Введение к работе
Актуальность темы. Современное животноводство немыслимо без повышения генетического потенциала сельскохозяйственных животных. Однако при использовании для этой цели методов классической селекции требуется не одно десятилетие. В связи с этим возникла необходимость в разработке технологий, позволяющих более быстрыми темпами создавать новые генотипы животных с желаемыми признаками и таким образом ускорять селекционный процесс.
Исследования, проведенные в последние десять лет в области эмбриоинженерии и генетической инженерии, свидетельствуют о принципиальных возможностях изменения генотипа животных как по одному признаку, так и по комплексу признаков, путем прямого переноса дополнительных генов в их геном.
Представления о включении новых генов в геном животных кажутся простыми и привлекательными с точки зрения скорости и точности, с которой могут быть произведены изменения фенотипа. Предложен совершенно новый принцип и механизм введения в популяцию признаков, которые в ней полностью отсутствовали и не могли возникнуть в ходе эволюции. Впервые успешный перенос гена был проведен на мышах в 1980 году (Gordon J.W. ее al. 1980). Успехи достигнутые в получении трансгенных мышей побудили исследователей к подобным экспериментам на сельскохозяйственных животных. В 1985 году впервые были получены трансгенные свиньи и кролики (Hammer R.E. et al. 1985; Brem G. et al. 1985). Однако, несмотря на полученные первые результаты, эффективность технологии получения трансгенных животных остается пока еще невысокой, ввиду низкой частоты интеграции чужеродных генов в геном хозяина и несовершенства основных этапов технологии. К настоящему времени принципиально разработан только первый вариант технологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных, для осуществления которого требуется большое
число эмбрионов на стадии зиготы, в которые вводят чужеродные гены, и используется большое число животных - доноров и реципиентов, что в значительной степени усложняет и удорожает технологию трансгенеза.
В настоящее время получение трансгенных животных осуществляется, главным образом, путем микроинъекции генноинженерных конструкций в эмбрионы ранних стадий развития. Основным условием, необходимым для передачи трансгена от первичного трансгенного животного его потомкам, является интеграция его в клетки зародышевого пути (гоноциты), из которых в дальнейшем развиваются органы воспроизводительной системы, продуцирующие яйцеклетки или сперматозоиды. Но это условие может быть достигнуто только в том случае, если эмбрионы, предназначенные для введения в них чужеродных генов, будут находиться на стадии зиготы, а именно, на стадии двух пронуклеусов до момента их слияния. В связи с этим возникает необходимость в разработке способов получения от животных-доноров большого количества эмбрионов на стадии зиготы.
Значительное удорожание технологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных обусловлено необходимостью содержать большое число животных-реципиентов, которым трансплантируют зиготы, микроинъецированные генноинженерными конструкциями, но с неустановленной интеграцией трансгена. Повысить эффективность технологии и значительно удешевить работы по транс-генезу, особенно на малоплодных животных, возможно в результате разработки способа определения интеграции трансгена еще на стадии эмбриона, что позволит пересаживать животным-реципиентам только зародыши с точно установленной интеграцией трансгена и таким образом существенно сократить число используемых реципиентов и затраты на их содержание.
Цели и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного была поставлена цель - усовершенствовать некоторые этапы тех-
нологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных для повышения ее эффективности.
Для достижения поставленной цели представляется целесообразным решение следующих задач:
-
Усовершенствовать основные этапы технологии трансплантации эмбрионов ранних стадий развития у свиней применительно к условиям получения трансгенных животных.
-
Усовершенствовать способ вызывания суперовуляции у свиней для повышения выхода эмбрионов на стадии зиготы.
-
Оптимизировать способ визуализации пронуклеусов в зиготах свиней с целью уменьшения его отрицательного воздействия на жизнеспособность зародышей.
-
Разработать способ биопсии трофобласта у предимпланта-ционных эмбрионов свиней, позволяющий сохранить жизнеспособность эмбриона и получить достаточное число бластомеров для проведения анализа интеграции чужеродного гена в геном хозяина.
5. Разработать способ определения интеграции введенных
чужеродных генов в геном сельскохозяйственных животных на ста
дии доимплантационных эмбрионов.
6. Выяснить возможность уменьшения числа используемых жи
вотных путем трансплантации овцам-донорам, с вызванной суперо
вуляцией, собственных и чужих зигот, микроинъецированных чуже
родным геном.
Научная новизна работы. Впервые на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и микрофракционирования тотальной ДНК бластомеров разработан способ определения интеграции чужеродных генов в геном животных на стадии эмбриона, позволяющий отделить низкомолекулярную ДНК генноинженерной конструкции, неин-тегрированную в хромосомную ДНК, от интегрированной и свести до минимума ложноположительный результат прямого ПЦР - анализа интеграции. Впервые определены стадии развития свиных эмбрио-
нов, наиболее пригодные для биопсии трофобласта, с целью анализа интеграции трансгена и трансплантации их животным-реципиентам. Усовершенствован способ вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней, позволяющий повысить выход эмбрионов на стадии зиготы. Уточнены условия визуализации пронуклеусов в свиных зиготах. Впервые показана возможность трансплантации овцам-донорам, с вызванной суперовуляцией, собственных и чужих зигот, микроинъецированных генноинженерной конструкцией.
Практическая значимость работы. Разработанные способы: определения интеграции чужеродных генов в геном животных на стадии эмбриона; вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней; использования овец-доноров с вызванной суперовуляцией в качестве реципиентов для трансплантации им собственных зигот, микроинъецированных чужеродными генами и усовершенствованный способ визуализации пронуклеусов в свиных зиготах могут быть использованы (и уже используются) в работах по получению трансгенных животных.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 47-й Научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых (Дубровицы, 1994), международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных" (Пушкин, 1994), 2-й международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995), рабочем совещании "Консервация генетических ресурсов" (Пущино 1996), научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (Москва, 1996), а также на заседании отдела биотехнологии ВНИ-ИФБиП.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть
печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц, 7 рисунков и 1 фотографию. Список литературы включает 23 6 работ.