Введение к работе
Актуальность темы. Проблема создания новых клеточных систем остается актуальной для исследований по молекулярной биологии клетки, молекулярной биологии гена, эмбриологии, биологии развития, вирусологии, онкологии, иммунологии, генетике развития и генетической инженерии . Методы клеточной инженерии и использование эукариотической клетки в качестве модели стали необходимыми и рутинными для исследований, связанных с идентификацией и клонированием генов, которые ответственны за важные физиодого-биохимические характеристики организма, лежащие в основе роста, продуктивности, развития, устойчивости к заболеваниям животных и созданием банков генов сельскохозяйственных животных [Щелкунов С.Н., 1986; Эрнст Л. К., 1989; Глебов O.K., 19891. Актуальным является генетическая трансформация клеток в культуре, позволяющая смоделировать системы для изучения закономерностей экспрессии чужеродных генов, механизмов злокачественной трансформации, процессов репликации и рекомбинации ДНК и получить клетки-продуценты биологически активных белков , особенно для которых важны посттранс-ляшошые модификации [Томилин Н.В., 1986; Глебов O.K., 1989; Дьяконов л.П.. 1996]. В настоящее время особое значение приобретает использование целого ряда методов клеточной инженерии в биотехнологии воспроизводства и селекции крупного рогатого скота [Сергеев Н. И., 1988; Завертяев Б.П., 1989]. В этом аспекте особенно важным является создание клеточных систем для понимания механизмов созревания, оплодотворения ооцитов и развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота in vitro . Большую ценность представляет получение животных со стабильной интеграцией и экспрессией экзогенной ДНК в геноме (трансгенные животные) [Эрнст Л.К., 1989 ; Брэм Г. и др., 1993). В этой связи большое внимание привлекает культура эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), выделенная из клеток внутренней клеточной массы эмбрионов мышей [ Martin G.R,, 1981; Evans M.J., 19813. Генетически трансформированные в культуре ЭСК остаются способными передавать свои изменения через клетки зародышевого пути химерных животных и представляют перспективный материал для геномных манипуляций у млекопитающих.
Крайне существенным является создание адекватных клеточных систем для проведения исследований по выше перечисленным направлениям.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является создание модельных систем на основе генетически трансформированных культур клеток сельскохозяйственных животных, эмбриональных стволовых КЛеТОК, ПерВИЧНЫХ ИЛПДПІГ рппрпддл^тнрнпгп тррута ЖИВОТНЫХ, И ИХ
использование для решеї ия ,зад№іУі|М'Ш'4А' биоте мологии.
им. К- к. 11$цирд
Инэ. №.А:
- 2 -Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:
оптимизировать существующие и разработать новые методы для эффективного введения молекул экзогенных ДНК-плаэмид в клетки млекопитающих, культивируемые in vttro, с учетом их морфо-физиологических особенностей;
получить стабильные генетически трансформированные клетки млекопитающих с экспрессией НП экзогенных ДНК и продукцией чужеродного белка;
исследовать возможность регуляции экспрессии трансгена в культуре генетически трансформированных клеток;
изучить возможность тестирования рекомбинантных векторов, как трансформирующего фактора в модельной клеточной системе in vttro;
показать возможность использования культуры эмбриональных стволовых клеток мыши , как перспективного материала для получения химерных животных и генетических манипуляций с ними;
подобрать оптимальные условия для выделения, идентификации и поддержания в культуре эмбриональных стволовых клеток кролика;
создать на основе первичных клеток, выделенных из репродуктивного тракта животных, клеточные системы для изучения и понимания механизмов созревания и экстрапорального оплодотворения ооцитов коров.
Научная новизна. Впервые проведен анализ компетентности мутантних клеток сельскохозяйственных животных (СПЭВ ТК" и ТР ГФРГ) к поглощению и экспрессии молекул экзогенных ДНК. Выделены наиболее компетентные клоны клеток к поглощению и экспрессии трансфецируемых ДНК плазмид pFF и pSV2gpt. содержащих ген tJc ВПГ-І и ген gpt .colt., соответственно. Показано, что дефектные по ТК клетки свиньи СПЭВ ТКГ можно использовать для введения и экспрессии экзогенных ДНК с достаточно высокой частотой трансформации (2-6 10"3).
Анализ эффективности промоторов гена mt-i мыши и LTR вируса саркомы Рауса продемонстрировал, что эти промоторы обеспечивают конститутивную и индуцибельную экспрессию гена поверхностного антигена вируса гепатита Б человека в генетически трансформированных клетках СПЭВ ТК*. и продукция оболочечного белка-HBsAg достигает 5.12 мкг/106 клет. сут..
Впервые продемонстрировано, что сконструированный рекомбинант-ный ген , представляющий собой двухдоменную последовательность, 5'-конец которого кодирует часть структурного гена VP1 вируса гепатита А человека , а 3/-конец - полный ген поверхностного антигена вируса гепатита Б человека (S), поставленный под контроль промотора LTR ВСР, экспрессируется в клетках линии СПЭВ ТК" в виде секретируе-
- з -мой надмолекулярной структуры со свойствами 20 нм частиц HBsAg.
Впервые проведено сравнительное изучение экспрессии гена S ВГБ в двух экспериментальных системах: в искусственной (генетически трансформированные клетки СПЭВ ТК+) и естественной ( клетки гепато-карциномы человека PLC/PRF-5). Показано, что по числу клеток, синтезирующих HBsAg, а также по активности секретируемого HBsAg, клетки трансформированных клонов превосходят клетки гепатокарцинощ .
Впервые изучена роль дифференцировки гепатоцитов в регуляции экспрессии генов ВГБ, Установлено, что в клетках части клонов, характеризующихся более высокой степенью цитодифференцировки ( по скорости и характеру роста, экспрессии альфа-фетопротеина и способности к образованию опухолей у бестимусных мышей) усиливается экспрессия гена поверхностного антигена (S) и индуцируется экспрессия гена коревого антигена (С) ВГБ,
с целью испытания рекомбинантных конструкций в культуре клеток был предложен новый, более простой и эффективный (превосходящий в системе временной экспрессии трансгена кальций-фосфатный способ в среднем в 30-50 раз) метод введения экзогенных ДНК-плазмид в культуру клеток СПЭВ и ТР. Научная новизна подтверждается решением о выдаче патента N93038111 от 10.03.1995 .
Показана возможность усиления экспрессии гена пео в культуре клеток сельскохозяйственных животных за счет встраивания в вектор pSV2neo фрагмента рибосомальной 28S ДНК человека ІрАВВ).
Впервые в стране предпринята попытка подобрать оптимальные условия для выделения ЭСК кролика. Охарактеризованы морфологические и ростовые особенности ЭС-подобных клеток кролика, эмбриональный фенотип которых подтвержден путем индукции к дифференцировке in vitro.
Впервые в нашей стране электропорацией введены НП экзогенных ДНК в культуру ЭСК мыши . Получены клоны ЭСК линии ДЗ с фенотипом [Neo*]. в которых выявлена экспрессия репортерного гена Е. сои.
Практическая ценность работы. Охарактеризованы мутантнае штаммы клеток сельскохозяйственных животных (СПЭВ ТК* и ТР ГФРТ") по способности поглощать и зкепрессировать экзогенную ДНК, Показана пригодность мутантных клеток для генноинженерных работ в биотехнологии.
Получена серия генетически трансформированных клеток, в которых выявлена экспрессия гена поверхностного белка ВГБ - S, продукт которого HBsAg представляет интерес для решения практических задач биотехнологии и медицины.
Показано, что генетически трансформированные клетки СПЭВ ТК~ могут использоваться в качестве удобной модельной системы для изучения закономерностей экспрессии чужеродной ДНК (динамика, индукция.
_ 4 -
активация).
Охарактеризованы клеточные мутантные клоны гепатокарциномы человека PLC/PRF-5, проявляющие различную степень дифференцировки. Результаты, выявившие связь менту степенью цитодифференцировки мутант-ных клеток PLC/PRF-5 и экспрессией генов ВГБ человека могут быть использованы в вирусологии и медицине.
Показана возможность тестирования эффективности векторов . в том числе их правильная сборка и функция регуляторних последовательностей ДНК (промоторов) . в культуре генетически трансформированных клеток сельскохозяйственных животных.
Предложен простой механический способ для введения молекул экзогенных ДНК в клетки млекопитающих в культуре, который позволяет получить большое количество клеток с временной продукцией чужеродного белка, что позволит вести обширные кинетические и биохимические исследования.
Разработаны условия для выделения ЭС-подобных клеток линий из предымплантационных эмбрионов самок кроликов , которые могут быть использованы для получения культуры ЭСК кролика.
Апробирован простой, неиньекционный способ получения химерных животных посредством агрегации ЭСК с морулами мыши.
Получены генетически маркированные по гену lacZ . colt ЭСК мыши линии ДЗ резистентные к генетицину, которые сохранили свой эмбриональный фенотип. Такие маркированные клетки могут представлять перспективный материал для исследования их судьбы в нормальном мышином эмбрионе.
Показано, что использование в качестве подложки монослоев соматических клеток, представленных клетками репродуктивного тракта животного, позволяет увеличить выход созревших и оплодотворенных m vitro ооцитов коров.
Основные положения, вьносниые на защиту:
генетически трансформированные . клетки сельскохозяйственных животных , как модельные системы для изучения закономерностей экспрессии чужеродных генов, исследования свойств клонированных генов и получения продуктов чужеродных белков;
зависимость эффективности трансформации мутантных клеток сельскохозяйственных животных (СПЭВ ТК' и ТР ГФРГ) от степени компетентности к поглощению и экспрессии трансфецируемых ДНК-плазмид;
зависимость экспрессии поверхностного (S) и корового (С) генов ВГБ от степени дифференцировки клеток гепатокарциномы человека PLC/PRF-5;
механический метод трансфекции молекул экзогенных ДНК-плазмид
в культуру клеток сельскохозяйственных животных;
использование культур эмбриональных стволовых клеток мыши в качестве перспективного материала для получения химерных животных и генетических манипуляции с ними:
влияние возраста культур бластоцист на эффективность получения ЭСК кролика.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на конференции "Современные направления создания медицинских диаг-ностикумов", г. Москва, декабрь 1990 г.; на 44-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа, п. Дубровицы, июнь 1991 г.; на втором Всесоюзном симпозиуме " Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", г. Самарканд, сентябрь 1991 г.: на научной конференции " культуры клеток животных в биотехнологии и ветеринарии", г. Москва, май 1993 г.; на VI конференции Российской федерации "Новые направления биотехнологии", г. Пущино, май 1994 г.; на Международной конференции " Молекулярные и генетические маркеры", Киев. 1994; на 11-ой международной конференции "European embryo transfer association", Hannover, September 1995 г.; на Международной конференции, посвященной памяти академика А.А.Баева "Bayev memorial conference", г. Москва, май 1996 г,; на Международной научно-практической конференции " Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства", г. Горки, июнь 1996 г., на I Международной конференции по агробиотехнологии у растений и животных, г. Киев, май 1997 г.; на Всероссийской школе-конференции молодых ученых и аспирантов вузов НИИ РАСХН по актуальным проблемам животноводства, г. Москва, ишь 1997 г..
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 научная работа: вт. ч. 1 патент на изобретение и 1 методические рекомендации, основная часть результатов получена самостоятельно, а также при участии аспиранта Айтбаева Н.Е., защитившего диссертацию под руководством автора . Вклад других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на _ стр., со
держит табл., рис., состоит из введения, глав, выводов,
практических предложений, списка литературы ( 488 названий в т. ч. 435 на иностранном языке).