Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 История открытия возбудителя 10
1.2 Биологические свойства 11
1.3 Патогенность и факторы вирулентности 14
1.4 Механизмы патогенеза инфекции H. parasuis 22
1.5 Эпизоотология гемофилезного полисерозита свиней 26
1.6 Методы идентификации возбудителя и диагностики гемофилезного полисерозита 27
1.7 Заключение по обзору литературы 33
2 Собственные исследования 35
2.1 Материалы 35
2.2 Методы 41
2.3 Результаты собственных исследований
2.3.1 Изучение биологических свойств изолятов H. parasuis 47
2.3.2 Изучение патогенности изолятов на естественно восприимчивых животных
2.3.3 Молекулярно–биологические свойства изолятов H. parasuis 52
2.3.4 Определение корреляции между наличием генов, кодирующих факторы
патогенности, и биологическими свойствами изолятов 55
2.3.5 Протеомические свойства штаммов и изолятов H. parasuis 57
2.4 Разработка тест–систем для идентификации штаммов H. parasuis 63
2.4.1 Разработка тест–системы для идентификации штаммов H. рarasuis на основе ПЦР–РВ 63
2.4.2 Разработка тест–системы для идентификации H. parasuis методом MALDI– TOF MS 72
2.5 Обсуждение результатов 77
3 Выводы 88
Практические предложения 89
Список сокращений 90
Список литературы 92
Список иллюстративного материала
- Биологические свойства
- Эпизоотология гемофилезного полисерозита свиней
- Результаты собственных исследований
- Разработка тест–системы для идентификации штаммов H. рarasuis на основе ПЦР–РВ
Биологические свойства
Клинические признаки неспецифичны и поэтому обязательно проводится лабораторные исследования патматериала от больных и вынужденно убитых животных. Патологическое поражение. Наличие во время вскрытия фибринозно– гнойного экссудата на поверхности слизистой оболочки, обычно в брюшине, перикарде, плевре или на поверхности сустава. Признаками гистопатологии в тканях при фибринозном воспалении являются инфильтраты нейтрофилов и, в меньшей степени, макрофагов. В более тяжелых случаях, менингит, тромботический менингоэнцефалит, сопровождается увеличением количества спинномозговой жидкости и артритом. Поражение легких не всегда наблюдают даже в случаях выделения H. parasuis из легких. При обнаружении септицемии, петехии и экхимозе в печени, почках и мозге часто встречают одновременно с повышением уровня эндотоксинов в плазме крови и тромбов фибрина в различных органах. Острые случаи сепсиса с признаками цианоза, подкожного отека и отека легких более редки, типичных признаков воспаления слизистой оболочки при болезни животные не проявляют. При дифференциальной диагностике необходимо в первую очередь исключить инфекцию S. suis. В случае системного заболевания фибринозный плеврит может развиться также из–за других бактериальных инфекций таких, как А. pleuropneumoniae [68, 132].
Выделение H. parasuis из клинических образцов. Выделение H. parasuis из клинических образцов производят на кровяном агаре рядом с культурой золотистого стафилококка, выступающего в качестве источника NAD, на шоколадном агаре или на NAD содержащей PPLO агар. Культивирование занимает около 24–48 ч [92]. H. parasuis является одним из требовательных микроорганизмов: его выделение из клинических образцов, как правило, осложняется контаминантами. Поэтому иногда необходимо применение разведений патологического материала для посева на агар или выращивание культуры на среде с антибиотиками такими, как линкомицин и бацитрацин [136]. Так как H. parasuis является комменсалом верхних дыхательных путей, то выделение культуры из дыхательных путей не всегда является свидетельством инфекции и важен факт выделения H. parasuis из мозга или из суставов [121]. При успешном выделении H. parasuis–подобных микроорганизмов должны быть проведены биохимические тесты для дифференциации от других негемолизирующих NAD–зависимых бактерий, таких как Actinobacillus indolicus, Actinobacillus porcinus и Actinobacillus minor [120, 133].
Диагноз на гемофилезный полисерозит в Российской Федерации устанавливают в соответствии с «Временными методическими указаниями по лабораторной диагностике гемофилезного полисерозита свиней», утвержденными ГУВ МСХ СССР №116–18 от 17.10.1978 г. на основании анализа эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с обязательным учетом результатов бактериологического исследования материала от павших или вынужденно убитых животных.
Идентификацию возбудителя проводят при определении морфологических, культуральных, тинкториальных, биохимических и серологических свойств бактерий и дифференцируют их от других негемолитичных NAD–зависимых бактерий, таких как A. indolicus, A. porcinus и A. minor. Серологическое типирование изолятов H. parasuis. Как отмечалось выше, при помощи ИД теста со специфической антисывороткой кролика выделены 15 сероваров H. parasuis (1 – 15) [97]. Было опубликовано несколько исследований, по сравнению различных методов серологического типирования штаммов H. parasuis: иммунодиффузии (ИД), непрямой гемаглютинации (РНГА), реакции коагглютинации [59, 63, 161].
Turni и Blackall (2005) сравнили ИД и РНГА на полевых изолятах. Авторы использовали валидированные способы получения антигена для использования реакции иммунодиффузии при серотипировании по схеме Kielstein и Rapp– Gabrielson [161]. С помощью реакции РНГА они обнаружили больше нетипируемых изолятов (44%), чем в ИД (41%). Результаты исследований Del Rio и соавт. (2003) и Tadjine и соавт. (2004) показывают, что наиболее подходящим методом серотипирования H. parasuis является РНГА. Использование РНГА снижает долю серологически нетипируемых штаммов (по сравнению с ИД и реакцией коагглютинации) до менее чем 10% [59, 63]. Однако эти два исследования имеют недостаток: в них не использовали референтные штаммы, используемые во всем мире. Кроме того, Tadjine и соавт. использовали методику получения антигена, которая никогда не была валидирована вместе с методом гель–диффузии (ГД). Таким образом, все полученные результаты должны быть валидированы вместе и приниматься с осторожностью. Причинами существования нетипированных изолятов может быть то, что некоторые штаммы не содержат достаточного количества серовар–специфических антигенов связи с чем агглютинация проходит очень слабо или из–за наличия еще не идентифицированных сероваров. Разница между тестами ИД и РНГА состоит в том, что для ИД используется растворимый, естественно преципитирующий антиген, а в РНГА используются эритроциты, покрытые растворимым антигеном, которые в присутствии антител агглютинируют, в результате чего чувствительность РНГА до 3000 раз выше, чем у ИД.
Эпизоотология гемофилезного полисерозита свиней
Целью данного этапа работы было изучение биологических свойств 5 штаммов и 13 изолятов H. parasuis, выделенных на территории РФ сотрудниками ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала больных животных в период с 2000 по 2011 год. Десять изолятов были любезно предоставлены Н.В. Воложанцевым (ФБУН ГНЦ ПМБ).
Для подтверждения вида H. parasuis необходимо было проверить биологические, морфологические, культуральные, биохимические свойства этих штаммов и наработать биомассу. Все культуры закладывали в коллекцию микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» в лиофилизированном виде.
Морфологические свойства. При росте на колумбийском агаре или агаре Difco с добавлением V–фактора бактерии H. parasuis образовывали серые, выпуклые, блестящие, гладкие, полупрозрачные колонии, диаметром 0,1–1мм с правильной, круглой формой. Бактерии не росли на ХБ и Эндо.
Тинкториальные свойства. Бактерии культивировали при 37С в атмосфере с 5% CO2 в течение 24–48 часов с использованием обогащенной питательный среды. При микроскопии бактерии имели форму маленьких плеоморфных грамотрицательных палочек, варьируя от одиночных коккобацилл до длинных, тонких цепочек (рис. 1 и 2). Полученные результаты позволили заключить, что все испытанные культуры соответствовали характеристикам бактерии вида H. parasuis.
Определение биохимических свойств изолятов H. parasuis. Следующим этапом нашей работы была проверка изолятов и штаммов на принадлежность к виду H. parasuis с помощью определения биохимических признаков на анализаторе Vitek-Compact II. Было установлено, что все культуры бактерий не обладали уреазной и оксидазной активностью, тогда как были положительными по каталазе, не образовывали индол и обладали ферментативной активностью в отношении глюкозы, галактозы, маннозы.
Оценка патогенных свойств. Инфекция, вызываемая H. parasuis, редко заканчивается летальным исходом, поэтому LD50 рассчитать не представлялось возможным. Для оценки вирулентных свойств мы использовали бальную систему, аналогично той, которую использовали для оценки патогенности возбудителя микоплазмоза птиц [161] и актинобациллезной плевропневмонии свиней [51].
Балльная система оценки вирулентности штаммов. Патогенные свойства изолятов H. parasuis определяли на серонегативных поросятах 30 суточного возраста, массой 8–10 кг. Поросят разбили на пять групп, по три животных в каждой. Так как H. parasuis передается только при прямом контакте между животными, поросята содержались в отдельных боксах. В качестве контроля использовали два животных, которым вводили внутрибрюшинно 1 мл стерильного физиологического раствора. Животных заражали внутрибрюшинно в дозе 5x108 м.к./животное и наблюдали в течение 7 дней с ежедневным измерением ректальной температуры. Гибель животного принимали за максимальное количество баллов (20 баллов), наличие патологоанатомических изменений в плевральной, перикардиальной и перитониальной полостях – для каждого от 1 до 4 баллов, в сумме до 12 баллов. Cхема учета патологоанатомических изменений включала в себя оценку наличия серозного экссудата в плевральной, перикардиальной и перитониальной полостях, а также пленок и нитей фибрина на поверхности внутренних органов. Наличие серозного экссудата в перикардиальной полости, а также наложения фибрина на поверхности пери– и эпикарда – 4 балла. Наличие серозного экссудата в плевральной полости, а также наложения фибрина на поверхности легочной и костальной плевры – 4 балла. Наличие серозного экссудата в перитониальной полости, а также наложения фибрина на поверхности брюшины, печени, желудка, петель тонкого и толстого отделов кишечника – 4 балла. Тотальное воспаление серозных оболочек плевральной, перикардиальной и перитониальной полостей, сопровождающееся выпотом серозного экссудата и наложениями фибрина, оценивали в 4 балла. Наличие клинических признаков: повышение температуры тела, анорексия, появление кашля и одышки – от 0 до 4 баллов; положительные результаты бактериологического анализа – до 4 баллов.
Согласно балльной системе оценки штаммы H. parasuis относились к одной из четырех групп вирулентности: авирулентные (сумма баллов 5), низковирулентные (5–10), средневирулентные (10–15) и высоковирулентные ( 15). Согласно результатам экспериментального заражения штамм Уральский №-ДЕП показал высокую вирулентность (18,5 баллов из 20), штамм ИН-1 №-ДЕП и изолят SW124 продемонстрировали среднюю вирулентность (14,0 и 15,0 баллов соответственно), а NAG и VN оказались авирулентными (1,7 и 2,3 балла соответственно). Результаты представлены в таблице 3.
Результаты собственных исследований
Гемофилезный полисерозит или болезнь Глессера – инфекционное, септическое заболевание свиней, характеризующееся фибринозным полисерозитом, полиартритом, перикардитом, плевритом и менингитом [68]. Болезнь наносит значительный экономический ущерб в тех странах, где были введены современные системы производства в свиноводческой индустрии, в том числе и в РФ.
Возбудителем этой болезни является H. рarasuis – грамотрицательная бактерия, относящаяся к семейству Pasteurellaceae, имеющая специфические требования к ростовой среде (обогащенные питательные среды с ростовым фактором НАД).
Первым этапом нашей работы была проверка изолятов на принадлежность к виду H. parasuis с помощью определения биохимических признаков на анализаторе Vitek–Compact II. Было установлено, что все культуры бактерий не обладают уреазной и оксидазной активностями, тогда как были положительными по каталазе, не образовывали индол и обладали ферментативной активностью в отношении глюкозы, галактозы, маннозы. Таким образом их биохимические свойства согласуются с ранее публикованными данными [111, 126] и все изоляты можно отнести к виду H. parasuis.
Постановка диагноза проходит в соответствии с «Временными методическими указаниями по лабораторной диагностике гемофилезного полисерозита свиней», утвержденными ГУВ МСХ СССР №116–18 от 17.10.1978 г. на основании анализа эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с обязательным учетом результатов бактериологического исследования материала от павших или вынужденно убитых животных. Выделение чистой культуры H. рarasuis в соответствии с «Методическими рекомендациями по лабораторной диагностике гемофилёзного полисерозита свиней» является трудоемким процессом [9]. Выделение чистой культуры может быть осложнено ростом менее прихотливых, контаминирующих бактерий и предварительной антибиотикотерапией. Метод ПЦР позволяет обнаруживать даже нежизнеспособные организмы, детектируя специфический для микроорганизма участок гена [3, 120]. Поэтому для исследования с помощью метода ПЦР подходит материал внутренних органов животных любой сохранности.
Метод ПЦР–РВ широко применяется для выявления генома многих бактерий [2, 104] и, по сравнению с ПЦР, имеет несколько преимуществ: не требует дополнительного этапа детекции в агарозном геле; является методом с автоматической регистрацией и обработкой полученных результатов; чувствительность детекции флюоресцирующего сигнала выше, чем свечение ДНК, окрашенной бромистым этидием.
При анализе литературных данных в качестве мишени был выбран консервативный ген infB, кодирующий фактор инициации трансляции и праймеры, разработанные Turni и соавт. (2010). Система праймеров и зонда была специфична в отношении близкородственных видов бактерий, но коммерческого набора предложено не было. На основе праймеров мы разработали набор для идентификации бактерий H. рarasuis методом ПЦР-РВ.
Для оптимизации ПЦР–РВ подобрали концентрации компонентов смеси для проведения ПЦР, обеспечивающую максимальную чувствительность реакции: 0,4 мкМ каждого праймера, 0,4 мкМ каждого из dNTP, 6 ммоль MgCl2, 1 ед. полимеразы, 1х Colorless Go Taq Flexi Buffer из набора «Promega» (США) и 5 мкл ДНК в финальной смеси. Чувствительность оптимизированной ПЦР–РВ составила 6,25 м.к./мл, а эффективность реакции равна 97,6%.
Специфичность метода проверили на 13 видах бактерий семейств Pasteurellaceae, Micrococcaceae, Enterobacteriaceae, Staphylococcaceae, Enterobacteriaceae и Bacillaceae. ПЦР–РВ не показала реакции с ДНК Actinobacillus pleuropneumoniae ATCC 33377, Actinobacillus pleuropneumoniae ATCC 27089, Pasteurella multocida ATCC 11039, Pasteurella multocida ATCC 15742, Aviabacterium paragallinarum, Mannheimia haemolytica ATCC 29699, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida ВГНКИ 115, Micrococcus luteus ATCC 9341, Salmonella enterica серовар Dublin ВГНКИ 373, Staphylococcus aureus ВГНКИ 906, Escherichia coli ВГНКИ 320, Bacillus subtilis ATCC 6633.
Кроме этого метод ПЦР–РВ сравнили с бактериологическим методом, исследуя патологический материал внутренних органов экспериментально зараженных животных. Из 28 образцов, 13 проб оказались положительными в ПЦР–РВ и 10 проб положительными при микробиологическом анализе. Метод ПЦР-РВ показал более высокую чувствительность, чем микробиологический анализ.
Благодаря развитию методов генной инженерии удалось выявить гены, предположительно позволяющие отличить вирулентные от авирулентных штаммов [88, 91, 148].
vtaA (virulence associated trimeric autotransporters) – наиболее полно охарактеризованная группа факторов патогенности, образующих бета– складчатый слой во внешней мембране грамотрицательных бактерий. У разных бактерий выполняют различные функции: участвуют в формировании патогенности в качестве посредников при прикреплении к тканям, сопротивляемости сывороточным антителам и фагоцитозу. У H. parasuis в геноме представлено от 10 до 15 копий этого гена. Белки образуют транслокационный домен и при анализе его нуклеотидной последовательности Sonia Pina-Pedrero и соавт. кластеризовали эти гены на 3 группы [80]. Группа 1 является маркером вирулентности [91]. Проведена валидация мультиплексной ПЦР и показано, что потенциально вирулентные штаммы обладают геном vtaA1 [123].
fhuA – псевдоген белка внешней мембраны, рецептора гидроксамата железа. В организме животного большинство железа связано с белками крови: трансферином, гемоглобином, лактоферином, а высоко–аффинные рецепторы способны связывать его. Играют важную роль в выживании бактерий в условиях недостатка железа [36, 77].
hhdA, hhdB – псевдогены оперона гемолизин–экспортной системы. cirA – у E. coli ген cirA кодирует железорегулирующий белок участвующий в энтеробактиновом траспорте. Железорегулирующие белки вовлечены, и часто необходимы для проявления вирулентных свойств у многих бактерий семейства Pasteurellaceae и Neisseriaceae [28, 158].
sclB7 и sclB11 – два псевдогена, кодирующих коллаген–подобные протеины sclB, участвующие в адгезии бактериальных клеток. Эти гены имеют высокую степень гомологии с vtaA генами и образуют несколько кластеров в различных участках генома H. parasuis. Мультикопийность генов sclB [88] может быть результатом горизонтального переноса генов между различными штаммами, также как у генов семейства vtaA [80].
nhaC – последовательность гена обладает гомологией с Na+/H+ антипереносчиками, участвующими в поддержании pH и постоянства концентрации Na+. Это вторичные переносчики в плазматической мембране прокариот. Ген связан с приспособляемостью к внешним условиям, но связь с патогенностью неясна. Вероятно, nhaC участвует в регуляции вирулентности H. parasuis посредством адаптации к внешним условиям.
HAPS_0254 – ген белка периплазматического компонента нитрат/сульфонат/бикарбонат транспортной системы ABC–типа. Ген содержит домен LysR–типа, контролирующий транскрипцию. Гены, контролируемые этим доменом, вовлечены в биосинтез аминокислот, фиксацию углекислого газа, антиотикоустойчивость, утилизацию ароматических соединений, ответ на оксидативный стресс, синтез факторов патогенности и выработку токсинов. phage related – ген, кодирующий NHN эндонуклеазу, участвующую в морфогенезе бактериофага. Фаговые гены (phage_related) способны кодировать токсины и в результате горизонтального переноса генетического материала участвовать в возникновении патогенных микроорганизмов [38].
Разработка тест–системы для идентификации штаммов H. рarasuis на основе ПЦР–РВ
Анализ корреляции между патогенными свойствами бактерий и наличием генов проводили с использованием таблиц сопряженности признаков 2х2. Для генов vtaA и sclB7 невозможно построить таблицу сопряженности, поэтому точные значения рассчитать нельзя. Методы расчета 2 и 2, использующие распределение 2, в таких случаях дает приблизительное значение функции.
Так как мы получили результаты на небольшой, несбалансированной выборке (vtaA и sclB7 гены встречаются в геноме всех изолятов) для расчета значений p мы применяли классический тест 2 и точные тесты Фишера и Бернарда. При анализе литературных данных [88, 91, 148] с помощью коэффициентов корреляции 2, и точного теста Бернарда статистически значимо связанными с вирулентностью являются гены vtaA, fhuA, sclB11, nhaC, sclB7, HAPS_0254, hhdA, hhdB (p 0,05).
В нашей работе для определения корреляции наличия генов и вирулентности исследовали 5 штаммов (ИЛ-1-ДЕП, ИН-1 №-ДЕП, Уральский №-ДЕП, СК-1-ДЕП, КОМИ №- ДЕП) и 7 изолятов (KR, SW124, NAG, Ботово-2, VN, Надеево-2). К сожалению, генов, статистически значимо коррелирующих с вирулентностью не обнаружили (p 0,05): гены одинаково встречаются среди вирулентных и авирулентных представителей H. parasuis, хотя все изоляты были выделены от свиней с клиническими признаками полисерозита. Таким образом очевидно, что вирулентность полевых изолятов H. parasuis является мультифакторной и обусловлена взаимодействием комплекса генетических факторов бактерии и иммуного статуса зараженного животного. Для более подробного изучения данной взаимосвязи необходимы подходы системной биологии [153] с привлечением современных технологий полногеномного секвенирования и протеомного анализа [53, 78, 89]. Диагноз на гемофилезный полисерозит устанавливают при выделении культуры возбудителя из патологического материала и ее идентификации. Поэтому, несмотря на разработку методов ПЦР и ПЦР–РВ [66, 120, 162], выделение чистой культуры H. рarasuis из внутренних органов от животных с клиническими признаками, характерными для болезни Глессера остается «золотым» стандартом и необходимо для проверки антимикробной устойчивости и генотипирования при проведении эпизоотических исследований. Идентификацию возбудителя при выделении чистой культуры проводят в соответствии с «Методические рекомендации по лабораторной диагностике гемофилёзного полисерозита свиней», утвержденными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2005 году. Традиционные методы идентификации гемофильных бактерий включают определение морфологических, культуральных, тинкториальных, биохимических и серологических свойств бактерий и их дифференциацию от других негемолитичных NAD–зависимых бактерий A. indolicus, A. porcinus и A. minor, что требует наличия питательных сред с коротким сроком хранения и реактивов, затраты времени на анализ составляют от нескольких суток и более [1]. Поэтому разработка видоспецифичных инструментальных экспресс–методов идентификации бактерий является актуальной задачей.
В последнее время для идентификации бактерий нашел применение метод MALDI–TOF MS [105]. Масс–спектрометрия – физический метод измерения массы ионов исследуемого вещества и их относительных количеств в смесях, использующий разделение ионов разных масс в вакууме под действием электрических и магнитных полей. Возможность получения специфичных для конкретного вида микроорганизма масс–спектров используют для быстрой идентификации возбудителя. Внедрение этого метода в микробиологическую практику позволяет в быстрые сроки получить ответ об идентифицируемом микроорганизме, сравнивая полученный масс-спектр с базой масс-спектров других микроорганизмов. Данный метод имеет большое количество преимуществ: высокая чувствительность, скорость анализа (несложная пробоподготовка и высокая скорость измерения), низкая стоимость используемых реактивов и материалов, высокая достоверность результатов.
Для разработки методики идентификации возбудителя гемофилезного полисерозита были изучены протеомические свойства H. parasuis и близкородственных видов семейства Pasteurellaceae. После построения моделей с помощью трех методов, доступных в программе Clinprotools были определены дифференцирующие пики в белковых спектрах бактерий видов H. parasuis, P. multocida, A. paragallinarum, A. minor, A. pleuropneumoniae и H. somni. Наилучший результат, основанный на пятнадцати белковых пиках (табл. 7) показала модель на основе алгоритма SNN. Характерным для H. parasuis является пик массой 8407,92 Да (p 0,05). Распознавательная способность модели составила 100%, коэффициент перекрестной проверки 100%.
Затем на основе белковых масс-спектров 5 штаммов H. parasuis ATCC 19417, ИН-1 №-ДЕП, Уральский №-ДЕП, ИЛ-1-ДЕП и СК-1-ДЕП создали профили спектров в базе данных. Дополненную базу данных успешно использовали для идентификации 8 изолятов H. parasuis. Проверка на специфичность с близкородственными бактериями (Actinobacillus pleuropneumoniae ATCC 27088, Actinobacillus pleuropneumoniae ATCC 27089, Actinobacillus pleuropneumoniae ATCC 33377, Histophilus somni изолят Колос, Mannheimia haemolytica ATCC 29696, Pasteurella multocida 115, Pasteurella multocida ATCC 15742, Pasteurella multocida TS–8) показала отсутствие ложноположительных результатов, однако Avibacterium paragallinarum из-за отсутствия профилей спектров бактерий этого вида идентифицировали как Avibacterium endocarditis, а показатель идентификации был 2,0 что достаточно только для идентификации рода бактерий. Также не удалось правильно идентифицировать Actinobacillus minor так же из-за отсутствия профилей спектров бактерий этого вида в базе данных. Наиболее близким по белковому профилю микроорганизмом, из присутствующих в базе данных, является H. parasuis. При этом показатель идентификации ( 1,7) указывает, что микроорганизм не идентифицирован. Тем не менее разработанные методические рекомендации позволяют идентифицировать H. parasuis, выделенные их проб патологического материала, с помощью MALDI–TOF.