Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1 Видовой состав нормальной кишечной микрофлоры поросят 16
1.2 Изменение видового состава микрофлоры поросят при дисбактериозах и кишечных инфекциях, их профилактика и лечение 19
1.3 Пробиотические препараты, целесообразность их использования в ветеринарии 25
1.4 Факторы, влияющие на пробиотические свойства микроорганизмов 37
1.5 Заключение по обзору литературы 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 43
2.1 Штаммы микроорганизмов 43
2.2 Питательные среды, растворы, реактивы 45
2.3 Методы исследований 57
ГЛАВА 3. Выделение лактобактерий, исследование их биологических свойств и идентификация 66
3.1 Выделение лактобактерий из кишечного содержимого поросят-отъемышей 66
3.2 Культурально-морофологические свойства изолятов лактобацилл 67
3.3 Биохимические свойства изолятов лактобацилл 69
3.4 Спектр и уровни лекарственной устойчивости изолятов лактобактерий 73
3.5 Адгезивные свойства изолятов лактобактерий 74
3.6 Антагонистическая активность изолятов лактобактерий в отношении разных видов энтеробактерий 76
3.7 Уровень кислотообразования изолятов лактобактерий 79
ГЛАВА 4. Разработка лабораторного образца пробиотического препарата на основе штамма lactobacillus paracasei В-11821 81
4.1 Выбор питательных сред и оптимицация условий культивирования Lactobacillus paracasei В-11821 81
4.2 Отработка условий получения посевных культур L. paracasei В-11821, предназначенных для длительного хранения в замороженном состоянии 83
4.3 Отработка режимов глубинного культивирования L. paracasei B-11821 в биореакторе типа LiFlus GX 84
4.4 Разработка жидкой формы пробиотического препарата на основе L. paracasei В-11821. 87
4.5 Разработка сухой формы пробиотического препарата на основе штамма L. paracasei В-11821 91
4.6 Разработка «фугатной» формы пробиотического препарата на основе штамма L. paracasei В-11821 92
ГЛАВА 5. Оценка эффективности пробиотика на основе штамма l. paracasei в-11821 в научно-производственном опыте на поросятах отъемышах 96
5.1 Влияние биопрепарата на видовой и количественный состав кишечной микрофлоры поросят-отъемышей 97
5.2 Влияние биопрепаратов на живую массу, среднесуточные привесы и сохранность поголовья поросят-отъемышей 104
ГЛАВА 6. Разработка способа повышения адгезивной активности пробиотических штаммов 108
Глава 7. Обсуждение результатов исследований 115
Заключение 129
Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов 131
Список использованной литературы 132
Список работ, опубликованных по теме диссертации 150
- Изменение видового состава микрофлоры поросят при дисбактериозах и кишечных инфекциях, их профилактика и лечение
- Питательные среды, растворы, реактивы
- Антагонистическая активность изолятов лактобактерий в отношении разных видов энтеробактерий
- Отработка режимов глубинного культивирования L. paracasei B-11821 в биореакторе типа LiFlus GX
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Животноводческие хозяйства несут большие убытки из-за высокой смертности молодняка сельскохозяйственных животных. Так, в крупных свиноводческих комплексах России желудочно-кишечные заболевания составляют 54,3-71,4 % от общей заболеваемости свиней. На долю поросят-отъемышей приходится 55-92,2 % общей смертности свиней. Большинство поросят погибают в возрасте до 15 дней (Прудников, 2007). Одним из путей решения этой проблемы является разработка новых экологически безопасных эффективных препаратов, способствующих нормальному развитию животных и получению качественной мясной продукции (Самуйленко, 2016).
Многочисленные исследования показывают, что наиболее эффективным методом лечения и профилактики дисбактериозов и кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных является пробиотикотерапия. Пробиотики не нарушают биоценоза нормальной микрофлоры, характеризуются выраженным клиническим эффектом при лечении острых кишечных инфекций, повышают иммунитет, регулируют и стимулируют пищеварение, значительно ослабляя стрессы, связанные с отъемом от свиноматки, обеспечивают высокие привесы (Тараканов, 2000; Малик, 2003; Гаврилов, 2016)
В настоящее время в ветеринарной практике преимущественно используются пробиотики на основе транзиторных чужеродных микроорганизмов – бактерий рода Bacillus, которые характеризуются высокой ферментативной активностью, устойчивостью к литическим и пищеварительным ферментам, технологичностью в производстве и стабильностью при хранении. За счет синтеза различных бактериоцинов они оказывают выраженный пробиотический эффект. (Грязнева, 2005; Ивановский и др., 2010; Нугуманов и др., 2013; Токарев и др., 2014). Однако, они быстро элиминируются из желудочно-кишечного тракта, так как являются чужеродными для кишечной микрофлоры. Кроме того, родство спорообразующих бактерий с патогенными видами (Похиленко и др., 2007), слабые пробиотические эффекты (Hyronimus et al., 2000; Spinosa et al., 2000), способность бактерий некоторых штаммов синтезировать энтеротоксины (Guinebretiere et al., 2002), случаи возникновения инфекционных патологий (Oggioni et al., 1998) оставляют много вопросов о целесообразности использования пробиотиков на основе спорообразующих микроорганизмов.
Низкая эффективность пробиотических препаратов на основе лакто- и бифидобактерий, энтерококков, кишечной палочки и др., может быть связана с потерей ими пробиотических свойств в результате многочисленных пересевов на искусственных питательных средах.
В отечественной биотехнологии практически не реализованы преимущества биопрепаратов на основе гомопробиотических штаммов лактобацилл, выделенных из организма того же вида животных, в отношении которых предполагается использование пробиотиков на их основе. В связи с этим разработка нового высокоэффективного отечественного пробиотика для свиноводства на основе гомопробиотических штаммов лактобацилл является актуальной задачей.
Степень разработанности темы исследования
По мнению многих авторов, наиболее перспективными для использования в
свиноводстве являются пробиотики на основе лактобацилл. Эти микроорганизмы
безвредны для животных, к ним отсутствует привыкание при длительном
употреблении, они не вызывают побочных эффектов, способствуют
восстановлению моторики кишечника при диарейных явлениях (Бондаренко и др., 2003; Глушанова, 2003; Янковский и др., 2006). Анализ данных научной литературы показывает, что наиболее высокой эффективностью в составе биопрепаратов обладают гомопробиотические штаммы, т.е. представители собственной микрофлоры животных данного вида (Малик, 2003; Yu et al., 2008; Wang et al., 2011, 2013; Liu et al., 2014; Chang et al., 2001, 2015).
В последнее время в ветеринарии все чаще стали применяться препараты на основе продуктов жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов – метаболитные пробиотики, которые стимулируют развитие собственной кишечной микрофлоры и подавляют рост условно патогенных микробов. Существует мнение, что живые микроорганизмы, в том числе и гомопробиотические лактобациллы, могут оказывать отрицательное воздействие на кишечную микрофлору хозяина, и нецелесообразно включать их в состав пробиотиков (Погорельский и др., 2013). Однако сравнительные данные по оценке эффективности метаболитных и бактериальных форм пробиотического препарата в условиях одного эксперимента отсутствуют, и вопрос о преимуществе использования метаболитных пробиотиков над бактериальными остается открытым.
В настоящее время рынок ветеринарных пробиотических препаратов по
большей части представлен дорогостоящими импортными биопрепаратами на
основе чужеродных для кишечной микрофлоры микроорганизмов. Это
обуславливает необходимость выделения и изучения новых гомопробиотических
штаммов лактобацилл, перспективных для разработки отечественных
эффективных биопрепаратов ветеринарного назначения.
Известно, что при длительном поддержании культур пробиотических
микроорганизмов in vitro значительно снижается их способность адгезироваться на
поверхности эпителиоцитов и колонизировать слизистые желудочно-кишечного
тракта, следовательно, снижается эффективность приготовленных на их основе
пробиотических препаратов (Оборин, 2011). Адгезивная активность
пробиотических микроорганизмов является одним из ключевых факторов, обеспечивающих эффективность пробиотического препарата, поэтому существует необходимость разработки способа повышения адгезивных свойств хранившихся коллекционных культур пробиотических микроорганизмов.
Цель исследования – выделение и изучение гомопробиотического штамма лактобацилл, оценка возможности создания на его основе пробиотического препарата для свиноводства.
Задачи исследования
1. Выделить из кишечного содержимого здоровых поросят-отъемышей изоляты лактобацилл, изучить их основные биологические свойства, идентифицировать и депонировать во Всероссийской коллекции промышленных
микроорганизмов ФГУП «ГосНИИГенетика», осуществить выбор штамма, наиболее перспективного для создания пробиотического препарата.
-
На основе выбранного штамма лактобацилл разработать лабораторный образец гомопробиотического препарата, предназначенного для профилактики дисбактериозов и кишечных инфекций у поросят-отъемышей, в трех различных формах: жидкой, сухой и «фугатной».
-
Разработать технологическую схему производства лабораторного образца пробиотического препарата на основе выбранного штамма в жидкой, сухой и «фугатной» формах.
-
Оценить эффективность использования различных форм разработанного гомопробиотического препарата на основе штамма L. paracasei В-11821 в научно-производственном опыте, их влияние на процессы нормализации видового и количественного состава кишечной микрофлоры, на прирост живой массы, на среднесуточные привесы и на повышение сохранности поголовья поросят-отъемышей.
-
Разработать способ повышения адгезивной активности коллекционных культур пробиотических штаммов лактобацилл.
Научная новизна работы состоит в следующем:
1. Из кишечного содержимого поросят-отъемышей выделен новый
гомопробиотический штамм L. paracasei В-11821, обладающий антагонистической
активностью в отношении использованных культур 9 видов энтеропатогенных
микроорганизмов, высокой адгезивной активностью по отношению к эритроцитам
свиньи ((50,8±3,4) %) и человека ((56,5±7,6) %), выраженной кислотообразующей
способностью ((340,8±6,3) градусов Тернера), высокими ростовыми качествами
(содержание живых микробов (6,1+0,6)109 КОЕ/см3 при глубинном
культивировании в течение 24 ч при температуре (37±1)С на среде MRS на
капустном отваре).
-
Впервые в научно-производственном опыте проведено комплексное сравнение эффективности жидкой, сухой и «фугатной» форм лабораторного образца пробиотического препарата; показано, что все формы пробиотического препарата на 30 сутки эксперимента нормализуют состояние кишечной микрофлоры; показано достоверное (Р=0,95) преимущество жидкой и «фугатной» форм перед сухой по способности к 60 суткам наблюдения поднимать среднесуточные привесы поросят-отъемышей, повышать живую массу и увеличивать сохранность поголовья.
-
Впервые разработан способ повышения адгезивных свойств культур лактобацилл, который заключается в выделении субпопуляции высокоадгезивных бактерий в результате адсорбции на эритроцитах с последующим отделением фракции связавшихся клеток от свободных бактерий методом фильтрования и выращиванием адгезированных бактерий на питательной среде.
Выделенный штамм Lactobacillus paracasei депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИГенетика» под номером ВКПМ В-11821. Поданы две заявки на изобретение: «Штамм бактерий Lactobacillus paracasei, используемый для приготовления пробиотического
препарата» (рег. № заявки 2015147972); «Способ повышения адгезивной
активности лактобацилл, используемых в производстве пробиотиков и кисломолочных продуктов» (рег. № заявки 2016145185).
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты подтверждают перспективность использования гомопробиотических микроорганизмов в создании средств коррекции микрофлоры у поросят-отъемышей; вносят вклад в расширение представлений о взаимодействии с макроорганизмом лактобацилл вида Lactobacillus paracasei и продуктов их метаболизма. Выявленные закономерности их влияния на качественный и количественный состав микрофлоры поросят-отъемышей, на динамику их роста и развития в период адаптации к новому рациону способствуют совершенствованию методологии создания различных форм пробиотических препаратов.
В результате работы выделен новый гомопробиотический штамм L. paracasei В-11821. На его основе разработан лабораторный образец пробиотического препарата в трех формах: жидкой, сухой и «фугатной» для профилактики дисбактериозов и кишечных инфекций молодняка свиней. В научно-производственном опыте на поросятах-отъемышах проведено комплексное сравнение по эффективности жидкой, сухой и «фугатной» форм пробиотического препарата. Все три формы разработанного препарата способны обеспечивать нормализацию микрофлоры кишечника поросят в период отъема от свиноматки. Жидкая и «фугатная» формы биопрепарата, в отличие от сухой, обеспечивают достоверное (Р=0,95) повышение привесов, живой массы и сохранности поголовья поросят-отъемышей.
По материалам диссертационного исследования разработана «Инструкция по изготовлению и контролю лабораторного образца ветеринарного пробиотического препарата на основе штамма L. paracasei», а также составлен «Акт производственных испытаний экспериментального образца пробиотического препарата на основе штамма L. paracasei».
Материалы диссертационного исследования включены в учебный процесс
кафедры микробиологии ВятГУ и используются при чтении лекций и проведении
лабораторных и практических занятий со студентами по дисциплинам
«Микробиология», «Основы биотехнологии», «Пробиотические
микроорганизмы».
Методология и методы исследования
Методология исследований соответствовала поставленным задачам.
Предметами исследования явились выделение и изучение пробиотических
штаммов лактобацилл, разработка технологической схемы приготовления
пробиотического препарата, оценка влияния различных форм пробиотического
препарата на кишечную микрофлору поросят-отъемышей и их продуктивность,
методика поддержания высокого уровня адгезивности культур лактобацилл. При
организации и проведении экспериментальных исследований применялись
информационно-аналитические, микробиологические, биотехнологические,
генетические, биохимические и статистические методы.
Материалы и методы исследования. В работе использованы следующие
штаммы: L. paracasei В-11821, L. reuteri 1, L. salivarius 1, L. salivarius 2,
L. salivarius 3, выделенные из кишечного содержимого здоровых поросят;
L. amylovorus БТ-24/88, полученный из ВКПМ ГосНИИГенетики; L. plantarum 8Р-
А3, выделенный из пробиотического препарата «Лактобактерин»;
L. acidophilus LA-5, выделенный из пробиотического препарата «Нормобакт»;
штамм L. rhamnosus, выделенный из кисломолочного продукта «Имунеле»; штамм
E. coli C600 из коллекции микробных культур кафедры микробиологии ВятГУ;
штаммы E. cloacae, C. freundii, K. oxytoca – из коллекции микробных культур
НИИИ ВМ ВМА им. С. М. Кирова, г. Санкт-Петербург, штаммы P. aeruginosa,
P. vulgaris, P. mirabilis, S. pullorum, S. odorifera, выделенные автором из кишечного
содержимого больных поросят и идентифицированные.
Для определения антагонистических свойств лактобактерий использовали двухслойную методику по Фредерику (Fredericq, 1948), для определения уровня адгезии – фотоколориметрический метод Оборина (2009) и метод Брилис (1986). Уровень кислотообразования оценивали в соответствии с методикой Тернера (МУК 4.2.2602-10). Спектр и уровни антибиотикорезистентности выделенных штаммов лактобацилл определяли согласно МУ 4.2.1890-04.
Отработку режимов глубинного культивирования лактобацилл проводили на биореакторе LiFlus GX (Bio-TronInc, Республика Корея) емкостью 5,0 л. Лиофильное высушивание культуры проводили на установке FreeZone 12 (Labconco, США). Осаждение лактобацилл осуществляли на охлаждаемой центрифуге Avanti J-E Centrifuge (Beckman Coulter, США).
Для оценки видового и количественного состава кишечной микрофлоры поросят-отъемышей использовали различные питательные среды: Эндо, MRS, обогащенную питательную среду для контроля стерильности с налидиксовой кислотой, желточно-солевой агар, кровяной агар, агар Симмонса и Калины. Для оценки динамики изменения видового и количественного состава нормальной микрофлоры высевы из кишечного содержимого производили до, во время и после выпаивания пробиотика.
При выполнении микроскопических исследований окраску мазков осуществляли по методам Грама, Бурри-Прейса (для обнаружения капсул), Ожешко (для обнаружения спор); для оценки подвижности микроорганизмов готовили препараты типа «раздавленная капля» (Золотарев, 2012).
Определение видовой принадлежности лактобацилл на основании изучения последовательностей гена 16S рРНК осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Статистическую обработку данных проводили согласно руководству И. П. Ашмарина и А. А. Воробьева (1962) при помощи пакета программ вариационной статистики MS Exсel 2010. Результаты исследований представлены в виде средних арифметических значений с доверительным интервалом при уровне вероятности Р=0,95.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Гомопробиотический штамм L. paracasei В-11821, выделенный из
кишечного содержимого поросят-отъемышей, обладает антагонистической
активностью в отношении использованных культур 9 видов энтеропатогенных
бактерий, высокой адгезивной активностью – (56,5±7,6) % и (50,8±3,4) % – в
отношении эритроцитов человека и свиньи соответственно, выраженной
кислотообразующей способностью – (340,8±6,3) градусов Тернера.
2. Изготовленные на основе штамма L. paracasei В-11821 три формы
лабораторного образца гомопробиотического препарата: жидкая, сухая и
«фугатная» при курсовом выпаивании поросятам-отъемышам на 30 сутки
эксперимента обеспечивают восстановление видового и количественного состава
кишечной нормофлоры поросят-отъемышей; жидкая и «фугатная» формы
пробиотического препарата к 60 суткам наблюдения обеспечивают достоверное
(Р=0,95) увеличение среднесуточных привесов, прирост живой массы и повышение
сохранности поголовья поросят-отъемышей по сравнению с животными
контрольной группы.
3. Способ повышения адгезивной активности культур лактобацилл,
основанный на выделении из культур субпопуляции бактерий с высокими
адгезивными свойствами, позволяет на 15-56 % увеличить адгезивные свойства
культур различных штаммов лактобацилл, длительно поддерживаемых на
искусственных питательных средах.
Степень достоверности результатов работы. Достоверность результатов
работы подтверждается использованием стандартных методик,
сертифицированного и поверенного оборудования, методов статистической обработки экспериментальных данных, воспроизводимостью результатов экспериментов.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на следующих международных и всероссийских конференциях: Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс», г. Новосибирск, 2012, 2013; Всероссийская ежегодная научно-техническая конференция «Общество, наука, инновации», г. Киров, 2011, 2013, 2014, 2015; IV Международная конференция «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья», г. Белгород, 2012; XVII Международная экологическая студенческая конференция «Экология России и запредельных территорий», г. Новосибирск, 2012; областной конкурс «Молодые рационализаторы и изобретатели», г. Киров, 2012; Международная научно-практическая конференция молодых ученых, аспирантов и соискателей «Знания молодых: наука, практика и инновации», г. Киров, 2013; XXIV Международная научно-практическая конференция «Наука и современность – 2013», г. Новосибирск, 2013; Молодежный форум ПФО I-Волга 2014; смена «Инновации и техническое творчество», г. Самара, 2014.
По результатам работы автор удостоена диплома за победу в региональном конкурсе «Молодые рационализаторы и изобретатели», 2012; дипломом за победу в конкурсе «У.М.Н.И.К.» – 2015. Работа проводилась в рамках Программы
стратегического развития ВятГУ на 2013-2014 гг., п. 2.1.1-7 «Разработка пробиотического препарата ветеринарного назначения для профилактики и лечения дисбактериоза у поросят». Частично исследования выполнялись в рамках договора с ООО «Биопром», г. Киров, № 638/1 от 1.08.2014 г. на проведение НИР по теме «Подготовка и проведение испытаний эффективности пробиотического препарата на поросятах». Научно-производственный опыт по оценке эффективности биопрепарата проводился на базе свинокомплекса ЗАО «Заречье», г. Киров.
Личный вклад соискателя. Автор лично участвовала в планировании, проведении всего комплекса теоретических и экспериментальных исследований и анализе полученных результатов. Отработка условий получения культур L. paracasei методом глубинного выращивания в биореакторе, получения лиофильно высушенных культур проведены совместно с заведующим лабораторией кафедры микробиологии ВятГУ Р.М. Бузиковым.
Исследование последовательностей генов 16S рРНК лактобацилл с помощью ПЦР выполнено специалистами ВКПМ ГосНИИГенетики (г. Москва).
Изучение влияния биопрепарата на основе гомопробиотического штамма L. paracasei в жидкой, сухой и «фугатной» формах на развитие поросят-отъемышей в условиях промышленного свиноводства проводилось с участием заведующей племенной фермой ЗАО «Заречье» А.В. Жаворонковой.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 статьи, входящие в перечень ВАК.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты научных исследований соответствуют пунктам 1, 3 и 11 паспорта специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 164 стр., включает следующие основные разделы: введение, основная часть, заключение, список сокращений и условных обозначений, список литературы, в который входит 161 источник (в том числе 45 – на иностранном языке), приложения. Работа содержит 27 таблиц, 14 рисунков и 4 приложения.
Изменение видового состава микрофлоры поросят при дисбактериозах и кишечных инфекциях, их профилактика и лечение
Как видно из данных таблицы 1.1, в современной ветеринарной практике для лечения и профилактики кишечных инфекций у сельскохозяйственных животных часто используются вакцины, антибиотические и пробиотические препараты. Но, несмотря на это, проблема высокой смертности молодняка животных по причине кишечных инфекций остается актуальной.
Анализ данных ветеринарной отчетности по заболеваемости свиней в крупных свиноводческих комплексах Российской Федерации показывает, что большой ущерб свиноводству наносят факторные инфекционные болезни, т.е. болезни, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы, среди которых эшерихиоз (колибактериоз), сальмонеллез, стрептококкоз и др. Желудочно-кишечные заболевания составляют 54,3-71,4% от общей заболеваемости свиней. На долю поросят-отъемышей приходится 55-92,2% из этого количества, а падеж – 9,8-87,3% [70].
В большинстве случаев причиной многих кишечных инфекций свиней являются не отдельные бактерии, а их ассоциации. При этом связи между возбудителями энтеритов и условно патогенными микроорганизмами носят синергидный характер, осложняют течение болезни и могут быть причиной неэффективности этиотропного лечения [80, 76].
В работе [76] описан видовой состав микрофлоры ЖКТ поросят при отечной болезни. Возбудителем этой инфекции, как правило, являются гемолитические штаммы кишечной палочки различных серотипов (О8, О26, О101, О115, О20, О139, О78, О140, О137, О111). При отечной болезни в пробах патологического материала также выявляется случайная микрофлора: Staphilococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus suis, Pasteurella haemolitica, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, которая сама не способна вызвать инфекционный процесс, но может существенно осложнить течение основного заболевания. Результаты исследований, представленные в работе [83], привели авторов к аналогичному заключению: инфекционные заболевания свиней носят ассоциативный характер, когда количество разных патогенов, выделяемых от одного больного животного, доходит до 5-6 видов. По утверждению некоторых исследователей вакцинация не способна защитить молодняк животных от инфекционных болезней, вызываемых условно патогенными микроорганизмами. А в том случае, когда после вакцинации формируется активный иммунитет, выраженных проявлений инфекции может не наблюдаться, но животные длительное время могут оставаться бактерионосителями [13]. В работе [70] отмечено, что в последнее время, несмотря на массовые вакцинации против сальмонеллеза, колибактериоза и др., заболеваемость и падеж поросят не только не сократились, но и значительно увеличились. Известно также, что вакцинация новорожденных поросят, бессмысленна и даже вредна, так как несформировавшаяся иммунная система не способна адекватно и в полной мере отвечать выработкой как клеточного, так и гуморального иммунитета [86]. Кроме того, постоянные мутационные процессы, происходящие с геномом бактерий, приводят к появлению новых патогенных штаммов, следовательно, обеспечить профилактику кишечных инфекционных заболеваний с помощью только лишь вакцинации существующими препаратами становиться все сложнее [73].
Применение антибиотиков для терапии и профилактики кишечных инфекций часто вызывает дисбиотические состояния, которые также требуют соответствующего лечения. Кроме того, при массовом неконтролируемом использовании антибиотиков возникают лекарственноустойчивые штаммы микроорганизмов – возбудителей кишечных инфекций, представляющих еще большую опасность как для молодняка сельскохозяйственных животных, так и для обслуживающего персонала. Давно отмечено, что некоторые непатогенные бактерии приобрели способность синтезировать беталактамазы – ферменты, разрушающие антибиотики пенициллиновой группы. Возникновение устойчивых патогенных и условно-патогенных штаммов к антибиотическим препаратам также можно объяснить использованием разных антибиотиков для консервирования кормов [30, 31, 121, 144, 148]. В работе американских ученых [144] представлены результаты исследований по изучению резистентности выделенных от больных поросят патогенных штаммов кишечной палочки к антибиотикам, применяемым на свиноводческих фермах: апрамицину, кабрадоксу, гентамицину, неомицину и окситетрациклину. Исследования показали, что изоляты патогенных E.coli обладали резистентностью к трем из пяти применяемым препаратам: апрамицину, кабрадоксу и окситетрациклину. При антибиотикотерапии колибактериозов поросят в нашей стране чаще всего применяют ампициллин, цефалоспорины, гентамицин, тетрациклины, левомицитины, стрептомицин, неомицин, эритромицин, линкоспектины и фторхинолоны [87, 92].
Таким образом, этиологическим фактором кишечных инфекций молодняка свиней являются чаще всего патогены, ассоциированные с секундарной условно-патогенной микрофлорой, что значительно осложняет этиотропную терапию. Антибиотические препараты могут оказаться неэффективными вследствие приобретенной к ним резистентности возбудителей кишечных инфекций. В связи с этим, в последнее время в животноводстве наблюдается устойчивая тенденция к снижению общего объема применяемых антибиотиков. Для профилактики и лечения кишечных инфекций и дисбактериозов в ветеринарии чаще стали использоваться пробиотические препараты, особенно в профилактических целях и после курсов антибиотикотерапии.
Питательные среды, растворы, реактивы
Методика выделения микроорганизмов из содержимого толстого кишечника поросят-отъемышей
В стерильные пробирки разливали физиологический раствор хлорида натрия по 9 см3. Далее в эти пробирки с помощью стерильной деревянной палочки вносили 1 грамм каловых масс и тщательно суспендировали. Для осаждения крупных частиц суспензию отстаивали в течение 5 мин. После чего, готовили десятикратные разведения и высевали по 0,1 см3 суспензии на дифференциально-диагностические питательные среды.
Количество бактерий группы кишечной палочки определяли с помощью высева проб кишечного содержимого из 3-го, 5-го и 7-го разведений на чашки с дифференциально-диагностической питательной средой Эндо. Затем посевы термостатировали в аэробных условиях при температуре (37±1)С в течение 24 часов. После этого подсчитывали колонии лактозопозитивной кишечной палочки, которые на среде Эндо формировали темно-малиновые колонии с металлическим блеском, и лактозонегативные энтеробактерии, которые формировали светло-розовые или белые колонии [36]. Общее количество лактобактерий в кишечном содержимом поросят отъемышей определяли посредством высева проб из 5-го, 7-го и 9-го разведений на плотную питательную среду MRS-4. Посевы термостартировали в течение 48 часов в микроаэрофильных условиях при температуре (37±1)С и подсчитывали общее количество выросших колоний [47]. Количество бифидобактерий определяли путем высева проб кишечного содержимого из 7-го, 8-го, 9-го, 10-го, 11-го и 12-го разведений на жидкую обогащенную питательную среду для контроля стерильности (СКС) с налидиксовой кислотой в концентрации 30 мкг/ см3. Посевы термостартировали в течение 2-5 суток в анаэростате при температуре (37±1)С [36]. Наличие роста бифидобактерий определяли по рыхлому хлопьевидному осадку на дне пробирки и с помощью окраски микроскопических мазков по методу Грама при выявлении типичной для бифидобактерий формы: грамположительных плиморфных палочек - прямых, изогнутых, разветвленных, раздвоенных Y- или V-формы, булавовидных, лопатовидных.
Общее количество стафилококков определяли посредством высева проб кишечного содержимого на желточно-солевой агар из 1-го, 3-го и 5-го разведений. Посевы термостартировали в течение 48 часов при температуре (37±1)С. Колонии стафилококков, которые проявляли лецитиназную активность, т.е. отличались наличием вокруг колонии зоны помутнения среды, относили к патогенным. Остальные колонии учитывали как непатогенные формы стафилококков [47, 71].
Для выявления гемолитических форм бактерий использовали 5% кровяной агар. Высевы проб кишечного содержимого производили из 7-го и 9-го разведений. Посевы термостатировали в течение 48 часов при температуре (37±1)С, затем подсчитывали колонии, вокруг которых в проходящем свете наблюдалась зона гемолиза.
Для определения общего количества энтерококков использовали среду Калины. Пробы кишечного содержимого поросят-отъемышей высевали из 3-го и 5 59 го разведений, затем термостатировали в течение 48 часов при температуре (37±1)С и подсчитывали общее количество колоний [47, 71].
Для выявления цитратредуцирующих энтеробактерий производили высевы на цитратный питательный агар (среду Симмонса) из 3-го и 5-го разведений проб кишечного содержимого. Посевы термостатировали в течение 48 часов при температуре (37±1)С. О наличии роста сульфатредуцирующих бактерий свидетельствовало появление синего окрашивания питательной среды [47, 71].
Методика приготовления микробиологических препаратов для микроскопии
На чистое обезжиренное предметное стекло наносили каплю физиологического раствора хлорида натрия. Прокаленной над пламенем спиртовки бактериологической петлей из пробирки с суспензией микроорганизмов или с поверхности питательного агара в чашке Петри брали небольшое количество микробной культуры и вносили ее в каплю физиологического раствора хлорида натрия на предметном стекле. Каплю с помощью бактериологической петли тщательно распределяли равномерным тонким слоем по поверхности стекла на площади около 4 см2.
Мазок подсушивали на воздухе. Фиксацию проводили трехкратным медленным проведением предметного стекла с мазком через верхнюю часть пламени спиртовки. При этом поверхность стекла, на которую была нанесена культура, обращена кверху [93].
Методика окраски мазков по методу Грама
На приготовленные на предметных стеклах мазки наносили краситель карболовый генциановый фиолетовый на 1-2 мин. Затем краситель сливали и, не промывая препарат водой, заливали мазки на 1-2 минуты раствором Люголя до почернения. Раствор Люголя сливали и промывали препарат 96% этиловым спиртом до обесцвечивания. Затем препарат промывали дистиллированной водой и дополнительно окрашивали в течение 1-2 минут водным раствором фуксина. Краситель сливали, препарат промывали водой. Мазок высушивали и микроскопировали с иммерсионным маслом (объектив х 90) [35, 93]. Методика окраски микроорганизмов по Бурри-Прейсу (для обнаружения капсул)
На поверхность хорошо обезжиренного стекла наносили средней величины каплю туши и каплю бактериальной суспензии. Тщательно перемешивали и распределяли вдоль предметного стекла движением шлифованного края другого предметного стекла. Высушивали мазок на воздухе, фиксировали над пламенем спиртовки и микроскопировали с иммерсионным маслом. Капсулы выявлялись в виде прозрачных зон вокруг бактерий, интенсивно преломляющих свет на темном фоне препарата [35].
Методика окраски препарата по Ожешко (для обнаружения спор)
На фиксированный мазок наносили метиленовую синьку Леффлера и доводили его до кипения, периодически внося предметное стекло в пламя горелки в течение 15-30 секунд. После остывания мазок промывали водой и докрашивали нейтральным красным в течении 30 сек. Мазок повторно промывали и высушивали. Споры окрашивались в голубой или синий цвета, вегетативные клетки окрашивались в розовый цвет [35].
Антагонистическая активность изолятов лактобактерий в отношении разных видов энтеробактерий
Для оценки способности лактобактерий утилизировать цитрат натрия определяли характер роста на питательной среде Дейвиса. Посевы инкубировали при температуре (37±1)С в течение 4 суток. По окончании выращивания визуально оценивали характер роста культур лактобактерий на поверхности питательной среды. Все исследуемые штаммы на поверхности питательной среды Дейвиса формировали нежный белесоватый газон.
Проводили анализ способности штаммов лактобацилл образовывать аммиак из аргинина. Для этого двухсуточными бульонными микробными культурами инокулировали аргининовый бульон, а также питательный бульон того же состава без аргинина. Посевы инкубировали при температуре (37±1)С в течение 48 часов. Выявление аммиака в культуральной жидкости осуществляли в спот-тесте с реактивом Несслера. Появление желтой или оранжевой окраски культуральной жидкости при нагревании свидетельствовало о наличии в исследуемом субстрате аммиака. При отсутствии аммиака в культуральной жидкости ее цвет при нагревании с реактивом Несслера не менялся.
После инкубации культур исследуемых штаммов в аргининовом бульоне и проведения анализа с реактивом Несслера положительная реакция наблюдалась только в пробах с культуральной жидкостью изолята №48. Изоляты №№ 1, 40, 41, 44 не образовывали аммиак из аргинина.
Известно, что способность лактобактерий расти при разных температурах инкубирования является важным видовым признаком и используется при идентификации микроорганизмов. Исследования способности культур изолятов расти в микроаэрофильных условиях при разных температурах культивирования проводили в газовой смеси с содержанием СO2 – (5±1)%. Для этого исследуемые культуры лактобацилл высевали на чашки с плотной питательной средой MRS-4. Чашки инкубировали при температурах (15±1)С, (37±1)С и (45±1)С.
Культивирование лактобацилл в микроаэрофильных условиях при температуре (37±1)С показало, что бактерии всех исследуемых штаммов формируют в течение 24 часов видимые невооруженным глазом типичные по морфологии колонии. Результаты культивирования при температурах (15±1)С и (45±1)С представлены в таблице 3.2. Таблица 3.2 - Наличие роста лактобацилл на плотной питательной среде MRS-4 при температурах (15±1) и (45±1)С
Номер изолята Температуракультивирования,(Т±1)С Способность бактерий формировать колонии через … ч культивирования 48 72 96 120 144
Как видно из представленных в таблице 3.2 данных, бактерии изолятов №№ 40, 41, 44, 48 не способны расти при температуре (15±1)С. При температуре инкубирования (45±1)С через 24 часа бактерии этих изолятов формировали видимые невооруженным глазом колонии. Бактерии контрольного штамма L. plantarum 8P-A3 и изолята №1 при температуре инкубирования (15±1)С формировали мелкие колонии только через двое суток инкубирования. При температуре (45±1)С бактерии изолята №1 образовывали колонии на вторые сутки культивирования, а бактерии контрольного штамма только на четвертые.
Культуры исследуемых изолятов лактобактерий были переданы в ГосНИИГенетики для проведения видовой идентификации с помощью молекулярно-генетических методов. На основании результатов изучения культурально-морфологических, биохимических свойств и результатов анализа генов, кодирующих 16S рРНК была, определена видовая принадлежность полученных изолятов микроорганизмов: № 1 был отнесен к виду L. paracasei, штамм 1; № 40 – к виду L. salivarius, штамм 1; № 41 – к виду L. salivarius, штамм 2; № 44 – к виду L. salivarius, штамм 3; № 48 – к виду L. reuteri, штамм 1. Результаты идентификации лактобацилл с помощью молекулярно-генетических методов представлены в приложении А.
Исследования по выявлению спектра и уровней устойчивости штаммов лактобацилл проводились в отношении доксициклина, гентамицина, рифампицина, ампициллина, канамицина, стрептомицина, тетрациклина и левомицетина. Чувствительность бактерий к антибиотикам изучали методом высева на плотные питательные среды, содержащие лекарственные препараты в разных концентрациях [59]. Результаты исследований представлены в таблице 3.3.
Оценку адгезивных свойств лактобактерий осуществляли двумя методами: фотоколориметрическим экспресс-методом В.А.Оборина [65, 66] и методом В.И. Брилиса [15]. Субстратом для адгезии лактобацилл служили эритроциты человека 0(I)Rh+ группы крови и эритроциты свиньи. Эритроциты признаются универсальной моделью для изучения адгезивных свойств различных микроорганизмов [66]. На поверхности эритроцитов находится имкоферин, схожий по химическому строению с гликокаликсом эпителиальных клеток, на которых расположены рецепторы для адгезинов микробов.
В качестве контрольных использовались культуры штаммов L. plantarum 8P-A3, выделенный из коммерческого пробиотического преапарата «Лактобактерин», и Lactobacillus amylovorus БТ-24/88, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетики.
Отработка режимов глубинного культивирования L. paracasei B-11821 в биореакторе типа LiFlus GX
При длительном поддержании культур пробиотических микроорганизмов на искусственных питательных средах в условиях отсутствия естественного отбора, который происходит в желудочно-кишечном тракте млекопитающих, способность пробиотических микроорганизмов к адгезии на поверхности эукариотических клеток значительно снижается, и они утрачивают способность колонизировать слизистую кишечника и длительно персистировать в просвете кишечника. В связи с этим, для сохранения штаммов пробиотических микроорганизмов в активном состоянии был разработан способ, обеспечивающий поддержание высоких адгезивных свойств у культур пробиотических микроорганизмов. За основу был взят фотоколориметрический экспресс-метод определения адгезивных свойств бактерий В.А.Оборина [65, 66].
Способ заключается в отборе лактобацилл с повышенными адгезивными свойствами из общей популяции микроорганизмов. С этой целью культуры лактобацилл выращивали на питательной среде MRS-4, смывали и трижды отмывали физиологическим раствором хлорида натрия ((7,3±0,1) ед.рН). Оптическую концентрацию суспензии лактобацилл определяли на колориметре фотоэлектрическом КФК-2 (Россия) при длине волны 540 нм, ширине кюветы 5 мм и доводили до концентрации 1,0 OD. 2,5 см3 суспензии лактобактерий смешивали с 1 см3 суспензии эритроцитов в физиологическом растворе хлорида натрия ((7,3±0,1) ед.рН) с концентрацией 1012 кл/дм3. Смеси инкубировали в шейкер-инкубаторе Excella E25 {New Brunswick Scientific, США) в течение 30 минут при температуре (37±1)С при 100 об/мин.
Для осаждения эритроцитов с адгезированными на них бактериями суспензии центрифугировали на настольной центрифуге ELMI-PC-6 (Латвия) при 1000 об/мин в течение 5 минут. Лактобациллы, на поверхности которых имеются адгезины, адсорбировались на эритроцитах и оседали на дно центрифужной пробирки, а бактерии, которые утратили способность адгезироваться на поверхности эукариотических клеток, оставались в надосадочной жидкости. В результате центрифугирования суспензии разделялись на две фракции: осадок, состоящий из эритроцитов с прикрепленными к ним бактериальными клетками и надосадочную жидкость, содержащую неприкрепившиеся к эритроцитам бактерии. Надосадочную жидкость декантировали, а осадок ресуспендировали в физиологическом растворе хлорида натрия. Полученную суспензию подвергали фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 1,2 мкм, который задерживал только лактобациллы, прикрепившиеся к эритроцитам, а неприкрепившиеся клетки лактобацилл свободно проходили сквозь него. Адгезированные на эритроцитах лактобациллы, которые оставались на поверхности фильтра, пересевали на плотную питательную среду MRS-4. Посевы инкубировали при температуре (37±1)С в течение двух суток. У полученной культуры лактобацилл определяли адгезивные свойства по описанной в разделе 2.3 методике. Основные этапы методики изображены на схеме рисунка 6.1 по Способ повышения адгезивных свойств лактобактерий одготовка "суспензии эритроцитов в физиологическом растворе NaCl, (10 кл/л) Подготовка суспензии лактобактерий в физиологическом растворе NaCl, (1 OD) В исследованиях по повышению адгезивной активности пробиотических штаммов использовали четыре вида лактобацилл: выделенный нами из кишечного содержимого молочных поросят штамм L. paracasei В-11821, штамм L. plantarum 8Р-А3, выделенный из коммерческого биопрепарата «Лактобактерин», штамм L. acidophilus LA-5, выделенный из коммерческого пробиотика «Нормобакт» и штамм L .rhamnosus, выделенный из кисломолочного продукта «Имунеле». Для повышения адгезии штамма L. paracasei В-11821 использовали трижды отмытые в физиологическом растворе хлорида натрия эритроциты крови свиньи, для всех остальных штаммов – эритроциты крови человека, подготовленные аналогичным образом.
С целью имитации процесса длительного поддержания культур на искусственных питательных средах и снижения уровня их адгезивных свойств, лактобациллы с высокой адгезивной активностью подвергались 15 пересевам в жидкой питательной среде MRS-1. Полученные после пересевов культуры с низкой адгезивной активностью использовали в экспериментах по отработке методики повышения адгезивных свойств лактобактерий, длительно хранящихся на искусственных питательных средах. Результаты исследований представлены в таблице 6.1.
Как видно из данных таблицы 6.1, начальный уровень адгезии L. paracasei В-11821 и L. plantarum 8P-A3 – высокий и составил более 50%. Для отработки методики повышения адгезивных свойств лактобактерий данные культуры подвергались искусственному состариванию путем 15-ти последовательных пересевов на жидкой питательной среде MRS-1. После пересевов уровень адгезии штамма L. paracasei В-11821 понизился в два раза (до (25,1±10,0)%), а уровень адгезии L. plantarum 8P-A3 – более чем в три раза (до (17,6±8,3)%). Начальный уровень адгезии штамма L. acidophilus LA-5 был низкий, а штамма L. rhamnosus – нулевой, поэтому в искусственном «состаривании» данных культур не было необходимости. Полученные после пересевов культуры и штаммы с низкой адгезивной активностью использовали в экспериментах по отработке методики повышения адгезивных свойств лактобактерий, описанной выше После однократного обогащения популяций всех исследуемых культур высокоадгезивными бактериями уровень адгезии L. paracasei В-11821 повысился на 15%, L. plantarum 8P-A3 – на 56%, L. acidophilus LA-5 – на 30%, L. rhamnosus – на 18% (рисунок 6.2).