Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
1.1 Актуальность темы исследований 4
1.2 Степень разработанности темы 5
1.3 Цель и задачи исследований 6
1.4 Научная новизна работы 6
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы 6
1.6 Методология и методы исследования 7
1.7 Положения диссертации, выносимые на защиту 8
1.8 Степень достоверности и апробация результатов 8
2. Основная часть 9
2.1 Обзор литературы 9
2.1.1 Питательные среды для культивирования клеток 9
2.1.2 Животная клетка (морфология, физиология) 13
2.1.3 Культивирование клеток .15
2.1.4 Создание криобанка штаммов линий клеток 20
2.1.5 Условия работы с культурой клеток в крупномасштабном изготовлении иммунобиологических препаратов 22
2.1.6. Специфическая профилактика против ящура и бешенства животных 26
2.1.7 Заключение по обзору литературы 28
2.2 Собственные исследования 28
2.2.1. Разработка рецептуры и технологии приготовления ростовой среды для суспензионного культивирования клеток ВНК – 21/13-13 30
2.2.2. Технология производства банка культур клеток для промышленного изготовления вакцин против ящура и бешенства 38
2.2.3. Оптимизация условий суспензионного культивирования культуры клеток ВНК-21/13-13 в масштабах биотехнологического производства 62
2.2.4. Экономическая эффективность внедрения ростовой среды для суспензионного культивирования клеток ВНК – 21/13-13 при изготовлении вакцин против ящура и бешенства животных 66
3. Заключение 66
3.1 Выводы 66
3.2.Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы 67
3.3 Список сокращений и условных обозначений .68
3.4 Список литературы
- Степень разработанности темы
- Методология и методы исследования
- Создание криобанка штаммов линий клеток
- Технология производства банка культур клеток для промышленного изготовления вакцин против ящура и бешенства
Введение к работе
1.1 Актуальность темы исследований. Для ветеринарной науки и практики значительный интерес представляет получение стабильных линий перевиваемых клеток и внедрение их в производство вакцинных препаратов, в частности, вакцин против ящура и бешенства.
Об актуальности проблемы свидетельствуют многочисленные работы, посвященные различным аспектам решения вопросов борьбы с ящуром и бешенством животных (Бурдов А.К.,1990; Гусев А.А.,2000; Дудников А.И.,2007; Самуйленко А.Я.,1978-1985,2000,2013; Сергеев В.А., 1993; Михалишин В. В., Щербаков А. В., Мамков Н. С. 2006; Сафонов Г.А.,2011; Рыбаков С.С., Метлин А.Е.,2009; Мищенко А.В., Дрыгин В.В., Лозовой Д.А., 2014; Макаров В.В., Гулюкин М.И., 2016; Hassan A. I., 2016.)
За последние десятилетия на ФКП Щелковский биокомбинат и ФГБНУ
ВНИИТИБП выполнен цикл научно-исследовательских работ по
совершенствованию основных технологических процессов производства
вакцин против ящура и бешенства (конструирование питательных сред на
основе отечественных ингредиентов, оптимизация процессов
промышленного культивирования линий культур клеток и вирусов,
изготовление высокоиммуногенных вакцин, изучение иммунитета у
животных привитых вакцинами против ящура и бешенства (Самуйленко А.
Я.,2000; Скичко Н.Д. 1981-1986, 1992,2001;Албулов А.И. 1987,2004; Соболев
В.В. 1981; Мельник Н.В.,2001; Зенов Н.И., 2001;Стрельников В.А.,
Красуткин С. Н., 2001;Еремец В.И.,1981,1999; Литенкова И.Ю., 2014;
Иванов В.С.,1978-2010; Кузнецова С.В., Гринь С.А.,2008; Матвеева И.Н.,2016 и др.).
Огромное значение при изготовлении средств специфической
профилактики против ящура и бешенства имеет клеточная система для
репродукции вирусов. Всестороннее углубленное изучение биологии клетки
и ее взаимосвязи с технологиями искусственного выращивания будут
способствовать в дальнейшем изготовлению вакцин нового поколения,
стремлению получать конкретные результаты в производстве биопрепаратов
(Дьяконов Л.П., Конюхов А.Ф., Василевич Е.Н., 1995).
Совершенствование технологии культивирования клеток in vitro
позволило решить вопросы увеличения выпуска большого количества
биопрепаратов, используя первичные культуры клеток, субкультуры,
диплоидные штаммы, перевиваемые гибридные линии клеток и генетически
трансформированные культуры клеток животных.
Одной из важных предпосылок успешного применения культур клеток
в различных сферах биологии является разработка питательных сред,
пригодных для длительного культивирования клеток животных, тканей вне
организма (Витакор А. 1976, Сергеев С.П. 1978, Строкина Г.М. 2000,
Хазинов Н.З., Харитонов Н.З., Гальнбек Т.В. 2009). Особо важную роль для
жизнедеятельности клеток играют заменимые и незаменимые аминокислоты
включая: лизин, гистидин, аргинин (С. Waymouth, 1972; R.Holley, 1975).
Включение аминокислот в жизненный цикл клетки во многом зависит от
состава питательной среды и условий культивирования (Сергеев В.Л., 1978,
Дьяконов Л.П., Поздняков Л.П., Гололобова М.Т., Панкова Г.Е., 1988).
Таким образом, совершенствование промышленных технологий
изготовления вакцин против ящура и бешенства животных, представляется
обоснованной и актуальной задачей.
1.2. Степень разработанности темы. В настоящее время вакцины
против ящура и бешенства животных изготавливают методами монослойного
(роллерный, клеточные фабрики, псевдосуспензионный - микроносители) и
глубинного культивирования с применением различных питательных сред.
Растущая потребность вакцин для ветеринарной практики требует
увеличения их номенклатуры, совершенствования технологических
процессов промышленного изготовления, современной методологии
конструирования питательных сред и применения высокотехнологического
оборудования. Решение задач по разработке и внедрению в производство
эффективных ростовых сред, создание банка культур клеток ВНК-21/13-13 и
оптимизация технологических процессов культивирования вирусов будут способствовать получению высокоиммуногенных вакцин против ящура и бешенства сельскохозяйственных животных.
1.3. Цель и задачи исследований. Целью исследований является совершенствование промышленных технологий изготовления вакцин против ящура и бешенства животных.
Для реализации данной цели было необходимо решить следующие задачи:
-Разработать рецептуру и технологию приготовления ростовой среды для суспензионного культивирования клеток ВНК -21/13-13.
-Разработать технологию производства банка культур клеток для изготовления вакцин против ящура и бешенства животных.
-Оптимизировать условия суспензионного культивирования культуры клеток ВНК – 21/13-13 в масштабах биотехнологического производства.
-Оценить экономическую эффективность внедрения ростовой среды и
технологии суспензионного культивирования культуры клеток ВНК -21/13-
13 при производстве вакцин против ящура и бешенства
сельскохозяйственных животных.
1.4.Научная новизна работы. Разработана рецептура оригинального
состава ростовой среды и технология суспензионного культивирования
клеток ВНК – 21/13-13. Создан промышленный банк культур клеток ВНК –
21/13-13 для изготовления вакцин против ящура и бешенства
сельскохозяйственных животных. Оптимизированы условия суспензионного культивирования культуры клеток ВНК – 21/13-13 в масштабах биотехнологического производства. Новизна и приоритетность исследований подтверждена патентами: "Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих" № 2558253 от 01.06.2015г.; "ВНК – 21/13-13 перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции
вируса ящура и вируса бешенства" № 2553552 от 20.05. 2015г.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
проведенных исследований использованы при разработке рецептуры и
состава ростовой среды, которая внедрена при суспензионном
культивировании линии клеток ВНК – 21/13-13. Создан банк культур клеток
для промышленного изготовления вакцин против ящура и бешенства
животных. Оптимизированы условия технологии суспензионного
культивирования культуры клеток ВНК – 21/13-13 в масштабах биотехнологического производства. Нормативно-техническая документация на производство и контроль вакцин против ящура и бешенства животных с использованием ростовой среды для суспензионного культивирования клеток ВНК – 21/13-13 используется на ФКП «Щелковский биокомбинат».
1.5. Методология и методы исследования.
Объектами исследований являлись: перевиваемая линия клеток ВНК-21 клон 13 - ВНК-21/13-13 для суспензионного культивирования (ФКП «Щелковский биокомбинат»). Питательные среды для культивирования конструировали по прописям среды Игла: МЭМ, ДМЭМ, 199, на основе буферной системы Хенкса, с добавлением сыворотки КРС, аминокислот, витаминов, гидролизатов, растворов химических солей NaCl, KCl, MgS04, Na2HP04, KH2P04, CaCl2, NaHC03.
Оборудование. Биоферментёры емкостью 40-2000л; микроскоп, рН-метр, ламинарные боксы, счетчики для подсчета клеток, фильтрационные установки, ультрафильтрационные установки, роллерные установки, термостат, лабораторная посуда, камера Горяева, центрифуга, аналитические весы. Суспензионное культивирование проводили в биоферментере MD-300 фирмы "MARUBISHI" (Япония) и в промышленных биоферментёрах Applikon (Голландия) с автоматическим поддержанием концентрации водородных ионов (рН), концентрации растворенного кислорода DO (%), температуры (ТС), ручным регулированием подачи воздуха и скорости перемешивания (об/мин). Контроль на стерильность и контаминацию
проводили согласно ГОСТ 28085-89 "Препараты биологические. Метод
бактериологического контроля стерильности". Криоконсервирование
клеточных культур проводили в азоте. Статистическую обработку результатов, расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем – с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010.
1.6. Положения диссертации, выносимые на защиту:
-разработка рецептуры и технологии приготовления ростовой среды для суспензионного культивирования клеток ВНК – 21/13-13;
-технология производства банка культур клеток ВНК – 21/13-13 для промышленного изготовления вакцин против ящура и бешенства;
-оптимизация условий суспензионного культивирования культуры клеток ВНК-21/13-13 в масштабах биотехнологического производства;
-экономическая эффективность внедрения разработанных технологий при производстве вакцин против ящура и бешенства сельскохозяйственных животных.
1.7. Степень достоверности и апробация результатов. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: в виде ежегодных отчетов ученого совета и методической комиссии ФГБНУ ВНИТИБП (2013-2016 гг.), на Международной научно-практической конференции (г. Армавир). Достоверность результатов исследований подтверждена соответствием теоретических данных с результатами проведенных экспериментальных исследований. Полученные результаты, выводы и практические рекомендации подтверждены в условиях промышленного производства.
1.8. Публикация научных исследований. По материалам
диссертационной работы опубликовано 4 научных работы, 2 патента, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
1.9.Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Результаты научных исследований соответствуют пунктам 2, 3, 4 и 11 паспорта специальности 03.01.06 и пунктам 2,3,9 и 14 паспорта специальности 06.02.02.
1.10. Объем и структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 90 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, включающие материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, иллюстрирована 8 рисунками и 15 таблицами. Список литературы включает 195 наименования, из которых 119 отечественных и 76 зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
1.11. Личный вклад автора заключается в научном обосновании основных положений диссертации, постановки цели и задач исследований, планировании экспериментальных исследований, обобщении результатов и рекомендаций для практического применения. Результаты диссертационной работы получены лично автором, или в качестве ответственного исполнителя на отдельных этапах проведенных исследований.
1.12. Благодарности. В выполнении некоторых разделов работы
принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь
доктор биологических наук, профессор С.А. Гринь; доктор биологических
наук, профессор В.И. Клюкина; профессор, доктор ветеринарных наук,
президент национальной ассоциации "Ветбиопром" Н.В. Мельник; и.о.
директора ФКП «Щелковский биокомбината» Г.А. Бачериков; руководитель
службы развития ФКП «Щелковский биокомбинат», кандидат ветеринарных
наук И.Ю. Литенкова; заместитель директора по производству ФКП
«Щелковский биокомбинат», кандидат ветеринарных наук В. В. Ельников;
советник директора по противовирусному производству, кандидат
биологических наук С. Н. Красуткин; советник директора по производству
ФКП «Щелковский биокомбината» доктор ветеринарных наук Н. И. Зенов -
за что приносим им сердечную благодарность. Выражаем признательность специалистам ФКП «Щелковский биокомбинат», а также сотрудникам ФГБНУ ВНИТИБП за помощь в выполнении отдельных этапов работы.
Степень разработанности темы
Об актуальности проблемы свидетельствуют многочисленные работы, посвященные различным аспектам решения вопросов борьбы с ящуром и бешенством животных (Бурдов А.К.,1990; Гусев А.А.,2000; Дудников А.И.,2007; Самуйленко А.Я.,1978-1985,2000,2013; Сергеев В.А., 1993; Михалишин В. В., Щербаков А. В., Мамков Н. С. 2006.; Сафонов Г.А.,2011; Рыбаков С.С.,Метлин А.Е.,2009; Мищенко А.В., Дрыгин В.В., Лозовой Д.А., 2014; Макаров В.В., Гулюкин М.И., 2016; Hassan A. I., 2016.) За последние десятилетия на ФКП Щелковский биокомбинат и ФГБНУ ВНИИТИБП выполнен цикл научно-исследовательских работ по совершенствованию основных технологических процессов производства вакцин против ящура и бешенства ( конструирование питательных сред на основе отечественных ингредиентов, оптимизация процессов промышленного культивирования линий культур клеток и вирусов, изготовление высокоиммуногенных вакцин, изучение иммунитета у животных, привитых вакцинами против ящура и бешенства (Самуйленко А. Я.,2000; Скичко Н.Д. 1981-1986, 1992,2001;Албулов А.И. 1987,2004; Соболев В.В. 1981; Мельник Н.В.,2001; Зенов Н.И., 2001;Стрельников В.А., Красуткин С. Н., 2001;Еремец В.И.,1981,1999; Иванов В.С.,1978-2010; Кузнецова С.В., Гринь С.А.,2008; Матвеева И.Н.,2016 и др.) .
Огромное значение при изготовлении средств специфической профилактики против ящура и бешенства имеет клеточная система для репродукции вирусов. Всестороннее углубленное изучение биологии клетки и ее взаимосвязи с технологиями искусственного выращивания будут способствовать в дальнейшем изготовлению вакцин нового поколения, стремлению получать конкретные результаты в производстве биопрепаратов (Дьяконов Л.П., Конюхов А.Ф., Василевич Е.Н., 1995). Совершенствование технологии культивирования клеток in vitro позволило решить вопросы увеличения выпуска большого количества биопрепаратов, используя первичные культуры клеток, субкультуры, диплоидные штаммы, перевиваемые гибридные линии клеток и генетически трансформированные культуры клеток животных. Одной из важных предпосылок успешного применения культур клеток в различных сферах биологии является разработка питательных сред, пригодных для длительного культивирования клеток животных, тканей вне организма (Витакор А. 1976, Сергеев С.П. 1978, Строкина Г.М. 2000, Хазинов Н.З., Харитонов Н.З., Гальнбек Т.В. 2009). Особо важную роль для жизнедеятельности клеток играют заменимые и незаменимые аминокислоты, включая лизин, гистидин, аргинин (С. Waymouth, 1972; R.Holley, 1975). Включение аминокислот в жизненный цикл клетки во многом зависит от состава питательной среды и условий культивирования (Сергеев В.Л., 1978, Дьяконов Л.П., Поздняков Л.П., Гололобова М.Т., Панкова Г.Е., 1988). Таким образом, совершенствование промышленных технологий изготовления вакцин против ящура и бешенства животных, представляется обоснованной и актуальной задачей.
Степень разработанности темы. В настоящее время вакцины против ящура и бешенства животных изготавливают методами монослойного (роллерный, клеточные фабрики, псевдосуспензионный-микроносители) и глубинного культивирования с применением различных питательных сред. Растущая потребность вакцин для ветеринарной практики требует увеличения их номенклатуры, совершенствования технологических процессов промышленного изготовления, современной методологии конструирования питательных сред и применения высокотехнологического оборудования. Решение задач по разработке и внедрению в производство эффективных ростовых сред, создание банка культур клеток ВНК-21/13-13 и оптимизация технологических процессов культивирования вирусов будут способствовать получению высокоиммуногенных вакцин против ящура и бешенства сельскохозяйственных животных.
Для реализации данной цели было необходимо решить следующие задачи: -Разработать рецептуру и технологию приготовления ростовой среды для суспензионного культивирования клеток ВНК -21/13-13. -Разработать технологию производства банка культур клеток для изготовления вакцин против ящура и бешенства животных. -Оптимизировать условия суспензионного культивирования культуры клеток ВНК – 21/13-13 в масштабах биотехнологического производства. -Оценить экономическую эффективность внедрения ростовой среды и технологии суспензионного культивирования культуры клеток ВНК -21/13-13 при производстве вакцин против ящура и бешенства сельскохозяйственных животных. 1.4.Научная новизна работы. Разработана рецептура оригинального состава ростовой среды и технология суспензионного культивирования клеток ВНК – 21/13-13. Создан промышленный банк культур клеток ВНК – 21/13-13 для изготовления вакцин против ящура и бешенства сельскохозяйственных животных. Оптимизированы условия суспензионного культивирования культуры клеток ВНК – 21/13-13 в масштабах биотехнологического производства. Новизна и приоритетность исследований подтверждена патентами: "Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих" № 2558253 от 01.06.2015г.; "ВНК – 21/13-13 перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства" № 2553552 от 20.05. 2015г.
Методология и методы исследования
Роллерное культивирование клеток. Термин «роллерные культуры»
обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в отдельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте культуру клеток называют роллерно-суспензионной. «Урожайность» клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки. Исследователи использовали различные пути увеличения площади поверхности, на которой происходило прикрепление и размножение клеток.
Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Чаще всего для культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производственных условиях объем их может достигать 20 литров и более. Аппараты для роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их несложно. Важное значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения бутылей варьировали от 8—12 об/час, до 1 об/ мин. Наиболее пригодной для различных клеточных культур оказалась скорость вращения флаконов в пределах 0,5—1 об/мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин после засева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5— 1,0 об / мин) для равномерного распределения материалов, затем перевести их на низкую скорость вращения (20—30 об/час) [34, 56, 60, 61, 63, 86, 88, 90, 91, 94, 110, 117, 118, 122, 123, 124].
Для лучшего размножения клеток в роллерных аппаратах необходима адаптация их к новым условиям культивирования. Роллерный метод культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преимуществом роллерных культур по сравнению с традиционными стационарными культурами является, в частности, более экономичное использование питательных сред и более высокий выход вирусного антигена [1, 2, 3, 8, 29, 32, 150, 152, 153, 183, 185, 187]. Суспензионное культивирование клеток. В 1953 году Оуенс с сотрудниками впервые показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспендированном состоянии. С тех пор метод суспензионного культивирования привлекает внимание исследователей в связи с его высокой эффективностью при накоплении больших количеств клеток. Оказалось, что клетки перевиваемых линий, в отличие от остальных типов клеточных культур, могут длительно культивироваться во взвешенном состоянии. Клетки в этих условиях размножаются, не прикрепляясь к стенкам культурального сосуда, находясь в суспензионном состоянии, благодаря постоянному перемешиванию среды. При оптимальном режиме выращивания клетки в суспензиях быстро размножаются имеют более высокий «урожай», чем в стационарных культурах. Первичные и перевиваемые линии клеток имеют неодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероплоидные и анеуплоидные постоянные линии, в отличие от псевдодиплоидных линий, адаптируются быстрее к росту в суспензии.
Суспензионные культуры готовят из однослойных культур. Клетки отслаивают от стекла с помощью растворов версена и трипсина. Осадок клеток после центрифугирования (1000 об/мин.) ресуспендируют в свежей питательной среде. Приготовленную суспензию помещают в культуральные сосуды (реакторы, ферментеры) и выращивают при постоянном перемешивании. В научных исследованиях концентрация клеток в исходной суспензии колеблется от 0,3 до 10x105 в 1 мл. Оптимальная концентрация клеток в исходной суспензии должна быть 2—5х105 в 1 мл. По мнению Эрла и его сотрудников, концентрация клеток в суспензированной культуре должна быть такой, чтобы фаза логарифмического роста наступала не позднее 16—24 часов после приготовления культуры. Суспензионные клеточные культуры проходят характерные стадии: лаг-фазу, фазу логарифмического роста, стационарную фазу и фазу логарифмического отмирания. В первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй стадии популяция клеток увеличивается (логарифмическая стадия роста), в третьей стадии увеличения количества клеток не наблюдается (стационарная фаза). Если культивирование продолжить дальше, то обнаружится период уменьшения численности клеток-фаза логарифмического отмирания (фаза разрушения). Скорость размножения клеток в логарифмической фазе роста выражают временем генерации. Под временем генерации имеется в виду период, необходимый для удвоения популяции клеток в культуре. Для суспензионного выращивания клеток важным условием является перемешивание жидкости, которое должно быть непрерывным и достаточно интенсивным, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятствовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же время не вызывать их механического повреждения [13, 15, 16, 18, 25, 35, 36, 38, 72, 73, 76, 77, 84, 100, 101]. Таким образом, размножение клеток в суспензии зависит от концентрации клеток в исходной суспензии, аэрации и рН среды, состава питательной среды, способа перемешивания, объема суспензии и других факторов.
Суспензионные культуры широко используется в вирусологических исследованиях для накопления больших количеств вируссодержащего материала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов.[9, 11, 103, 104, 106, 146, 147, 148, 149, 170, 172]
Культивирование клеток на микроносителях. В 1967 г. VanWerel предложил метод культивирования, сочетающий элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроносителей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160—230 мм может поместиться 350—630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их составит от нескольких до 50 см2/мл [159, 160, 170, 172, 182]. Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к поверхности частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каждой отдельной частице.
Создание криобанка штаммов линий клеток
Имеются многочисленные публикации о составе и качестве питательных сред для культивирования клеток ВНК-21/13 в монослойной и суспензионной культуре. Первоначально технология глубинного культивирования клеток ВНК-21 разработана на основе использования модифицированной среды Игла, в которой аминокислоты и витамины взяты в удвоенном количестве. Содержание глюкозы составило 0,45%, а в качестве суплементов используются 0,2% триптозофосфатный бульон и 10% сыворотка. Для изготовления среды использованы высокоочищенные препараты аминокислот фирмы Дифко и других зарубежных фирм. При разработке прописей питательных сред для безопорного культивирования клеток необходимо учитывать потребности клеток в незаменимых и заменимых аминокислотах, витаминах и обеспечить достаточную буферную ёмкость среды не нарушая осмомолярности и не способствуя конгломерированию клеточной суспензии. Истощение того или иного компонента в среде всегда сопровождается снижением скорости роста и в дальнейшем гибелью клеток.
Использование сред с точным химическим составом, таких как MEM, ДМЕМ,199 или основная базальная среда Игла, не обеспечивает клеточную пролиферацию при культивировании в суспензии и приводит к быстрой в течении 24 часов гибели клеток.
Включение в состав питательной среды для суспензионного культивирования белковых гидролизатов (ГЛА, ФГМС, ГБКС), в концентрации не токсичной для клеток, способствует росту клеток и значительно повышает индекс клеточной пролиферации.
Потребность страны в крупномасштабном производстве культуральной противоящурной вакцины на производственных мощностях ФКП «Щелковский биокомбинат» вызвало необходимость в разработке технологии приготовления питательной среды для промышленного культивирования клеток ВНК-21/13. Учитывая тот факт, что использование в составе среды гидролизатов значительно повышает выход клеточной биомассы, а так же с целью удешевления питательной среды в её состав вместо отдельных аминокислот было решено включить ФМГС (ферментативный мышечный гидролизат) собственного производства, расщепленный гидролизом до полипептидов и свободных аминокислот. Учитывая жесткие условия культивирования в ферментерах, которыми оснащена производственная база биокомбината, при разработке модификации прописи среды наряду с оптимаными количествами витаминов и аминокислот, необходимо было включить вещества, способствующие повышению жизнеспособности клеток, улучшению их дыхательной функции и окислительно-восстановительного потенциала. В настоящее время для суспензионного культивирования клеток используют несколько питательных сред: - среда Купера, - специальная среда для культивирования клеток ВНК-21, - среда Мак-Коя для суспензионного культивирования RPMI-1640. В состав перечисленных питательных сред входят: неорганические соли, аминокислоты, витамины, углеводы.
Способ получения композиции следующий: навески отдельных компонентов брали, соблюдая правила взвешивания для весов соответствующего класса. Учитывая объём приготавливаемой смеси допускается взвешивание солей, гидролизатов, глюкозы на весах 3-го класса; навески отдельных аминокислот, витаминов и антибиотиков - на аналитических весах 2-го класса с соблюдением точности до второго знака после запятой.
Процесс приготовления питательной среды заключается в приготовлении солевой основы среды, которой является раствор Хенкса, и растворении в нём антибиотиков, солей, глюкозы, гидролизата мышечных белков, и гидролизата лактальбумина по 1,25 г/л с конечной концентрацией суммы гидролизатов в питательной среде 2,5 г/л пяти аминокислот, сыворотки, витаминов, бикарбоната натрия.
Растворение компонентов питательной среды вели в деминирализованной воде, имеющей температуру 35-40С, при непрерывном перемешивании. В начале растворяли антибиотики и навески солей поочерёдно NaCl, КС1, MgS04 х7Н 20, Na2 HP04 х12Н 20 (развести в горячей воде), КН 2Р04 до полного растворения предыдущей навески, затем вносили навеску глюкозы 3,6 г/л среды. Дополнительно к механическому перемешиванию, осуществляли перемешивание сжатым воздухом т.е. барботированием в течение 10 минут. После растворения навесок, убирали барботирование. В глюкозо-солевой раствор осторожно, тонкой струйкой при механическом перемешивании вносили хлористый кальций (СаСl2) в виде 40%-ного раствора и вновь барботировали. Для внесения гидролизата мышечных белков и гидролизата лактальбумина готовили их 10%-ный раствор и вносили его в полученный глюкозо-солевой раствор, и растворяли в течении 10 минут перемешиванием и барботированием.
Отдельно растворяли аминокислоты. Растворение навесок проводили последовательно согласно прописи питательной среды в таблице 1. L-цистин и 1-тирозин растворяли отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании до кипения с добавлением по каплям концентрированной соляной кислоты до полного просветления раствора. Сначала растворяли 1- цистин, затем 1-тирозин. В случае помутнения раствора при внесении 1-тирозина раствор помутнел, необходимо вновь вносить по каплям концентрированную НС1, до полного растворения навески. Вместо 1-цистина можно использовать 1-цистин НС1 и растворять 1-цистин НС1 просто в кипящей воде.
Технология производства банка культур клеток для промышленного изготовления вакцин против ящура и бешенства
Культиватор тщательно мыли, проверяли его на герметичность путем подачи в него воздуха до 0,7 атм. Если за 30 минут давление в реакторе упадет не более, чем на 0,1 кг/см , то такой реактор считают герметичным. В случае большой утечки воздуха находили место разгерметизации с помощью мыльного раствора и устраняли неисправности. Загрузка 200 л. реактора и культивирование клеток. В реактор с питательной средой (80 л), нагретой до 37 С, перекачивали 30 литров суспензии клеток из КС-40. Культивирование осуществляли в течение 48 ч., при скорости перемешивания культуры 25-30 об/мин.
Аэрацию осуществляли воздухом, подачу которого начинали через 2 часа после начала культивирования. В первые сутки воздух подавали из расчета 1,5 объема на один объем суспензии клеток, вторые сутки - 2 объема воздуха на объем клеток в час.
Через 20-48 часа культивирования осуществляли коррекцию рН 7,5 %-ным раствором бикарбоната натрия. Одновременно осуществляли контроль стерильности культуры, определяли концентрацию и жизнеспособность клеток.
Выращивание клеток ВНК-21/13-02 в 600 л реакторе. В реактор объемом 600 литров фильтровали питательную среду, включали перемешивающее устройство, систему термостатирования. При достижении температуры питательной среды 37 С в реактор перекачивали суспензию клеток из 200 литрового реактора. По истечении 2 ч после посева клеток отбирали пробу для измерения рН, концентрации клеток, контроля стерильности и подавали через барбатер воздух для аэрации культуры. Через 20 и 48 ч культивирования осуществляли коррекцию рН 7,5 %-ным раствором бикарбината натрия. Процесс выращивания клеток вели в течение 48 ч при непрерывном перемешивании со скоростью 35 об/мин., подсчет клеток проводили при взятии пробы для корректировки рН. В процессе выращивания возможны поломки в системах перемешивания, термостатирования и аэрации культуры. Неисправности устраняли без разгерметизации реактора. После устранения неисправностей процесс выращивания продолжали, если доля жизнеспособных клеток составляет не менее 90 %. По окончании цикла выращивания суспензию клеток передали на заражение вирусом, если концентрация не ниже 1,6 млн/мл.,жизнеспособных клеток не менее 90 %, отсутствует грибково-бактериальная микрофлора. Вытяжка с вертикальным ламинарным потоком
Аппаратурное обеспечение при составлении серий вакцины 2.2.3 Оптимизация условий суспензионного культивирования культуры клеток ВНК-21/13-13 в масштабах биотехнологического производства Питательные среды усовершенствованной рецептуры использовали для культивирования вируса бешенства штамма «Щелково-51», урожай клеток доводили до 2,8х106 кл/мл (2,8 млн. кл/мл), т.е. индекс пролиферации составлял 5,0, так же доводили урожай клеток до 3,2х106 кл/мл (3,2 млн. кл/мл), т.е. индекс пролиферации составлял более 6,0. При культивировании вируса бешенства штамм «Щелково-51» из полученной вирусной суспензии были расфасованы от 2-х до 4-х серии вакцины «Рабиков» с общим объемом 601,8 тыс.доз. Индекс иммуногенной активности этих серий составил 1,08-1,24 в соответствии с требованиями НТД на препарат. На рисунке 6 показана аппаратная схема культивирования клеток ВНК-21/13-13 с использованием культуральной суспензии с последующим получением вирусной суспензии. На рисунке 7 показана схема изготовления антирабической вакцины с использованием культуральной суспензии при выращивании производственного штамма «Щелково-51».
На рисунке 8 показана схема составления серий вакцин. Таблица 13 - Показатели производственных серий сред для суспензионного культивирования клеток ВНК-21/13- N серии Вода с установки super-Q До фильтрации После фильтрации Объем 12 + pH = 7,48t = 0,60Б = 3,7мл 0,1нНСЬна 100мл среды рН=7,48 1262,4л 29 + рН = 7,22t = 0,61Б = 3,8мл 0,1нНСЬна 100мл среды рН=7,24 1262,4л 13 + рН = 7,46t = 0,60Б = 2,95 мл 0,1нНСЬна 100мл среды рН=7,48 1262,4л 32 + рН = 7Д4t = 0,61Б = 4,0 мл 0,1нНСЬна 100мл среды рН=7,24 1262,4л 35 + рН = 7Д6t = 0,61Б = 4,1 мл 0,1нНСЬна 100мл среды рН=7,24 1262,4л В таблице 13 представлены показатели производственных серий сред для суспензионного культивирования клеток ВНК-21/13-13, выборочные данные серий показывают стабильность промышленного производства питательных сред, где воду для производства использовали с установки superQ, до фильтрации pH среды выдерживали в диапазоне показателей от 7,16 до 7,48; t – показатель криоскопии – концентрация растворов солей, определили на приборе при точке замерзания от 0,60 до 0,61; Б – буферная емкость раствора, оттитровывали 0,1н раствором HCl, показатель соответствовал от 2,95 до 4,1; pH после фильтрации выдерживали в диапазоне 7,24-7,48; объем каждой серии соответствовал 1262,4л – (одна тысяча двести шестьдесят два литра). При фильтрации использовали фильтры «Millistak» – глубинная фильтрация через пластины с размером пор 0,8-0,45, предфильтрацию проводили фильтрами патронного типа с размером пор – 0,5 фильтры «Полисепт», стерилизацию проводили так же фильтрами патронного типа «Durapore» с размером пор – 0,22.
После получения производственных серий среды для суспензионного культивирования клеток ВНК-21/13-13 предварительно исследовав на стерильность, выращивали клетки в питательной среде суспензионным методом, рост клеток доводили до 2,5х106 кл/мл (2,5 млн. кл/мл), т.е. индекс пролиферации = 5,0, также доводили рост клеток до 3,0х106 кл/мл (3 млн. кл/мл), т.е. индекс пролиферации составлял 6,0.
Показатели роста клеток позволили нам провести культивирования шт. Азия-Шамир для получения моновалентных серий против ящура животных.
При этом получен вирус с накоплением по 146S компоненту в диапазонах от 1,48 мкг/мл – 1,54 мкг/мл; средние титры антител по шт. Азия-Шамир составили: серии 5501-1,9lg; 5502-1,5lg; 5503-1,86lg; 5504-1,84lg; 5505-1,76 lg, полученные вакцины стерильны, авирулентны, безвредны, объем каждой серии составлял 11,286 млн. доз.