Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
2.2 Аппаратурное оформление процессов очистки отходящих газов в биотехнологических процессах 11
2.2.5 Методические приемы и технические средства
обеззараживания микроорганизмов в биоаэрозолях 11
1.1.2 Фильтры тонкой очистки биоаэрозолей 28
1.1.3 Способы контроля защитной эффективности фильтра тонкой очистки
1.1.3.1 Биологические способы контроля защитной эффективности фильтров тонкой очистки 31
1.1.3.2 Физико-химические способы контроля защитной эффективности фильтров тонкой очистки 35
1.2 Применение фильтрационных технологий в производстве иммунобиологических препаратов 41
1.2.1 Стерилизующая фильтрация при изготовлении иммунобиологических препаратов 41
1.2.2 Использование фильтрации для концентрирования и очистки при изготовлении иммунобиологических препаратов .. 44
1.3 Заключение по обзору литературы 49
2 Экспериментальная часть 51
2.1 Материалы и методы исследований 51
2.1.1 Материалы 51
2.1.2 Методы исследований
2.1.2.1 Биологические методы 52
2.1.2.2 Физико-химические, физические и биохимические методы 54
2.1.2.3 Статистическая обработка результатов 56
2.2 Результаты исследований и их обсуждение 57
2.2.1 Разработка системы очистки отходящих газов биореактора от биологического аэрозоля 57
2.2.1.1 Обоснование технических требований к системе очистки.. 57
2.2.1.2 Конструкционные особенности системы очистки 62
2.2.1.3 Применение физических методов для проверки эффективности работы системы очистки 66
2.2.1.4 Апробация системы очистки в процессе культивирования производственных штаммов Vibrio cholerae
2.2.2 Разработка оптимальной технологии обессоливания нативных протективных антигенов холерного вибриона 76
2.2.3 Совершенствование технологии стерилизующей фильтрации холерогена-анатоксина 84
2.2.3.1 Определение эффективности работы мембран и
процесса стерилизующей фильтрации холерогена-анатоксина 84
2.2.3.2 Интенсификация процесса стерилизующей фильтрации холерогена-анатоксина 91
2.2.4 Экспериментальное обоснование выделения холерогена-анатоксина Vibrio cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации 94
2.2.5 Эффективность усовершенствованной технологии 114
Заключение 117
Выводы 124
Список сокращений и условных обозначений 126
Список литературы
- Способы контроля защитной эффективности фильтра тонкой очистки
- Использование фильтрации для концентрирования и очистки при изготовлении иммунобиологических препаратов
- Физико-химические, физические и биохимические методы
- Разработка оптимальной технологии обессоливания нативных протективных антигенов холерного вибриона
Введение к работе
Актуальность темы. Продолжающиеся в 21 веке эпидемии и крупные вспышки холеры в мире, вероятность реальной угрозы ее завоза на территорию России определяют неблагополучный прогноз по этой инфекции (Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., 2006; Онищенко Г.Г. и др., 2005).
В России для специфической профилактики холеры используется холерная химическая вакцина, производимая институтом «Микроб». Основными компонентами препарата, выпускаемого в виде таблетки, являются детоксицированные токсин и О-антиген, продуцируемые штаммом Vibrio cholerae 569В классического биовара серовара Инаба и О-антиген, продуцируемый штаммом V. cholerae М-41 классического биовара серовара Огава.
В производстве вакцины, на стадии культивирования V. cholerae для получения антигенов, используютcя вирулентные штаммы, что повышает требования к обеспечению биологической безопасности технологических процессов. Ранее для очистки отходящих газов биореактора от биологического аэрозоля использовалась система, основанная на пропускании газов через лизол, который на данный момент не выпускается и его использование запрещено Всемирной организацией здравоохранения. Кроме того, определить эффективность ее работы инструментальными методами не представляется возможным.
По действующей технологии обессоливание протективных антигенов – компонентов холерной химической вакцины с целью освобождения от сульфата аммония осуществляют в диализных мешках из целлофана против водопроводной воды, что обуславливает вероятность попадания в диализуемые продукты нежелательных примесей, находящихся в воде.
В настоящее время основным промышленным методом, используемым для стерилизации белковых компонентов иммунобиологических препаратов, в том числе холерогена-анатоксина, является мембранный метод микрофильтрации. Существующие технологические приемы его стерилизации характеризуются затратностью и потерями препарата. Одним из возможных путей снижения потерь холерогена-анатоксина на стадии стерилизации является уменьшение количества циклов стерилизующей фильтрации.
Недостатком существующей технологии производства отечественной холерной химической вакцины можно отнести многоступенчатый и затратный этап выделения холерогена-анатоксина, который включает следующие технологические стадии: концентрирование нативных холерогена-анатоксина и О-антигена; осаждение О-антигенсодержащей фракции сульфатом аммония; отделение О-антигенсодержащей фракции центрифугированием; осаждение холерогена-анатоксина сульфатом аммония; отделение холерогена-анатоксина центрифугированием; обессоливание и сепарирование. Следует отметить, что другой значительной проблемой такого способа получения холерогена-анатоксина является необходимость очистки промышленных стоков от ионов аммония и сульфат-ионов.
Степень разработанности темы. При работе с микроорганизмами, для обеззараживания биоаэрозоля в воздухе, отводимом, от биореактора применяют различные технические устройства, в том числе фильтры тонкой очистки (Дроздов С.Г. и др., 1987; Валашек Е.Р.,1988; Григорьев В.В., 1995; Фролов А.И. и др., 1999; Басманов П.И. и др., 2003; Владимцева И.В. и др., 2007; МУ 1.3.2411-08, 2008; Самыгин В.М. и др., 2009; Копылов Г.А., Ковалв В.Д., 2011; Chisti Y., 1998). Оценку защитной эффективности систем очистки и фильтров производят биологическими, физическими и физико-химическими методами (Криницын Л.А. и др., 1999; Басманов П.И. и др., 2003; Чупалов B.C., 2007; Алексеев С.М. и др., 2008; ГОСТ Р ИСО 14644-3-2007, 2008; СП 1.3.2322-08, 2009; МУ 1.3.2411-08, 2008; Смирнов Г.Г. и др., 2011; СП 1.3.1285-13, 2013; Ененко А.А., 2014; Костюкова Т.А. и др., 2014; Кравченко О.В. и др., 2014; Kousaka Y. et al., 1990; Kastelein J. et al.,
1992; Benezech T., 2001; George E.R.L., 1995). Многообразие технических решений и методов контроля диктует необходимость их критического анализа и, основываясь на его результатах, проведения исследований по созданию надежной и высокоэффективной системы очистки отходящих газов биореактора от биологического аэрозоля и разработки методики проверки эффективности ее работы.
Оптимизировать технологию антигенных компонентов вакцины возможно ультрафильтрацией (Нижегородцев С.А., 2003; Попова В.М. и др., 2009, 2010; Djuro J., 1998).
Повысить эффективность процесса стерилизующей фильтрации холерогена-анатоксина возможно увеличением пропускной способности стерилизующих мембран за счет увеличения температуры фильтруемого раствора, его предварительной очистки от крупнодисперсных частиц и применением других технологических приемов (Черкасов А.Н., Пасечник В.А., 1991; Комиссаров А.В. и др., 2002; Попова В.М., 2011; Никифоров А.К., 2014).
Устранить недостатки технологии выделения холерогена-анатоксина возможно фракционированием выделяемого продукта с использованием методов микро- и ультрафильтрации (Ше-вырев Н.С. и др., 1995; Попова В.М., 2011; Лебедев Н.В., 2013; Матвеева Ж.В., 2013).
Цель и задачи исследования. Цель работы совершенствование процесса очистки отходящих газов биореактора от биологического аэрозоля и фильтрационных технологий в производстве холерной химической вакцины.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
разработать систему очистки отходящих газов биореактора от биологического аэрозоля и провести ее апробацию в технологическом процессе производства холерной химической вакцины;
оценить возможность использования физического метода определения защитной эффективности системы очистки отходящих газов от биореактора, и отдельно фильтров;
усовершенствовать технологию обессоливания О-антигена штамма V. cholerae М-41 серо-вара Огава, а также О-антигена и холерогена-анатоксина штамма V. cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации;
провести исследования по выбору оптимального типа стерилизующего оборудования, и экспериментально обосновать технологические параметры процесса, направленные на снижение потерь холерогена-анатоксина;
обосновать и разработать технологию выделения холерогена-анатоксина штамма V. chol-erae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации;
оценить эффективность разработанных технологических приемов.
Научная новизна. Создана оригинальная конструкция системы очистки отходящих от биоректора газов, обеспечивающая биологическую безопасность технологического процесса производства холерной химической вакцины.
Использование физического метода определения защитной эффективности системы очистки отходящих газов от биореактора, и отдельно фильтров, с использованием аэрозоля диэтилгек-силсебационата, позволяет сократить процедуру проверки с 2-3 дней до 1-2 часов.
Научно обоснована и экспериментально подтверждена технология обессоливания протек-тивных антигенов штаммов V. cholerae 569В серовара Инаба и М-41 серовара Огава диафильтра-цией в периодическом режиме с использованием метода тангенциальной ультрафильтрации.
Определена оптимальная температура проведения процесса стерилизующей фильтрации холерогена-анатоксина и обоснован технологический прием его очистки перед проведением данного процесса, заключающийся в осветлении белкового раствора путем тангенциальной фильтрации с использованием мембранного модуля с размером пор 0,45 мкм.
Разработана технология выделения холерогена-анатоксина штамма V. cholerae 569В серо-вара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации, приоритетность которой подтверждена патентом РФ на изобретение № 2535122.
Практическая значимость. Разработанная система очистки отходящих газов биореактора от биологического аэрозоля успешно используется в технологическом процессе производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной.
С учетом конструкционных особенностей системы очистки и технологии культивирования штаммов-продуцентов основных протективных антигенов холерного вибриона разработаны инструкция по эксплуатации системы очистки отходящих газов биореактора и стандартные операционные процедуры проверки ее эффективности. Создан стенд, позволяющий проводить оценку защитной эффективности фильтров тонкой очистки до их установки на место эксплуатации.
На основании предложенных автором технологических решений и методических приемов усовершенствована технология производства химической холерной вакцины, обеспечивающая воспроизводство технологического процесса с повышенным выходом целевого продукта в сжатые сроки и с качеством препарата, соответствующим требованиям нормативной документации.
Разработаны методические рекомендации «Фракционирование холерогена-анатоксина холерного вибриона методом тангенциальной ультрафильтрации», одобренные Учным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 3 от 20 мая 2014 г.) и утвержднные директором института 21 мая 2014 г.
Методология и методы исследования. Методологической основой данного исследования являлись работы российских и иностранных авторов, нормативно-технической документации по вопросам аппаратурного оформления систем очистки от микроорганизмов технологического воздуха, методам проверки фильтров на защитную эффективность, а также технологическим аспектам применения фильтрационных методов для выделения, очистки и стерилизации биологических препаратов. В ходе исследования, кроме общенаучных (анализ данных литературы, эксперимент, измерение), использованы биотехнологические, биологические, физико-химические, физические, биохимические и статистические методы.
Положения, выносимые на защиту.
-
Разработанная система очистки отходящих газов биореактора от биологического аэрозоля обеспечивает биологическую безопасность при проведении процесса культивирования вирулентных штаммов V. cholerae.
-
Обоснованная опытным путем технология обессоливания антигенных компонентов холерной химической вакцины позволяет снизить время проведения процесса с 3-4 сут до 5-6 ч и проводить его в контролируемых условиях.
-
Проведение процесса стерилизующей фильтрации холерогена-анатоксина при температуре (37+1) оС позволяет увеличить пропускную способность мембранных микрофильтрационных устройств на 60%.
-
Технология выделения холерогена-анатоксина штамма V. cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации позволяет уменьшить количество стадий технологического процесса с 7 до 6, сократить время выделения холерогена-анатоксина из культуральной жидкости и всего технологического цикла в целом по сравнению с существующим способом на 100 часов, и уменьшить потери препарата на 25 %.
Степень достоверности результатов обосновывается проведением работы на сертифицированном оборудовании, проведением измерений на метрологически поверенных средствах и согласованностью полученных данных с теоретическими положениям. Статистическую обработку
данных экспериментов проводили в программе Microsoft Excel 2007, исключая грубые погрешности и вычисляя среднее значение полученных данных.
Апробация результатов. Результаты экспериментов докладывались на ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2013, 2014) и были представлены на конференциях: XXII заочной научной конференции Research Journal of International Studies (Екатеринбург, 2013); «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2014); «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (Нижний Новгород, 2014).
Личный вклад соискателя. Автор участвовал в обсуждении основной цели работы, поиске наиболее действенных путей для реализации сформулированных задач, а также в планировании, реализации экспериментов и интерпретации данных. Отдельные опыты проведены с участием к.б.н. Васиным Ю.Г., к.б.н. Ливановой Л.Ф., к.м.н. Беляковой Н.И., к.т.н. Морозовым К.М.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательских тем № 48-2-14 «Разработка и внедрение в производство МИБП новых решений, направленных на повышение качества препаратов и эффективности технологических процессов» (номер госрегистрации: 01201457722) и «Разработка современных безопасных химических вакцин против холеры и создание универсальной технологии их производства», выполненной согласно распоряжению Правительства Российской Федерации № 1426-р от 02.10.2009 г. о выделении финансовых средств на проведение научно-исследовательских работ, направленных на разработку новых средств диагностики и профилактики тропических болезней.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент РФ на изобретение № 2535122.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, основной части, включающей в себя обзор литературы, собственные исследования, состоящие из материалов и методов исследований и их результатов, а также заключения, выводов, списка литературы из 172 наименований и приложений. Работа изложена на 164 страницах и иллюстрирована 19 рисунками, 23 таблицами.
Способы контроля защитной эффективности фильтра тонкой очистки
Анализ научных работ и патентно-технической информации показал, что для решения задачи очистки отходящих газов биореактора от биологического аэрозоля применяются различные методические приемы и технические средства.
В методических указаниях МУ 1.3.2411-08 [21] описана конструкция системы отходящего из биореактора газов установок с рабочим объемом культу-рального сосуда 400 мл для глубинного аппаратного культивирования микроорганизмов I-II групп патогенности. С целью защиты окружающей среды от выбросов бактериальных аэрозолей и обеспечения условий биологической безопасности для персонала лаборатории установка по глубинному культивированию оборудована двухуровневой системой очистки воздуха. Первый уровень включает два последовательно соединенных скруббера, выполненных в виде закрытых емкостей, содержащих дезинфицирующие растворы. В качестве дезинфицирующего средства используют формальдегид в виде 2,5% раствора, через который барботируют воздух, необходимый для аэрации жидкой питательной среды при выращивании бактерий. Второй уровень защиты представлен выходным фильтром тонкой очистки из ткани Петрянова. При этом культу-ральный сосуд и система очистки отработанного воздуха должны быть размещены в боксе биологической безопасности. Для предотвращения избыточного пенообразования предлагается использовать химические пеногасители.
В конструкции малой ферментационной установки [63] описана система очистки отходящих газов, представляющая собой рубашку-конденсатосборник и фильтр, обеспечивающие подсушку и стерилизацию выходящих газов соответственно. Недостатком этой системы является возможность «замокания» фильтра при отключении подачи пара, подаваемого на рубашку-конденсатосборник и, соответственно, возможности выхода аэрозоля культивируемых микроорганизмов в окружающую среду. Сходная система очистки отводящих газов в ферментационной установке для культивирования микроорганизмов [74, 126, 127] содержит конденсатосборник, группу теплообменников, каскад фильтров тонкой очистки и вакуумный насос. Недостатком данной системы является использование группы теплообменников, служащих для охлаждения и подогрева газов, выходящих из ферментационной установки. Подогрев осуществляется паром, а охлаждение холодной водой. Недостатком этих систем является возможность «замокания» фильтра при отключении подачи теплоносителей (пара и холодной воды) и, соответственно, возможности выхода аэрозоля культивируемых микроорганизмов в окружающую среду.
Описанная в литературе [64, 108-110] установка для культивирования микроорганизмов снабжена системой очистки отработанного воздуха, состоящей из емкостей с дезинфицирующими растворами. При культивировании патогенных микроорганизмов установку снабжают боксом безопасности. Недостатком системы очистки отходящих газов является применение емкостей с дезинфицирующими растворами, так как при попадании в них микроорганизмов меняется концентрация дезинфектанта и возникает возможность неполной дезинфекции микроорганизмов и соответственной выхода их в окружающую среду. Кроме того, использование бокса безопасности при культивировании патогенных микроорганизмов усложняет конструкцию и она вряд ли применима для промышленных целей. Известны случаи, когда в конструкции аппаратов для культивирования микроорганизмов не предусмотрены (или не описаны) системы обеззараживания отходящих газов. Например, в патенте РФ № 2021349 описана конструкция установки для культивирования биологических объектов (микроорганизмов, тканей и клеток растительного и животного происхождения, грибов и т.д.), в которой «сброс отработанного воздуха осуществляется через штуцер» [75]. Известна установка для промышленного культивирования биологических микрообъектов, тканей и клеток растительного и животного происхождения, в которой «установлен штуцер для сброса отработанного воздуха, снабженный запирающим клапаном, который срабатывает при повышении давления в полости емкости выше заданного» [76]. В Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» сконструирован аппарат для суспензионного культивирования клеток тканей или микроорганизмов, «содержащий цилиндрическую емкость с крышкой и патрубками соответственно для подачи аэрирующего газа и отвода газообразной среды» [77]. В конструкции аппарата для культивирования микроорганизмов в суспензиях система отвода газов, образующихся при культивировании бактерий, вообще не приведена [78].
Имеются сведения об установке для культивирования клеток или микроорганизмов, преимущественно в условиях космического полета при малых значениях гравитации и нагрузок. Биологическая безопасность процесса обеспечивается за счет герметичного чехла из бактериального фильтра, закрепленного внутри корпуса вокруг всех узлов установки, а также адсорбера на линии выхода газа [79]. Аналогичная система биологической безопасности используется в установке для культивирования животных, растительных или микробных клеток в условиях малой гравитации или невесомости на борту космических аппаратов, состоящей из двух модулей возвращаемого и невозвращаемого на Землю [80].
Сходное техническое решение было применено Малкольмом Г.К. при разработке оболочки для выращивания биологических объектов. Автор декла 14 рировал ее для культивирования микроорганизмов, растительных и животных клеток и тканей, а также растений. Техническое решение включает в себя оболочку, выполненную из полупроницаемой и прозрачной мембраны, которая не препятствует пропусканию света и газообмену. Автор утверждал, что «оболочка не будет давать возможность бактериям, вирусам и другим микроорганизмам из окружающей среды проникать через мембрану, препятствует утечке микроорганизмов, выращенных или поддерживаемых в ней» [81].
На рисунке 1 представлена схема аппарата для суспензионного выращивания культур клеток. Аппарат работает следующим образом. Перед загрузкой аппарат подвергают стерилизации путем подачи пара в емкость 1 через патрубок 3. Выход отработанного пара осуществляют через отверстие 14 и патрубок 4. По окончании стерилизации в емкость 1 подается стерильный воздух через патрубок 3 для создания небольшого избыточного давления, которое поддерживается до момента загрузки аппарата. После охлаждения емкость 1 заполняется через патрубок 3 клеточной суспензией. Затем включают двигатель 9, который приводит во вращение мешалку 6. Перемешивание культуральной жидкости осуществляется регулируемым числом мешалки 6. Подача воздуха для аэрирования культуры клеток производится через барботирующее устройство 19, в которое газ вводится через патрубок 3. Отработанная газовая смесь поступает через зазор между стаканом 6 в отверстие 14 в верхней части трубы 11, проходит через кольцевой канал 12 и выходит через патрубок 4 и фильтр 20 в атмосферу [82].
Использование фильтрации для концентрирования и очистки при изготовлении иммунобиологических препаратов
Испытания на иммуногенность, микробиологическую чистоту, токсичность и антигенную активность осуществляли в соответствии с фармакопейной статьей предприятия [22].
При определении иммуногенности (ЕД50) в качестве биомоделей использовали белых беспородных мышей массой от 10 до 12 г. Иммунизацию мышей дозами по 0,5 мл, соответствующими 1:1000, 1:5000, 1: 25000, 1:125000 доли таблетки, по 16 животных для каждой дозы, проводили внутрибрюшинно. Заражение иммунизированных мышей осуществляли спустя 2 недели после иммунизации штаммами V. cholerae М-879 серовара Инаба и V. cholerae Р-3122 серовара Огава дозой 300 LD50. Мышей контролировали на протяжении 72 ч, учитывая количество павших.
LD50 заражающих штаммов определяли на 25 мышах для каждого штамма, используя 5 групп животных с равным количеством. Заражение проводили внутрибрюшинно, используя культуры штаммов V. cholerae М-879 серовара Инаба и V. cholerae Р-3122 серовара Огава после их роста в течение (4±1) ч на плотной питательной среде и разведенные до концентрации 6 м.к., 12 м.к., 24 м.к., 48 м.к. и 96 м.к. в 1 мл. Для контроля проводили заражение по 10 неимму-низированных мышей этими же штаммами холерного вибриона. Значения ЕД50 холерной вакцины и ЬД50 заражающих штаммов определяли согласно метода Кербера-Ашмарина [6]:
Контроль токсичности осуществляли путем подкожного введения 10 белым мышам по 0,5 мл физиологического раствора 1/160 части таблетки. Животных контролировали на протяжении 7 сут. Препарат считали нетоксичным, если животные оставались живыми, без видимых признаков заболевания и масса каждой мыши в день окончания наблюдения была не меньше исходной.
Специфическую безопасность определяли путем внутрикожного введения взрослым кроликам растворов таблеток. Три таблетки ресуспендировали в 75 мл 0,9% раствора натрия хлорида, брали 0,1 мл суспензии и добавляли 0,9% раствор натрия хлорида, получая конечные разведения 1:4000, 1:6000, 1:8000. Двум кроликам проводили внутрикожную инъекцию каждого разведения в объеме, равным 0,1 мл. Контроль осуществляли через одни сутки. Вакцина признавалась прошедшей испытания, при диаметре отечной реакции не больше (7,5±2,5) мм в разведении, не превышающем 1:6000.
Исследование антигенной активности по анатоксиносвязыванию проводили с использованием 3 таблеток. Из предварительно размельченной смеси таблеток получали пять разведений препарата (от 1000 до 3500). К 0,2 мл каждого разведения вносили 0,2 мл отраслевого стандартного образца антихолеро-генной сыворотки, с активностью равной 80 антитоксических единиц. После экспозиции растворов при (37±1) оС в течение 30 мин вносили по 0,4 мл отраслевого стандартного образца токсина холерного в каждое разведение, снова выдерживая реакционную смесь в течение 30 мин при (37±1) оС. Полученными дозами препарата (разведения от 4000 до 14000) делали внутрикожную инъекцию двум кроликам, приступая с минимального разведения. Спустя одни сутки регистрировали отечную область на коже, где отмечалась реакция от 5 до 10 мм, одинаковая с отечной областью в ряду, служащим для контроля, где одна опытная доза холерного тест-токсина была соединена с одной антитоксической единицей сыворотки антихолерогенной.
Микробиологическую чистоту вакцины определяли с использованием раствора растертых в ступке с 20 мл физиологического раствора 5 таблеток. Полученную смесь в количестве по 0,2 мл рассевали на 5 чашек Петри с мясо-пептонным агаром, содержащим (4±1) % крови; 10 чашек Петри с мясопептон-ным агаром и 1 мл засевали в 50 мл 10 % желчного бульона. Посевы выдерживали на протяжении 48 ч при (37±1) оС. Через 48 ч пробы с желчного бульона в количестве 0,2 мл рассевали на 5 чашек Петри с агаром Эндо и выдерживали на протяжении 48 ч при (37±1) оС. Наличие или отсутствие роста микроорганизмов осуществляли макроскопически.
В качестве тест-аэрозоля при проверке фильтров использовали DEHS бис-(2-этилгексиловый) эфир себациновой кислоты (диэтилгексилсебацинат). Разбавление пробы диэтилгексилсебацината осуществляли в разведении 1:100. Получение его необходимой концентрации с целью проведения измерений проводили с использованием дилютора DIL 554 (Германия, Topas GmbH). Генерирование аэрозоля, с регулировкой его объема потока для обеспечения концентрации аэрозоля (1109 частиц/м3) с частицами в размерном интервале 0,1-0,3 мкм (размер частиц с наивысшей проникающей способностью), проводили аэрозольным генератором АТМ 226 (Германия, Topas GmbH). Скорость отбора пробы диэтилгексилсебацината составляла 28,3 л/мин. Подсчет количества частиц проводился дискретным счетчиком частиц SOLAIR 3100 (США, Lighthouse). Установление содержания формальдегида, рH, наличия ионов аммония и сульфат-ионов, потери массы при высушивании (остаточной влажности) проводили согласно МУК 4.1/4.2.588-96 [54].
Физико-химические, физические и биохимические методы
Детоксицированный безмикробный центрифугат, используемый для получения холерогена-анатоксина, получают после выполнения следующих основных технологических операций: культивирование штамма V. cholerae 569В Инаба; инактивация клеток холерного вибриона формалином с конечной концентрацией (0,60±0,05)% в течение (14±2) ч; центрифугирование инактивированной культуральной жидкости с целью освобождения от клеток V. cholerae; детоксикация культуральной жидкости формалином с конечной концентрацией (0,20±0,05)% в течение (30±3) сут при температуре (10±2)С.
Полученный безмикробный центрифугат содержит протективные антигены, используемые в дальнейшем для конструирования вакцины холерной бивалентной химической таблетированной: О-антиген и холероген-анатоксин. При этом, большее количество О-антигена является «балластным», так как не используется для получения готовой лекарственной формы вакцины. Поэтому технологическая задача состоит в получении холерогена-анатоксина с наименьшим содержанием О-антигена.
О-антиген холерного вибриона представляет собой липополисахарид с молекулярной массой 800-1000 кДа [4, 5], а холероген-анатоксин – белок с молекулярной массой примерно 84 кДа [150, 154]. Достаточно большая разница в молекулярных массах этих иммуногенов позволяет, на наш взгляд, говорить о возможности выделения холероген-анатоксин фракционированием ультрафильтрацией. Нами было отдано предпочтение использованию метода тангенциальной ультрафильтрации на плоскорамных мембранных модулях, так как при прове 95 дении исследований по концентрированию О-антигена, получаемого из штамма V. cholerae М41 Огава, и холерогена-анатоксина, получаемого из штамма V. cholerae 569В Инаба, экспериментально доказана его эффективность [8, 127].
Первый этап работы был связан с оценкой возможности использования мембран с различными номинальными отсечками по молекулярной массе для выделения холерогена-анатоксина. Объемы безмикробного центрифугата составляли по 10,0 дм3. Результаты данного этапа исследований представлены в таблице 13.
Анализ данных, представленных в таблице 13, показывает, что использование мембранных модулей 50 кДа (площадь фильтрации 0,1 м2) и 100 кДа (площадь фильтрации 0,02 м2) для выделения холерогена-анатоксина нецелесообразно, так как значительная часть его остается в концентрате. При использовании мембранного модуля 300 кДа (площадь фильтрации 0,02 м2) холероген-анатоксин обнаруживается только в фильтрате, что дало нам основания использовать его для дальнейших исследований.
Определение активности антигенов при фракционировании холе-рогена-анатоксина с использованием мембранного модуля с различными номи нальными отсечками по молекулярной массе (n=3)
Примечание. Ц – центрифугат, Ф – фильтрат, К – концентрат. Было целесообразно оценить возможность интенсификации процесса фильтрации по технологическим приемам, отработанным Алешиной Ю.А. для концентрирования О-антигена штамма V. cholerae М41 Огава. В результате проведения этих исследований было показано, что максимальная производительность процесса наблюдалась при повышении температуры концентрируемого О-антигена до 37 оС и следующих барометрических параметрах: напор на входе ультрафильтрационного аппарата – 2,5 бар, давление на выходе – 0,5 бар [8]. В экспериментах применялся безмикробный центрифугат с содержанием О-антигена и холерогена-анатоксина, равными 8 и 4 (обратный титр), определенными в реакции иммунной диффузии с соответствующими специфическими сыворотками. Полученные нами результаты представлены в таблицах 14 и 15. Их анализ показывает на возможность применения обоснованных ранее Алешиной Ю.А. параметров для проведения процесса выделения холерогена-анатоксина. При этом прослеживается закономерность, заключающаяся в снижении удельной скорости фильтрации, в среднем, на 15% при одних и тех же технологических параметрах. На наш взгляд, это объясняется более высокой плотностью безмикробного центрифугата V. cholerae 569В Инаба в сравнении с V. cholerae М41 Огава.
Следующим этапом было – отработка технологии концентрирования и очистки холерогена-анатоксина методом тангенциальной ультрафильтрации после его выделения ультрафильтрацией на мембранных модулях 30 кДа. Исследовали возможность увеличения производительности процесса фильтрации по технологическим приемам, отработанным Ульяновым А.Ю. для концентрирования холерогена-анатоксина штамма V. cholerae 569В Инаба. В результате проведения этих исследований было показано, что максимальная производительность процесса наблюдалась при повышении температуры концентрируемого холерогена-анатоксина до 37 оС и следующих барометрических параметрах: напор на входе ультрафильтрационного аппарата – 2,5 бар, давления на выходе – 0,5 бар [127]. В экспериментах применялся фильтрат безмикробного центрифугата после ультрафильтрации на мембранных модулях 300 кДа с содержанием О-антигена и холерогена-анатоксина равными 0 и 4 (обратный титр), определенными в реакции иммунной диффузии с соответствующими специфическими сыворотками. Концентрирование вели до уменьшения объема перерабатываемого продукта равного 10. Полученные нами результаты представлены в таблицах 16 и 17. Их анализ показывает на возможность применения обоснованных ранее Ульяновым А.Ю. параметров для проведения процесса выделения холерогена-анатоксина. При этом прослеживается закономерность, заключающаяся в увеличении удельной скорости фильтрации, в среднем, на 25% при одних и тех же технологических параметрах. На наш взгляд, это объясняется тем, что используемый нами фильтрат безмикробного центрифугата после ультрафильтрации на мембранных модулях 300 кДа имеет более высокую степень очистки в сравнении с безмикробным центрифугатом V. cholerae 569В Инаба за счет удаления компонентов с молекулярной массой более 300 кДа. Кроме того, было выявлено, что в полученном концентрате (таблица 17) обнаруживается О-антиген, хотя его не было в продукте до проведения процесса. На наш взгляд, это объясняется маленькой чувствительность метода определения содержания О-антигена в реакции иммунной диффузии. Определение наличия О-антигена в фильтрате безмикробного центрифугата после ультрафильтрации на мембранных модулях 300 кДа с использованием иммунофер-ментного анализа подтвердило наше предположение, содержание которого составило 0,15 мг/мл.
Разработка оптимальной технологии обессоливания нативных протективных антигенов холерного вибриона
Следующим шагом исследований было определение пропускной способ ности микрофильтрационных стерилизующих устройств. Выявлено, что про пускная способность, в сравнении с используемыми при стерилизации холеро гена-анатоксина в производственном процессе, у капсулы Sartobran Р (Sartorius, Германия) меньше в 1,5 раза, однако происходит снижение потерь: в процентном соотношении в 5 раз (при стерилизации 30 дм3 используется 2 кап сулы) и абсолютной величине также до 5 раз. Капсулы BioAssure (Cuno, Фран ция) и Steripak (Millipore, США), если рассчитать удельную пропускную спо собность обладает практически одинаковыми значениями в сравнении с капсу лой Sartobran Р. Для проведения дальнейших исследований была выбрана мик рофильтрационная капсула Sartobran Р (Sartorius, Германия) с площадью филь трации 0,6 м2.
Для оценки возможности ее многократного использования оценивали способность ее регенерации 1 % водным раствором моющего средства «Р-3 ulrasil 11» его рециркуляцией через внутренний объем капсулы до восстановления паспортной производительности отведения фильтрата. Было выявлено, что проведение данного процесса в течение 120 мин приводит к очищению пор фильтрующего элемента. Также показано, что 25 дм3 воды достаточно для удаления моющего раствора. Выявлено, что капсулу Sartobran Р возможно использовать, как минимум, для 5 циклов стерилизации холерогена-анатоксина.
Для интенсификация процесса стерилизующей фильтрации холерогена-анатоксина были изучены различные температурные режимы стерилизации: (8+2) оС; (20+2) оС; (37+2) оС. Было показано, что увеличение температуры стерилизуемого белкового раствора полуфабриката препарата от (8+2) оС до (20+2) оС и (37+2) оС сопровождается повышением пропускной способности капсулы Sartobran Р соответственно до 30 % и 60 %.
С целью замены длительной процедуры (от 20 до 24 ч) двукратного сепарирования холерогена-анатоксина перед его стерилизацией был предложен технологический прием, заключающийся в осветлении белкового раствора холерогена-анатоксина путем его тангенциальной фильтрации. В экспериментах использовался мембранный модуль с размером пор 0,45 мкм. Продолжительность осветления составила от 6 до 2 ч (при обрабатываемых объемах от 30 до 10 дм3). При этом необходимо отметить, что при применении тангенциальной фильтрации содержание холерогена-анатоксина в реакции иммунной диффузии с антихолерогенной сывороткой оставалось на прежнем уровне, тогда как при двукратном сепарировании происходило его уменьшение.
Дальнейший этап работы был посвящен экспериментальному обоснованию выделения холерогена-анатоксина методом тангенциальной ультрафильтрации. Показана применимость данного метода получения препарата при выполнении ряда последовательных операций: выделение холерогена-анатоксина методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран 300 кДа; концентрирование холерогена-анатоксина методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран 30 кДа; диафильтрация холерогена-анатоксина трехкратным объемом стерильной деионизированной водой методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран 30 кДа. Выявлена преимущественность проведения данного процесса при повышении температуры холерогена-анатоксина до 37 оС и следующих барометрических параметрах: напор на входе ультрафильтрационного аппарата - 2,5 бар, давления на выходе - 0,5 бар.
Предложенный способ сократил время получения холерогена-анатоксина из культуральной жидкости и всего технологического процесса в целом на 100 ч, а также увеличил количество холерогена-анатоксина на 25 %, по сравнению с существующим способом технологии.
При анализе особенностей лиофилизированных препаратов холерогена-анатоксина, полученных по производственной и усовершенствованной технологиям получены следующие основные результаты: выявлена схожесть количественного содержания химических компонентов; изучение препаратов методом гель-хроматографии, показало, что профили элюции представляли собой белковые пики, выходящие с колонки практически с одинаковой задержкой во времени; результаты определения электрофоретической подвижности препаратов с окраской кумасси R250 показали идентичность их белковых комплексов; иммунохимическая специфичность экспериментальных и производственных препаратов холерогена-анатоксина была подтверждена в иммуноблоттинге со антихолерогенной сывороткой. Все это характеризовало стандартность препаратов холерогена-анатоксина.
По предложенным технологическим фильтрационным решениям была выпущена производственная коммерческая серия вакцины № 2, изучены ее показатели по требованиям фармакопейной статьи предприятия. Проведенные исследования позволяли говорить о полном соответствии изготовленного препарата требованиям нормативной документации.
Разработанная технология была внедрена в производственный процесс получения вакцины холерной бивалентной химической таблетированной. По нашим расчетам, годовая экономическая эффективность разработанного и внедренного в производство метода получения холерогена-анатоксина составляла 400 000 рублей (в ценах 2013 года).