Содержание к диссертации
Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Источники донорских ядер 11
1.2. Источники реципиентной цитоплазмы, факторы репрограммиро-вания 20
1.3. Синхронизация клеточных циклов донорского ядра и реципиентной цитоплазмы 28
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
II. Объекты и методы исследований 37
2.1. Получение клеток источников цитопластов 37
2.2. Получение клеток источников кариопластов 39
2.3. Реконструирование клеток 41
2.4. Слияние кариопластов с цитопластами 43
2.5. Активация 44
2.6. Культивирование 45
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 46
3.1. Разработка способа энуклеации яйцеклеток и трансплантации в них кариопластов 46
3.2. Эффективность различных вариантов активации интактных ооци-тов мышей с целью получения цитопластов для реконструирования клеток 58
3.3. Получение культур клеток сперматогоний и фибробластов взрослых животных для использования их в качестве источников кариопластов 69
3.4. Электрослияние цитопластов с кариопластами разных размеров и различного происхождения 79
3.5. Эффективность реконструирования яйцеклеток мышей в зависимо сти от состояния цитопластов 84
3.6. Эффективность репрограммирования кариопластов, полученных из бластомеров клеточных эмбрионов, в зависимости от стадии их клеточного цикла 88
ВЫВОДЫ 104
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
- Источники донорских ядер
- Получение клеток источников цитопластов
- Разработка способа энуклеации яйцеклеток и трансплантации в них кариопластов
Введение к работе
Актуальность исследований. Исследования по разработке технологии клонирования наиболее интенсивно стали развиваться с 1997 года - после получения овечки Долли, когда было показано, что в организме взрослых животных имеются недифференцированные клетки, обладающие тотипо-тентными свойствами, которые могут быть использованы в качестве источников кариопластов для реконструирования клеток с целью клонирования животных (Wilmut I. et al., 1997). В настоящее время в мире получено потомство нескольких видов животных из клеток, реконструированных при использовании в качестве кариопластов ядер клеток взрослых животных (Wakayama Т. et al., 1998; Wells D. et al., 1998,1999; Kubota K. et al., 2000). Однако, несмотря на то, что за последние годы в области клонирования животных достигнуты определенные успехи, они пока в большей степени носят эмпирический характер, поэтому положительные результаты сильно варьируют от эксперимента к эксперименту. Основной причиной такой нестабильности результатов является недостаточность фундаментальных знаний о глубинных механизмах, обусловливающих процесс репрограммирования кариопластов цитопластами, и факторов, влияющих на этот процесс.
Исследования последних лет свидетельствуют о том, что в лучших экспериментах при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных у некоторых видов млекопитающих удается получить определенный процент бластоцист (20%- у овец: Schnieke А. et al., 1997; Wilmut I. et al., 1997; до 40%- у мышей: Wakayama Т. et al., 1998; до 20%- у крупного рогатого скота: Kato Y. et al, 1998), однако средние показатели получения живого потомства у этих видов варьируют от 1 до 3% от числа пересаженных эмбрионов (Wilmut I. et al.,1997; Wakayama Т. et al., 1998). Такие низкие показатели получения клонированного потомства большинство исследователей объясняет следствием ненадлежащего
5 репрограммирования кариопласта цитопластом, что приводит ко многим аномалиям эмбрионального развития.
Успешное получение потомства в результате пересадки ядер достигается только при благоприятном взаимодействии сложнейших механизмов и регулирующих их факторов, многие из которых в настоящее время еще плохо изучены.
От момента получения клеток источников цитопластов и клеток- доноров кариопластов до получения живого потомства стоит целый ряд экспериментальных манипуляций и огромное количество еще не понятных механизмов, препятствующих развитию реконструированных клеток. Поэтому, в настоящее время ученые, занятые проблемой клонирования животных, вынуждены вернуться к постепенным, последовательным более глубоким исследованиям каждого этапа технологии клонирования. Начиная от исследований влияния полноты энуклеации яйцеклеток при получении цитопластов и кончая исследованиями о влиянии клеточного цикла кариопластов и действия электрического импульса на дальнейшее развитие реконструированных клеток.
Уже первые результаты этих исследований показали, что некоторые методические приемы, используемые ранее при реконструировании клеток, оказывают существенное отрицательное влияние на развитие как эмбриона, так и плода. Так выявлено, что использование коротковолновых флюорохромов (типа Hoechst 33342) для полноты энуклеации яйцеклеток при получении цитопластов, оказывает отрицательное влияние на поздних стадиях развития плода, которое не было отмечено на ранних стадиях развития реконструированных клеток (Dominko Т. et al., 1993).
В связи с начавшимся широким использованием ядер соматических клеток взрослых животных в качестве кариопластов при реконструировании клеток, возникли проблемы с электрослиянием из-за уменьшения площади контакта между цитопластом и мелкими кариопластами. Чтобы повысить процент слияния исследователи вынуждены повышать напряже- ниє электрического импульса, что приводит к длительной дестабилизации цитоплазматической мембраны цитопласта и снижению жизнеспособности реконструированных клеток. Кроме того, из-за различий между типами клеток по биохимическим свойствам липидов клеточных мембран необходимо оптимизировать параметры и условия электрослияния для каждой клеточной линии.
Для того, чтобы происходило дальнейшее развитие реконструированных клеток необходимо активировать цитопласт, то есть индуцировать в нем программу развития первоначально контролируемую материнским организмом, освобождая его от мейотической задержки. После пересадки ядра нормальное развитие реконструированной клетки будет зависеть от способности цитопласта ремоделировать структуру хроматина и соответствующим образом репрограммировать характер экспрессии генов карио-пласта. Зрелый цитопласт содержит материнские транскрипты РНК и белки, которые направляют развитие дробящегося эмбриона до нормального времени активации собственного генома эмбриона, когда эмбриональные ядра начинают синтез своей собственной РНК, направляющей эмбриогенез.
Установлено, что у млекопитающих активация яйцеклеток индуцированная сперматозоидом в процессе оплодотворения сопровождается серией повторных временных повышений уровня внутриклеточного свободного кальция, которые продолжаются несколько часов. В последнее время предпринимаются многочисленные попытки искусственно активировать яйцеклетки с помощью физических и химических агентов, однако проблема остается еще далеко не решенной.
Некоторые успехи в получении живого потомства при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных достигнуты благодаря исследованиям влияния стадии клеточного цикла донорского ядра и цитопласта- реципиента на развитие реконструированных клеток (Campbell К. et al., 1996). Эти первые немногочисленные исследо-
7 вания показали, что для нормального развития реконструированных клеток необходима координация клеточных циклов кариопласта и цитопласта, чтобы обеспечить в реконструированной клетке диплоидный набор хромосом после первого деления дробления.
Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии клонирования, основанной на трансплантации ядер диплоидных клеток в энуклеированные яйцеклетки, исследования должны быть направлены на изучение процессов, происходящих при осуществлении каждого этапа технологии и на их совершенствование.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение факторов лимитирующих процесс реконструирования яйцеклеток и на основе полученных результатов усовершенствовать основные этапы технологии клонирования млекопитающих.
Для достижения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи: - выявить факторы, лимитирующие полноту удаления ядерного материала из яйцеклеток при получении цитопластов, и разработать способы, . позволяющие более четко визуализировать хроматин в неоплодотворен-ных яйцеклетках; определить факторы, лимитирующие процесс удаления хроматина из яйцеклеток, и разработать более эффективный способ их энуклеации; изучить состояние популяций сперматогенных клеток в семенниках мышей и быков разных возрастов и разработать способы их получения и сохранения с целью использования в качестве кариопластов при реконструировании яйцеклеток; изучить эффективность реконструирования мышиных яйцеклеток в зависимости от состояния цитопластов, полученных из различных реци-пиентных клеток (неоплодотворенных яйцеклеток и зигот);
8 - изучить эффективность репрограммирования кариопластов, полученных из бластомеров 2-клеточных эмбрионов в зависимости от стадии их клеточного цикла.
Научная новизна исследований.
Впервые в исследованиях на мышах с точно фиксированным временем осеменения определены фазы клеточного цикла кариопластов, оптимальные для репрограммирования цитопластами, полученными из неошгодо-творенных яйцеклеток. Установлено, что кариопласты, выделенные из бластомеров 2-клеточных эмбрионов, находящихся в фазе G1 клеточного цикла лучше репрограммируются цитопластами в реконструированных клетках, по сравнению с кариопластами, находящимися в фазах S и G2 клеточного цикла.
Впервые изучена возможность получения, сохранения в культуре и использования в качестве кариопластов, при реконструировании клеток, сперматогоний мышей и быков разного возраста. Выявлены факторы, лимитирующие процесс удаления хроматина из яйцеклеток млекопитающих и разработан эффективный способ энуклеации и реконструирования яйцеклеток.
Впервые определены оптимальные режимы комбинированной химической активации яйцеклеток, позволяющие более четко визуализировать хроматин и полностью удалять его при получении цитопластов.
Практическая значимость.
Разработанный способ энуклеации и реконструирования яйцеклеток с использованием разреза в прозрачной оболочке может быть использован в биотехнологии клонирования для повышения эффективности реконструирования эмбрионов, так как обладает преимуществами перед известными способами по простоте и скорости исполнения, обеспечивает высокую сохранность оперируемых клеток.
Комбинированные способы химической активации интактных ооцитов, включающие обработку цитохалазином Б, могут быть использованы с целью создания четкой картины расположения ядерного материала в ооци-тах, и тем самым обеспечить полное его извлечение при энуклеации.
Результаты исследований полученные при определении фаз клеточного цикла кариопластов, оптимальных для репрограммирования цитопла-стами, могут быть использованы в работах по получению клонированных млекопитающих.
Модификации способа электрослияния комплекса сперматогония- ци-топласт могут быть с успехом использованы для электрослияния с цито-пластом кариопластов соматических клеток малых размеров (10-15 мкм).
Положения выносимые на защиту
Разработанный способ энуклеации яйцеклеток, путем вырезания фрагмента блестящей оболочки, позволяет упростить и ускорить процесс реконструирования клеток и обеспечивает высокую сохранность оперируемых клеток.
Разработанные комбинированные способы химической активации интактных яйцеклеток, позволяют четко визуализировать ядерный материал и обеспечивают его полное удаление из неоплодотворенных яйцеклеток при получении цитопластов.
Кариопласты, полученные из бластомеров 2-клеточных эмбрионов мышей, находящиеся в фазе G1 клеточного цикла, лучше репро-граммируются цитопластами в реконструированных клетках, по сравнению с ядрами, находящимися в фазах S и G2 клеточного цикла.
4. Повышение контакта между кариопластом и цитопластом с помощью фитогемагглютинина и центрифугирования достоверно повышает эффективность электрослияния кариопластов малых размеров.
10 Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчётных сессиях ВНИИФБиП в период с 1999 по 2002г., а также на: второй международной научной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - ВНИИ сельхоз. биотехнологии, Москва, 18-19 октября 2000 г. международной научной конференции «ДНК - технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, Дубровицы, 12 ноября 2001г. - международной научной конференции «Современные дос тижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, Дубровицы, 19-20 ноября 2002г.
Источники донорских ядер
Современный прогресс в клонировании млекопитающих дает возможность использовать в качестве донорских клеток, как эмбриональные, так и соматические клетки после длительного культивирования in vitro.
Для повышения результативности ядерной пересадки донорские клетки независимо от происхождения должны обладать тотипотентными свойствами.
К настоящему времени накоплен большой экспериментальный материал по клонированию сельскохозяйственных и лабораторных животных с использованием в качестве источника донорских ядер недифференцированных эмбриональных клеток.
Первые успешные результаты с высоким выходом развития реконструированных эмбрионов до получения потомства (на уровне контроля) были достигнуты при пересадке пронуклеусов в энуклеированные зиготы мышей (McGrath J., Solter D.,1983).
Значительно снижалась эффективность развития реконструированных клеток, полученных в результате трансплантации кариопластов 2-кле-точных эмбрионов в энуклеированные зиготы, только 19% из них развивались до морулы- бластоцисты (McGrath J., Solter D.,1984) и 7% до блас-тоцисты (Tsunoda Y. et.al.,1987). Однако, более высокая эффективность развития таких реконструированных эмбрионов (45,2%) была достигнута в опытах Smith L., Wilmut I. et al. (1988).
При трансплантации ядер мышиных эмбрионов более продвинутых стадий (4- 8- клеток) в энуклеированные зиготы, развитие реконструированных клеток ограничивалось дроблением до 2- 4-клеток , случаев развития до стадии бластоцисты не наблюдали (Robl J., Gilligan В. et al.,1986; Tsunoda Y.et al.,1987).
Опыты по использованию для трансплантации ядер из бластомеров более поздних, чем 8-клеточная стадия, не увенчалась успехом (McGrath J., Solter D.,1984; Robl J. et al.,1986; Barnes F. et al.,1987; Tsunoda Y. et al.,1987).
Эти данные указывают, что в эмбриогенезе мышей клеточные ядра быстро теряют тотипотентные свойства.
Если использовать в качестве реципиентных клеток для трансплантации ядер не энуклеированные зиготы, а энуклеированные 2-клеточные эмбрионы, развитие реконструированных клеток значительно повышается. Так, после трансплантации ядер бластомеров 4- 8-клеточных эмбрионов в энуклеированные 2-клеточные эмбрионы 72% и 35% реконструированных эмбрионов, соответственно, развивались до стадии бластоцисты и после пересадки самкам- реципиентам получено потомство (Tsunoda Y. et al.,1987).
Более успешные эксперименты по ядерной трансплантации были проведены с использованием ооцитов в качестве реципиентных клеток. Так в результате трансплантации ядер бластомеров поздних 2-клеточных эмбрионов в энуклеированные ооциты 23%- 25% реконструированных клеток развивались до стадии бластоцисты и после пересадки самкам- реципиентам было получено потомство. Однако, реконструированные клетки, полученные после трансплантации кариопластов 8-клеточных эмбрионов и внутренней клеточной массы (ICM), развивались только до стадии бластоцисты с эффективностью 4% и 10%, соответственно (Копо Т. et al. 1991,1992).
Значительный интерес представляют эксперименты Kwon О., Копо Т. (1996) с использованием серийной пересадки для трансплантации ядер 4-клеточных эмбрионов в энуклеированные ооциты с последующей активацией реконструированных клеток и обработкой цитохалазином Б для подавления цитокинеза и образования двух гаплоидных ядер, которые по отдельности пересаживали в энуклеированные зиготы.
В результате удалось получить высокую эффективность развития реконструированных клеток, до стадии бластоцисты развивалось 83% (58/70) эмбрионов и после пересадки самкам реципиентам родилось 14 (57%) мышат.
Полученные результаты серийной пересадки показали, что ядра 4- клеточных эмбрионов были тотипотентны при трансплантации в цитопласты, полученные как из ооцитов, так и зигот.
Проявление тотипотентных свойств ядер клеток трофобласта, как и возможность их репрограммирования долгое время ставилось под сомнение.
Получение клеток источников цитопластов
Исследования проводились на гибридных мышах Fl (CBA C57BL) в возрасте 4-7 недель. В качестве цитопластов были использованы энуклеированные ооциты на стадии метафазы II, полученные через 12 часов после введения самкам- донорам хорионического гонадотропина человека (чХГ) для вызывания суперовуляции. Для получения максимального количества реципиентных клеток проводили гормональную стимуляцию самок. Вначале подкожно инъецировали 10-20 И.Е. ГСЖК (Сергон), затем через 48 часов 10-20 И.Е. хорионического гонадотропина человека (чХГ).
Ооциты получали следующим образом: вначале отпрепарированные яйцеводы помещали в каплю с фосфатно- буферной средой Дюльбекко (ФБС), затем двумя тонкими иглами разрывали ампулярную часть яйцевода и извлекали ооциты, окруженные слоем кумулюсных клеток. Освобождение ооцитов от клеток кумулюса проводили в 0,1% растворе гиалу-ронидазы (Sigma, США) при мягком пипетировании.
Получение клеток источников кариопластов
В качестве источника кариопластов использовали бластомеры 2-кле-точных мышиных эмбрионов и сперматогонии мышей и быков. При этом бластомеры находились на различных стадиях клеточного цикла:
G1 - через 0,5-1 час после первого деления дробления (ранние);
S - через 5-6 часов после первого деления дробления (средние);
G2 - через 44-48 часов после введения чХГ (поздние).
Ввиду того, что крайне тяжело получить кариопласты бластомеров 2-клеточных эмбрионов мышей в G1 фазе из-за ее кратковременности, была проведена задержка развития яйцеклеток еще на стадии поздней зиготы путем воздействия колцемидом.
Для получения ранних 2-клеточных эмбрионов вначале извлекали поздние зиготы через 29- 30 часов после инъекции чХГ. Затем поздние зиготы обрабатывали колцемидом в концентрации 0,1 мкг/мл при 37 С в среде Ml6 (Sigma, США) в течение 1 часа. После обработки колцемидом
поздние зиготы были поставлены на культивирование в среде Ml6 на 0,5-1,5 часа. Через каждые 0,5 часа наблюдали за развитием. Продробившиеся эмбрионы (2-клеточные) были использованы сразу же для получения ка-риопластов, находящихся в фазе G1 клеточного цикла.
Часть продробившихся эмбрионов оставляли в культуре еще на 4 часа для получения кариопластов, находящихся в фазе S клеточного цикла.
Двуклеточные эмбрионы, находящиеся в G2 фазе клеточного цикла, получали от мышей- доноров через 44-48 часов после введения чХГ и спаривания с самцами.
Для получения отдельных бластомеров- доноров ядер, у 2-клеточных эмбрионов предварительно была удалена прозрачная оболочка с помощью 0,5% раствора проназы, приготовленного на фосфатно- солевом буфере Дюльбекко без ионов Са2+ и Mg2+ , в течение 3-5 минут. Затем, свободные от прозрачной оболочки эмбрионы были перенесены в раствор ФСБ (без Са и Mg ) и пипетированы для получения отдельных бластомеров.
В связи с тем, что для получения оптимального количества клеточной суспензии семенников мышей 4- 6-дневного возраста их число должно составлять в каждом эксперименте от 30 до 90 животных, мы сочли целесообразным проведение только одного такого рода эксперимента с целью изучения структуры сперматогоний. В дальнейшей работе в качестве клеток- доноров использовали сперматогоний, выделенные из суспензии сперматогенных клеток взрослых мышей. Для выделения клеток спер-матогенного ряда у взрослых животных достаточно было использовать в каждом эксперименте только два семенника от одного самца.
Разработка способа энуклеации яйцеклеток и трансплантации в них кариопластов
Первым этапом технологии реконструирования клеток является энуклеация ооцитов или зигот, с целью получения цитопластов.
Важность разработки эффективных способов энуклеации яйцеклеток млекопитающих определяется тем, что энуклеация является одним из самых трудоемких этапов при реконструировании клеток. Энуклеация по существу представляет собой процесс искусственного разделения клетки на два изолированных фрагмента - цитопласт и кариопласт. Основным условием успешной энуклеации клетки является целостность цитоплаз-матической мембраны, окружающей как цитопласт, так и кариопласт. Только со времени разработки атравматичного способа энуклеации яйцеклеток и зигот (McGrath J., Solter D.,1983) стало возможным развитие работ по клонированию млекопитающих (рис. 2).
Сущность этого способа заключается в том, что из клетки удаляют ядерный материал без прокалывания цитоплазматической мембраны, медленным всасыванием в микропипетку ядерного материала с частью цитоплазмы, окруженной плазматической мембраной. Удаление ядерного материала из реципиентнои клетки производится с помощью микропипетки со скошенным острым кончиком, имеющим внутренний диаметр 15-20 микрон (энуклеационная микропипетка).
При данном способе энуклеации яйцеклеток необходимо, чтобы кончик энуклеационной микропипетки прогибал прозрачную оболочку на незначительную глубину и легко входил под оболочку не только острием, но и своей широкой скошенной частью. Однако, очень часто прокалывание прозрачной оболочки происходит только острием кончика микропипетки и расширенная его часть с трудом проходит внутрь образовавшегося прокола в прозрачной оболочке.
Прозрачная оболочка при этом прогибается на значительную глубину, острие микроинструмента достигает противоположной стороны оболочки изнутри клетки, в результате чего происходит прокол цитоплазматическои мембраны острым кончиком энуклеационнои микропипетки, что в свою очередь приводит к быстрой гибели клетки. Поэтому, вскоре после разработки этого способа стали предприниматься попытки, направленные на его совершенствование.
