Введение к работе
Актуальность работы. В России отмечается устойчивая тенденция роста заболеваемости сифилисом — с 4,3 в 1989 году до 277,3 в 1997 году (заболеваемость на 100 тыс. населения), которая сохраняется на высоком уровне и в настоящее время. В сложившейся ситуации большое значение имеет совершенствование существующих методов лабораторной диагностики, т.к. она играет определяющую роль при выявлении сифилиса. Ни один из стандартных серологических тестов, применяемых в медицинских учреждениях нашей страны, не является идеальным диагностическим методом. Одни из них сложны при постановке и являются дорогостоящими, другие достаточно часто дают лож-ноположительные результаты.
Одним из перспективных методов серологической диагностики является иммуноферментный анализ (ИФА). Учитывая недостатки, связанные с применением в ИФА антигена из непатогенных и «культуральных» трепонем и антигена из патогенной трепонемы — Treponema pallidum, возникает вопрос о разработке новых методов получения антигена. Таким методом является получение рекомбинантных белков Treponema pallidum, синтезируемых в экспрессирующей системе E.coli. Изучение возможности использования рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для выявления антител к возбудителю сифилиса позволит повысить существующий уровень диагностики заболевания.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является получение и сравнительное исследование природных и рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для иммунофер-
ментной диагностики сифилиса; изучение спектра антител к антигенам 15 kDa, 17 kDa, TmpA, 47 kDa Tr.pallidum на разных стадиях заболевания методом ИФА с помощью рекомбинантных белков.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
— культивирование бледной спирохеты Treponema pallidum на
кроликах;
получение природного антигена Treponema pallidum для ИФА;
литературно-теоретический анализ с целью выбора наиболее антигеннозначимых белков, видоспецифичных для Treponema pallidum;
выделение ДНК Treponema pallidum;
получение методом ПЦР генов рекомбинантных белков;
определение структуры генов;
клонирование генов в экспрессирующий вектор;
наработка рекомбинантных белков в E.coli и их выделение;
изучение возможности использования рекомбинантных белков в качестве антигена в ИФА;
- получение экспериментальных партий тест-систем;
исследование сывороток больных сифилисом с помощью опытных партий тест-систем.
анализ результатов использования отдельных рекомбинантных белков и их комбинации при выявлении антител при различных стадиях инфекции.
Научная новизна работы.
Выбрана комбинация белков Treponema pallidum для
использования в качестве антигена в твердофазном ИФА. 4
Сконструированы четыре бактериальных штамма-продуцента, экспрессирующие белки Treponema pallidum: 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa.
С использованием как отдельных, так и суммарных реком-бинантных белков проведено исследование сывороток больных сифилисом на разных стадиях заболевания.
Показано преимущество использования набора рекомбинант-ных белков по сравнению с использованием отдельных рекомби-нантных белков в качестве антигена для лабораторной диагностики заболевания.
Практическая ценность работы.
Получен набор рекомбинантных белков Treponema pallidum.
Показана возможность их использования в качестве антигена в ИФА как в комплексе, так и раздельно.
На основе рекомбинантных белков выпускаются диагностические наборы для определения антител к бледной спирохете (ТОО «Биосервис», г. Москва).
Получен патент на изобретение «Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum» (RU 2103362).
Апробация работы.
Результаты работы докладывались на научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998).
По материалам работы опубликовано 3 печатные работы.
Получен патент на изобретение (RU 2103362).
Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков Treponema pallidum используются для получения антигена при выпуске иммуноферментных тесг-систем.
Структура и объем работы.
Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, главы собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 106 страницах печатного текста, включая 12 рисунков, 7 таблиц, 120 библиографических ссылок.