передвигается, в отличие от 2,4-Д [1]. Физиоло-гические эффекты ауксинов выражены в индукции клеточных делений, в соз-дании условий для репликации ДНК, включающих в себя стимулирование дыхания, синтеза РНК и белков. Это проявляется в регуляции растяжения, деления, дифференцировки и дедифференцировки тканей растения. Ауксины индуцируют корнеобразование, что важно в биотехнологии и практике рас-тениеводства [26, 34, 35, 51].
Характеристика бактерий рода Methylobacterium
На данной технологической стадии определяли эффективность каллу-согенеза в культуре растительных клеток и тканей in vitro на агаре, МКЦ, МХПЦ и F-24. В стерильных условиях через 7 сут после введения эксплан-тов из различных частей растений в культуру, инициированные экспланты пересадили, на свежую питательную среду МС на разных носителях, содер-жащую 0,5 мг/л кинетина и 2 мг/л – НУК. Культивирование каллуса про-водили в термостате при температуре (25±2) С, относительной влажности 70,0 % в темноте в течение 4 недель. В случае использования в качестве но-сителя сорбента F-24 состав среды МС пересчитывали по содержанию Fe, Mg, K, Ca. Результаты представлены на рисунке 10.
Результаты на рисунке 10 показывают, что для всех культур клеток и тканей in vitro на выбранных носителях наблюдается рост биомассы каллу-са, следовательно, возможна замена носителя агара среды МС на МХПЦ, МКЦ и F-24. При этом неорганический носитель F-24 уступает целлюлозо-содержащим МХПЦ и МКЦ. Для гороха (70 %) и гречихи (45 %) был луч-шим МХПЦ, для картофеля (55 %) и сои (40 %) – МКЦ, а для пшеницы оди-наковые результаты (40 %) – на МКЦ и МХПЦ.
Стадия каллусогенеза в симбиозе культуры растительных клеток и тканей in vitro с метилобактериями Methylobacterium mesophilicum На этой стадии опрелеляли влияние симбиоза с метилобактериями Mehylobacterium mesophilicum на эффективность каллусогенеза в раститель-ных клеточных культурах in vitro при отсутствии синтетических гормонов и соединений азота в питательной среде МС на разных носителях.
Культивирование растительного каллуса in vitro проводили сначала на агаризованной среде МС с использованием метилобактерий Methylobacterium mesophilicum штамм B-3352 в течение 7 сут. Учитывали способность метилобактерий к азотфиксации и синтезу фитогормонов, а также синтез метанола растительными клетками для метилобактерий, не до-бавляя их в среду МС.
Сравнительная диаграмма в динамике показывает влияние симбиоза с метилобактериями на эффективность каллусогенеза в клеточных культурах гороха in vitro на безгормональной среде с азотом и без него.
Каллусогенез в клеточных культурах гороха в результатах, представ-ленных на рисунке 11, в симбиозе на безгормональной среде МС на агаре говорит о том, что метилобактерии синтезировали необходимые фитогор-моны, а на среде МС без источников неорганического азота это подтвержда-ет также проявление азотфиксирующей способности метилобактерий в сим-биозе с культурой клеток гороха in vitro. При этом симбиотические культу-ры на среде без азота показали более высокую эффективность каллусогене-за, чем культуры на среде с неорганическим азотом. С другой стороны, рас-тительные клетки синтезировали метанол, обеспечивший в симбиозе рост метилобактерий. Подобные результаты получены для всех растительных культур in vitro. Выявленные оптимальные режимы размножения симбиоти-ческой каллусной биомассы in vitro применяли при промышленном получе-нии биопрепаратов разного действия (рисунок 25).
На первом этапе по содержанию общего белка и концентрации свобод-ных аминокислот в экстрактах из разных частей растений определили тип экстрагента, его концентрацию и режимы УЗ-обработки для получения жидких биопрепаратов из нативных растений, а также определения возмож-ных условий культивирования их клеточных культур in vitro при интенси-фикации.
К неспецифическим стимуляторам относятся аминокислоты и олиго-пептиды, которые могут быть получены при депептонизации белков сырья, поэтому на этой стадии сначала оценивали условия извлечения белков по общему их содержанию в экстрактах из различных частей растений с вариа-цией гидромодуля и режимов УЗ-обработки. Разрушение белков в экстракте оценивали по изменению массовой концентрации свободных аминокислот в тех же экстрактах (рисунки 12-19). Для приготовления экстрактов использо-вали листья, стебли, корни нативных растений. В водных растворах варьи-ровали гидромодуль (1:20; 1:40; 1:60; 1:80; 1:100), вводно–спиртовых – кон-центрацию этанола от 10 % до 90 %. Установили, какие режимы УЗ приво-дят к максимальному извлечению общего белка, и какие – к разрушению белка до пептидов, если аминокислот в экстракте при этом не появилось.
Из диаграммы (рисунок 12) видно, что максимальное содержание об-щего белка в водных экстрактах из листьев и стеблей гречихи было при гид-ромодуле 1:60, из корней – 1:20. Минимальное содержание общегобелка в водных экстрактах из листьев, стеблей и корней – при гидромодуле 1:100. Температура (30±2) С, перемешивание
Гидромодуль: листья, стебли – 1:60, корни – 1: Рисунок 14– Влияние концентрации этилового спирта на содержание общего белка в экстрактах из частей нативной гречихи
По результатам на рисунке 14 видно, что максимальное содержание общего белка в водно-спиртовом экстракте из листьев и стеблей гречихи было получено при концентрации экстрагента 60,0 %, из корней - при кон-центрации 10,0 %. Минимальное содержание общего белка в водно-спиртовом экстракте из листьев, стеблей и корней при концентрации экстра-гента 90,0 %.
Температура (30±2) С, перемешивание. Гидромодуль: листья, стебли – 1:60, корни – 1: Рисунок 15 - Влияние концентрации этилового спирта на массовую концен-трацию свободных аминокислот в экстрактах из частей нативной гречихи На рисунке 15 показано, что на титрование водно-спиртовых экстрак-тов из листьев гречихи при концентрации экстрагента 60 % пошло наи-большее количество NaOH. Соответственно, содержание свободных амино-кислот достигает максимального значения при данной концентрации экст-рагента. Для водно-спиртовых экстрактов из стеблей максимальное содер-жание свободных аминокислот – при концентрации экстрагента – 90 %, из корней – максимум при концентрации 70 %.
Стадия каллусогенеза в симбиозе культуры растительныхклеток и тканей in vitro с метилобактериями Methylobacterium mesophilicum
При культивировании с применением сорбентов использовали сетку с размером ячеек 0,071 мм из нержавеющей стали. Ультразвуковой излуча-тель устанавливали в отверстие на крышке ферментера.
Рекомендации по применению структурированных носителей и рациональному использованию производственных ресурсов при получении биопрепаратов из культуры растительных клеточных культур in vitro с метилотрофными бактериями
В цехе опытно-промышленного производства ЗАО «Алтайвитамины», а также на предприятии ООО «Биоресурс» получена опытная партия сухих гранулированных и таблетированных биопрепаратов из разного раститель-ного сырья in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacte-rium mesophilicum на структурированных сорбентах МКЦ, МХПЦ и F-24. Разработаны рекомендации по оптимизации и интенсификации технологи-ческого процесса, приведенные ниже. На их основе разработаны и утвер-ждены изменения к ТУ 0392-001-75141787 и Технологическому регламенту (Приложение И).
Рекомендации по технологии промышленного получения сухих порошкообразных биопрепаратов для сельского хозяйства с применением структурированных сорбентов МКЦ, МХПЦ и F-24 на предприятии ООО «Биоресурс» 1. Подготовку азотфиксирующих мелилотрофных бактерий Methylobacterium mesophilicum вести на питательной среде Канеда при температуре (26±2) С в течение 30 сут до концентрации клеток ( 3,8109 КОЕ/мл). 2. Подготовку клеточной растительной культуры in vitro из различных эксплантов, стерилизованных одним из способов (Приложение Е), вести на питательной среде Мурасиге – Скуга (Приложение Е) без агара соответст-вующей модификации на выбранных носителях (200 г/л) (Приложение Е) при температуре (26±2) С в течение 7 сут. 3. Накопление биомассы культуры растительных клеток и тканей in vitroв симбиозе с Methylobacterium mesophilicum при иммобилизации на вы-бранных носителях (200 г/л) (Приложение Д) с добавлением жидкой на пи-тательной среде Мурасиге – Скуга (Приложение Е) без агара, метанола, азо-та, синтетических гормонов, оптимизированной по Na, K, Ca, Mg, Fe вести при температуре (26±2) С в течение 30 сут. 4. Обработку симбиотических биопрепаратов на выбранных носителях перед фасовкой вести с применением УЗ-обработки, режимы которой указа-ны в таблице 10. 5. Сушку вести на носителях при 40-50 С в течение 1 сут до влажности не более 5,0 %. 6. Дробление не требуется. 7. Фасовка в полиэтиленовые мешки по 200 г.
Основные стадии технологии изготовления опытно-промышленных партий биопрепаратов на основе клеточных культур in vitro с применением структурированных сорбентов в сравнении со стандартной технологией изго-товления сухих гранулированных и таблетированных препаратов
Сравнение технологии изготовления сухих гранулированных и табле-тированных препаратов и стандартной технологии изготовления опытно-промышленных партий биопрепаратов на основе клеточных культур in vitro с применением структурированных сорбентов приведено в таблице 18.
Постадийное сравнение разработанной технологии с техно-логией производства сухих гранулированных и таблетированных препаратов Стадия Технология изготовления опытно-промышленных пар-тий биопрепаратов на основе клеточных культур in vitro с применением структурированных сорбентов. Подготовка сырья Для изготовления таблеток использовать культуру кле-ток и тканей in vitro (растительное сырье) с влажностью не более 5,0 %, измельчённую на вибромельнице ВМ-60.
Просеивание сырья Изготовление гранул Смешение и увлаж-нение компонентов В смеситель загружают взвешенное количество компо-нентов для получения партии биопрепарата «Таблетки (F-24)» ангро, массой 60,60 кг). Тщательно перемеши-вают 20 мин. Смеситель периодически останавливают и перемешивают совком вручную. Влажность смеси не более 5,0 %.
Измельчённое растительное сырье in vitro(из расчёта 0,406 г на 1 таблетку), кг 20,48
Гранулирование Для грануляции используют диск с отверстиями 3 мм. Загрузку массы из смесителя производят через воронку. Масса, попадая на лопастную головку, протирается че-рез отверстия цилиндра и попадает в приёмный бункер самотёком.
Сушка Полученную смесь сушат в кипящем слое сушилки. Влажный таблеточную смесь загружают в резервуар и помещают в сушильную камеру, дверь плотно закры-вают, включают сушилку. Сушат воздухом, нагретым до (45±5) С до остаточной влажности (2,0-3,0) %. Вы-сушенный гранулят протирают вручную через сито с диаметром отверстий 2 мм.
Приготовление таб-леточной смеси. Таб-летирование Приготовленную таблеточную смесь таблетируют на РТМ - 41. Таблетки имеют физико-химические показа-тели:- средняя масса 1 таблетки - 2,5 г;- распадаемость - до 23 мин.Таблетки соответствуют требованиям ТУ 9197-049-05783969-03. При выпуске опытно-промышленных пар-тий возможны корректировки технологии изготовления и рецептурного состава.
Таким образом, разработанная технология изготовления биопрепаратов на основе клеточных культур in vitro с применением структурированных сор-бентов позволяет упростить и, следовательно, удешевить процесс за счет ис-ключения стадии просеивания, гранулирования на этапе приготовления табле-точной смеси, и уменьшения количества компонентов при опудривании табле-ток.
Оценка стимулирующей и гормональной активности биопрепаратов осу-ществлялась определением скорости роста корней и стеблей у проростков сельскохозяйственных культур (таблицы 19-23). Стимулирующее действие препаратов оценивали по энергии прорастания на 3 сут и способности прорас-тания на 5 сут семян всех с/х культур. Сравнивали с контролем, который осу-ществлялся при поливе семян водой, а также обрабатывали растительным экс-трактом и суспензией метилобактерий. Оценку гормональной активности препаратов осуществляли по замерам величины корней и стеблей у проростков из семян сельскохозяйственных культур в течение семи сут. Сравнивали с контролем, который осуществлялся при поливе семян водой.
Похожие диссертации на Разработка технологии получения биопрепаратов с использованием клеточных культур in vitro на структурированных носителях
