Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 40
1.1. Проблема глобализации ОКИ и пищевых токсикоинфекций 40
1.2. Бактериофаги и их роль в биосфере 53
1.2.1. История открытия бактериофагов 53
1.2.2. Классификация бактериофагов 57
1.2.3. Механизм взаимодействия бактериофагов и бактерий 59
1.3. Подходы к оценке безопасности использования бактериофагов для человека и животных 62
1.4. Опыт использования бактериофагов в клинической практике 64
1.5. Перспективы профилактического применения бактериофагов 72
Результаты собственных исследований и их обсуждение 79
Глава 2. Разработка специализированного продукта диетического профилактического питания на основе бактериофагов
2.1. Отбор производственно-перспективных штаммов бактериофагов 80
2.1.1. Определение и характеристика бактерий-мишеней 80
2.1.2. Изолирование бактериофагов из окружающей среды 86
2.1.3. Фенотипическая характеристика фагов-кандидатов 88
2.1.4. Молекулярно-генетическая характеристика производственно перспективных штаммов бактериофагов 107
2.2. Разработка метода получения фаговой биомассы с высокой литической активностью и предельно низким содержанием токсинов 116
2.3. Конструирование рецептуры и технология получения готовой формы специализированного продукта диетического профилактического питания 121
2.3.1. Отработка рецептуры специализированного продукта диетического профилактического питания 121
2.3.2. Пилотная технология получения специализированного продукта диетического профилактического питания 131
2.3.3. Определение срокагодности специализированного продукта диетического профилактического питания 135
2.4. Оценка безопасности и эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания на лабораторных животных 138
2.4.1. Оценка токсического влияния 138
2.4.1.1. Острая токсичность 138
2.4.1.2. Подострая токсичность 140
2.4.1.3. Влияние продукта на нормальную микрофлору кишечника мышей 143
2.4.2. Фармакокинетические исследования 145
2.4.3 Оценка эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания 147
2.4.3.1. Сальмонеллезная модель 147
2.4.3.2. Эшерихиознаямодель 149
2.5. Оценка безопасности и эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания в ограниченных клинических испытаниях 152
2.5.1. Ограниченные клинические испытания специализированного продукта диетического профилактического питания в рамках программы медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения 152
2.5.2. Ограниченные клинические испытания специализированного продукта диетического профилактического питания при моделировании эшерихиоза у здоровых добровольцев
Глава 3. Перспективы использования бактериофагов на международной космической станции (мкс) 158
Заключение 164
Выводы 174
Практические рекомендации 175
Перспективы направления дальнейшей разработки темы 176
Список сокращений 177
Список литературы 179
- История открытия бактериофагов
- Перспективы профилактического применения бактериофагов
- Молекулярно-генетическая характеристика производственно перспективных штаммов бактериофагов
- Ограниченные клинические испытания специализированного продукта диетического профилактического питания в рамках программы медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения
История открытия бактериофагов
Прямой метод выделения бактериофагов. Исследуемую жидкость фильтровали через бактериальный фильтр (0,22 мкм, «МШіроге»). Твердый исследуемый материал (образцы почвы, пищевые и рыбные продукты, оформленные испражнения) предварительно измельчали, эмульгировали, фильтровали через бумажный фильтр, а затем через бактериальный. Наличие фага в полученном фильтрате определяли по методу Отто или Грациа (см. ниже).
Выделение бактериофагов методом обогащения «без подсева» Исследуемый материал засевали в пробирки с жидкой питательной средой, которая являлась наиболее полноценной для роста тест-культур данного вида, бактериофаги к которым мы хотели выделить. Посевы ставили в термостат при 37 С на 18-20 часов, в случае выделения листериозного бактериофага ставили в термостат при 25-26 С. По истечении указанного срока пробирки вынимали из термостата, центрифугировали, надосадок фильтровали через бактериальный фильтр (0,22 мкм). Полученные таким образом фильтраты испытывали на наличие в них бактериофагов к различным штаммам данного вида микроорганизмов по методикам, описанным ниже. Метод основан на создании благоприятных условий для размножения бактерий, которые находились в исследуемом материале и соответствующего выделяемого бактериофага. Выделение бактериофагов методом обогащения с «подсевом» Жидкий исследуемый материал непосредственно, а твердый после его подготовки (измельчение) засевали в МПБ. Одновременно с исследуемым материалом в питательную среду вносили 0,2-0,5 мл или полную бактериальную петлю суточной культуры бактерий, чувствтительных к выделяемому бактериофагу (не более 5-7 бактериальных штаммов в одну емкость). Для контроля культуру бактерий, применяемую для обогащения, засевали в стерильную питательную среду. Флаконы с посевами ставили в термостат при 37 С, а для листерий при 25-26 иС на 18-20 часов. После инкубации содержимое флаконов фильтровали через бактериальный фильтр. Полученный фильтрат исследовали на наличие бактериофага к бактериальным культурам, взятым для обогащения. Сущность данного метода заключается в предварительном обогащении исследуемого материала клетками того микроорганизма, бактериофаг к которому мы искали. Бактерии размножались в питательной среде, и вместе с ними увеличивалось количество бактериофага. Обнаружить бактериофаг в полученном фильтрате можно в жидких или на плотных питательных средах.
Обнаружение бактериофага в жидкой питательной среде:
Две пробирки с МПБ засевали одной и той же культурой микроорганизма, гомологичной искомому фагу. Одновременно в одну из пробирок вносили исследуемый фильтрат. Вторая пробирка, содержащая питательную среду и засеянная культурой микроорганизма, являлась контролем. Обе пробирки ставили в термостат при 37 С. Учитывали результаты через 4, 6, 18 и 24 часа. Учет результатов (по Уварову) следующий [68]: 1. Содержимое первой пробирки абсолютно прозрачно, а в контроле помутнение питательной среды. Полученные данные говорили о нахождении в исследуемом фильтрате бактериофага высокой активности. 2. В опытной пробирке помутнение среды менее выражено по сравнению с контрольной. Это свидетельствовало о нахождении в исследуемом фильтрате бактериофага средней активности. 3. При одинаковом помутнении в обеих пробирках для окончательного заключения о наличии или отсутствии бактериофага производили дополнительные исследования: высев на плотную питательную среду содержимого обеих пробирок. Для этого по 0,1 мл образцов капали стерильной пипеткой на чашки Петри с МПА, растирали шпателем, чтобы получить сплошной рост микроорганизмов. Чашки инкубировали в термостате при 37 С 24 часа. Посев из контрольной емкости давал сплошной рост микроорганизмов на чашке Петри. При наличии фага в исследуемом материале на фоне сплошного роста бактерий появлялись стерильные пятна - колонии бактериофага. Обнаружение бактериофага на плотной питательной среде по методу Отто [68]: 1,5 % мясопептонный агар разливали в чашки Петри. После застывания чашки с питательной средой засевали 16-18- часовой бульонной культурой, чувствительной к искомому фагу. Для этого 2-3 капли культуры наносили на чашку и растирали шпателем по всей поверхности чашки, чтобы получить равномерный сплошной рост культуры. После того, как культура впиталась, и чашки подсохли, на них каплями (spot-тест) наносили исследуемый фильтрат. После того, как жидкость впиталась в среду, чашки перевертывали вверх дном и ставили в термостат при 37 иС на 18-24 часа. После инкубации производили учет результатов: полное отсутствие культуры в месте попадания капли (пятно лизиса) говорило о том, что в исследуемом фильтрате находится бактериофаг, полностью лизирующий бактериальную культуру, появление в этом участке мелких стерильных пятен - колоний бактериофага - о не полном лизисе культуры или о том, что концентрация бактериофага в искомом фильтрате не достаточно высока
Перспективы профилактического применения бактериофагов
По данным Роспотребнадзораза2009 г. ОКИ и ПТИ суммарно составили 52 % от общего процента инфекционных заболеваний. Причинами вспышек пищевого характера являлись грубейшие нарушения технологического процесса на предприятиях, занятых в сфере производства и оборота пищевых продуктов, а также на пищеблоках при приготовлении блюд.
В современном мире при резком увеличении миграционных процессов, вызванных работой, желанием и возможностью путешествовать, а так же природными и военными катаклизмами, появился и новый полиэтиологический клинический синдром - «диарея путешественников». Этот синдром характеризуется 3-кратным или более частым появлением неоформленного стула в течение суток у людей, выезжающих за пределы своей страны или в другую климатогеографическую зону, в частности, у туристов. По данным Всемирной организации туризма поток туристов с 1950 по 2007 г. увеличился в 35 раз [10, 215]. Ежегодно посещают страны с тропическим климатом и развивающие страны более 50 млн. туристов из развитых стран [199]. Число поездок граждан России с целью туризма составляет более 9 млн. Увеличилось количество российских туристов, которые посещают страны Юго-Восточной Азии, Африки. Частота развития диареи зависит от географической зоны пребывания, длительности нахождения, условий обитания (качества воды и характера питания), а также вида деятельности. Риск возникновения диареи при поездках в Латинскую Америку, Африку, Азию составляет от 20 % до 75 %. При путешествии в Китай, Южную Африку, Израиль, Южную Европу, Россию риск развития диареи составляет от 8 % до 20 %. Низкий риск развития диареи ( 5%) зарегистрирован при поездках в США, Австралию, Японию, Канаду, страны Северной и Западной Европы, Новой Зеландии [138]. Также ежегодно регистрируется 10-20 млн. случаев диареи путешественников у 20-70 % людей, которые посещают тропические и субтропические регионы (Юго-Восточную Азию, Африку, Центральную и Южную Америку). У 46 % американцев при приезде в развивающиеся страны регистрируется диарея путешественников [173].
На первом месте среди причин плохого самочувствия в период поездок у туристов находятся поражения желудочно-кишечного тракта, связанные с диареей. Возбудителями диареи путешественников могут быть бактерии, вирусы, простейшие [133, 148, 150]. Механизм передачи фекально-оральный. Нарушения пищеварения могут быть связаны с изменением характера и качества питания, питьевого режима, режима работы и отдыха на новом месте пребывания: другой солевой состав воды, сезонная пища, непривычные виды мяса, резкая смена климата и высоты, стрессы, которые присущи переездам, покупка еды или воды у уличных торговцев. Все случаи заболевания вызваны микроорганизмами, которые попадают в организм человека с пищей и водой. Основными факторами передачи инфекции являются пищевые продукты, вода и лед, а также напитки. Наибольшую опасность представляют салаты, овощи, фрукты с поврежденной кожурой, холодные закуски, мясные продукты, недостаточно термически обработанные или сырые, сырая или плохо прожаренная рыба, морепродукты, непастеризованное молоко, мороженое, молочные продукты [10, 112].
Таким образом, острые кишечные и пищевые токсикоинфекции в конце XX -начале XXI века остаются серьезной медико-социальной проблемой человечества Основную роль в лечение ОКИ и ПТИ отводят антибиотикам. Однако применение антибактериальной терапии при купировании инфекционных заболеваний у широких слоев населения имеет ряд негативных последствий. Во-первых, антибиотики, подавляя рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, также угнетают и нормальную микрофлору человека, приводя к развитию дисбактериозов [94]. Во-вторых, на фоне приема антибиотиков развиваются аллергические реакции и иммунодефицитные состояния [25]. В-третьих, формируются устойчивые к антибиотикам штаммы возбудителей. Например, одной из таких проблем является появление антибиотикорезистентных штаммов и ассоциированных с ними «госпитальных» стафилококковых инфекций. К настоящему моменту наиболее актуальным аспектом антибиотикорезистентности стафилококков является их устойчивость к метициллину (синтетический антибиотик группы пенициллина) - так называемые метициллинрезистентные штаммы S.aureus (MRSА) . В Европе в 90-х годах XX-ого столетия из 7333 культур золотистого стафилококка, выделенных в 43 лабораториях, 936 (12,8 %) оказались метициллинрезистентными [211]. В 21 стране Латинской Америки в 2007 г. было выделено 23 338 изолятов золотистого стафилококка. Процент устойчивости к антибиотикам колебался от 27 % до 72 %. В Сальвадоре 50 % выделенных S.aureus оказались MRSA [161]. Также, в последнее время произошел рост количества штаммов с лекарственной резистентностью у сальмонелл. Все чаще появляются штаммы, устойчивые к основным антибактериальным препаратам [3, 42].
В-четвертых: при некоторых видах ОКИ (STEC- инфекции) нельзя использовать антибиотикотерапию, это может провоцировать гемолитико-уремический синдром. Гемо литико-уремический синдром - это устойчивый симптомокомплекс, включающий неимунную гемолитическую анемию, тромбоцитопению и поражение почек [196]. Пусковым фактором развития заболевания (ГУС) чаще всего служит Е. coli, продуцирующая шига-подобный токсин, а типичным проявлением является диарея, часто кровянистого характера. Ряд авторов доказывают, что применение антибиотиков на стадии гастроинтестинальной инфекции Stx-E.coli повышает риск развития развернутого ГУС [214]. Выдвинуто предположение о том, что повреждение мембраны бактерий, индуцируемое антибиотиками, может способствовать острому выделению токсина в больших количествах [17].
Молекулярно-генетическая характеристика производственно перспективных штаммов бактериофагов
В ходе подбора производственных штаммов бактериофагов важную роль играет их молекулярно-генетическая характеристика, которая включает в себя размер фагового генома, процент идентичности с таксономически наиболее близкими бактериофагами, отсутствие в составе ДНК генов, кодирующих токсины, интегразы, репрессоры транскрипции и других нежелательных генов. Изучение этих характеристик позволило говорить об оригинальности и вирулентной природе отобранных бактериофагов.
Методом ПНР со специфическими праймерами нам удалось показать, что все отобранные нами бактериофаги не несут в своем составе генов, кодирующих известные локусы патогенности некоторых штаммов-хозяинов {rfb, stxl, stx2, еае fliC, aoxin, Stx A, LLO- toxin).
Получение бактериофагов в высокой концентрации позволило соответствующим образом подготовить фаговую ДНК для проведения ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) анализа и полногеномного секвенирования.
Метод ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) позволил получить ориентировочный размер фагового генома каждого штамма бактериофага. При помощи этого метода были охарактеризованы ДНК всех бактериофагов, предварительно включенных в продукт на основании их фенотипических свойств (рисунок 11).
Для получения полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов бактериофагов использовали секвенирование второго поколения (в частности Ion Torrent) и секвенирование по методу Сэнгера (при необходимости закрытия нуклеотидных брешей). Каждый штамм бактериофага был секвенирован трижды. Данные каждого раунда секвенирования были проанализированы методами биоинформатики. Фильтрация качества прочтений (ридов) позволила собрать геномы бактериофагов с высокой достоверностью. Собранные геномы сравнивали с известными геномами известных бактериофагов. На рисунках 12-18 визуализированы эти данные.
Для того чтобы успешно решить главную задачу работы - получение специализированного продукта диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов, необходимо было разработать методику получения фаговой биомассы в высоком титре, с высокой литической активностью, не содержащей экзотоксинов и с минимальным содержанием эндотоксинов. До сегодняшнего времени в РФ бактериофаги, которые применяются в терапевтических целях, получают методом выращивания в ферментерах с жидкой питательной средой, так называемым методом глубинного культивирования. Этот способ получения бактериофагов имеет свои плюсы и недостатки, главным из которых является большое содержание токсинов в конечном продукте. Размножаясь в питательной среде, бактериальные штаммы выделяют туда свои продукты жизнедеятельности, экзотоксины, а в процессе бактериолиза туда же попадают эндотоксины грам отрицательных микроорганизмов. Традиционная очистка фаголизатов не позволяет полностью избавить продукт от присутствия в нем токсинов. Увеличенное содержание экзо-и эндотоксинов в конечном продукте приводит к нежелательным эффектам, например, они могут вызывать усиление интоксикационного синдрома, что особенно опасно у детей на фоне ОКИ бактериальной этиологии. Также присутствие остатков питательной среды влияет на органолептические свойства препаратов, чужеродные компоненты которой тоже могут вызывать аллергические реакции. Опираясь на работы коллег, проводя свои многочисленные эксперименты, мы подобрали и отработали собственные оптимальные условия для культивирования различных видов бактериофагов на плотной питательной среде, используя стеклянные колбы-матрасы (толщина питательной среды в матрасе от 10 до 25 мм, толщина слоя воздуха над поверхностью среды от 25 мм до 40 мм). Для избавления от экзотоксинов в фаголизате заменили патогенный штамм-хозяина на непатогенный без изменения спектра литической активности бактериофага. Немаловажной составляющей метода является отработанный в процессе диссертационной работы параметр множественности инфицирования (соотношения количества вирусных частиц и бактерий в посевном материала) при котором достигается максимальная урожайность бактериофага. В результате проведенной работы разработан метод выращивания различных видов бактериофагов на плотных питательных средах с высоким титром вирусных частиц и предельно низкими значениями эндотоксина (патент на изобретение №2525141). Он включает следующие этапы: 1 этап -это получение ночной (18-ти часовой) культуры штамма-хозяина. Для этого ампулу (флакон) с лиофилизированной культурой вскрывают асептически, содержимое растворяют в 2 мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия. Полученную взвесь микробных клеток наносят на чашку Петри с плотной питательной средой для получения одиночных колоний. Культивируют при 37 С сутки. На следующий день одиночные колонии секторами пересевают на чашку Петри с питательной средой. Культивируют сутки при 37 С. Бактериальные культуры 2 го пассажа, выросшие на плотной питательной среде, микробиологической петлей засевают в МПБ, разлитый по 4,5 мл из расчета одна пробирка на одну матрасную колбу. Посеянные таким образом индикаторные штаммы культивируют в термостате 18 часов при 37 С, через 18 часов экспозиции достигая 10 - 10 КОЕ/мл.
Ограниченные клинические испытания специализированного продукта диетического профилактического питания в рамках программы медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения
Специфическая эффективность специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» была изучена также в модельном эксперименте эшерихиозной инфекции. За прототип был взят эксперимент, проведенный Дроздовой в 1988 г. [49]. При моделировании кишечной инфекции у мышей в качестве микроба-заместителя был использован непатогенный штамм E.coli К12 С600. В эксперименте использовали 40 белых мышей весом 16-18 г, по 20 в контрольной и опытной группе. Экспериментальную инфекцию вызывали путем перорального ежедневного введения 0,5 мл E.coli К12 С600 в титре 5x10 КОЕ/мл натощак в течение 3-х дней. Опытная группа подвергалась такому же заражению на фоне профилактического приема специализированного продукта «Фудфаг» в дозе 0,5 мл на прием до, вовремя и спустя сутки после периода инфицирования. Животные в контрольной группе вместо специализированного продукта получали физиологический раствор. В опыт отбирали животных, не имеющих по данным бактериологического посева в исходном анализе кала лактозонегативных штаммов Е. coli (табл.45).
Схема изучения специфической эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» в модельном эксперименте эшерихиоза у мышей.
В ходе проведенного эксперимента (таблица 45) установлено: на 6-е сутки в фекалиях животных контрольной группы обнаружены лактозонегативная Е. coli в количестве ЗхЮ ±1,9 КОЕ/г и Е. coli с нормальными ферментативными свойствами в количестве 5x10 ±4,5 КОЕ/г (при р 0,05), в то время как в фекалиях мышей опытной группы идентифицировали исключительно Е. coli с нормальными ферментативными свойствами в количестве 4,3 х 10 ±6,5 КОЕ/г (при р 0,05). Необходимо отметить, что в пробах кала, полученных на 6-ые сутки эксперимента от мышей из опытной группы, бактериофаги присутствовали в 100 % случаев. Через 48 часов после окончания приема «Фудфага» эшерихиозный бактериофаг обнаруживали лишь в 20 % образцов. На рисунке 22 представлены фотографии с чашками Петри, засеянными штаммом E.coli К12 С600, на который каплями нанесены супернатанты фекалий мышей, демонстрирующие наличие эшерихиозного бактериофага через 24 часа (А) и 48 часов (В) после окончания эксперимента.
С целью повышения достоверности проведенного эксперимента данные микробиологического исследования подтверждали молекулярно-генетическим методом. До заражения животных штамм Е. coli К12 С600 отсутствовал во всех образцах фекалий. На 6-ые сутки эксперимента Е. coli К12 С600 присутствовал у мышей контрольной группы вплоть до 3-го разведения фекалий и не был обнаружен в образцах животных из опытной группы (рисунок 23).
.Оценка безопасности и эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» в ограниченных клинических испытаниях 2.5.1 Ограниченные клинические испытания специализированного продукта диетического профилактического питания в рамках программы медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения
Комплексная оценка безопасности и эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» на основе бактериофагов проводилась в рамках программы медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения, одобренной этическим комитетом лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ). Типовая программа реабилитации включала: дието-, фито-, бальнео-, кинезотерапия, тренинги, гастрошколы и т.д. В исследование были включены 46 пациентов (мужчин) в возрасте 18-65 лет со следующей патологией: синдром раздраженного кишечника с диареей - 14 пациентов; синдром раздраженного кишечника без диареи - 20 пациентов; запор - 12 пациентов. При бактериологическом исследовании фекалий у пациентов были выявлены Staphylococcus aureus, энтеропатогенная Escherichia coli, грибы рода Candida и другие представители условно-патогенной микрофлоры (УПМ), типичные для дисбиотического состояния кишечника. Все пациенты были разделены на две группы: в основной группе пациентов (30 человек) в типовую программу реабилитации был дополнительно включен фаговый коктейль, который назначался по следующему алгоритму: 50 мл 3 раза в день во время еды, курсом 10 дней. У 16 пациентов группы сравнения реабилитацию осуществлялт в рамках типовой программы.
Оценка эффективности проведенной медицинской реабилитации в сравниваемых группах осуществлялась по динамике клинических проявлений и степени изменения микробиологических показателей. Анализ клинических симптомов показал (рисунок 24), что у пациентов основной группы достоверно раньше (р 0,05), чем в группе сравнения, купировались жалобы на боли в животе (на 4 день и 6 день, соответственно), диспепсические проявления (3 и 6 сутки, соответственно), очистился язык (3 и 5 день, соответственно), появился ежедневный самостоятельный стул (на 5 и 8 день, с о ответственно).
Эффективность применения специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» по предложенному алгоритму клинического использования подтверждали элиминацией Staphylococcus aureus, энтеропатогенной Escherichia coli, грибов рода Candida у всех пациентов основной группы. Элиминация грибов рода Candida также может быть отнесена к эффектам специализированного продукта в связи с установленной стимуляцией роста этих грибов в результате их симбиоза со Staphylococcus aureus.
Включение в типовую программу медицинской реабилитации алгоритма клинического использования фагового коктейля позволило на 33,3 % снизить количество пациентов с дисбактериозом кишечника второй и третьей степени за счет элиминации условно-патогенной микрофлоры (УПМ), а у 36,7 % пациентов основной группы добиться полной нормализации показателей микробиоценоза (рисунок 25).
Полученные положительные результаты по комплексу клинико-лабораторных показателей при включении предложенного алгоритм клинического использования фагового коктейля в программу реабилитации у лиц с СРК (синдром раздраженного кишечника) и запорами подтвердили эффективность разработанного специализированного продукта диетического профилактического питания «Фудфаг» в качестве санирующего пробиотического средства, нормализующего дисбиотические нарушения ЖКТ (желудочно-кишечного тракта).
Ограниченные клинические испытания специализированного продукта диетического профилактического питания при моделировании эшерихиоза у здоровых добровольцев В рамках изучения специфической эффективности специализированного продукта диетического профилактического питания («Фудфаг») была проведена работа по оценке профилактического алгоритма применения продукта в модельном эксперименте эшерихиоза в организованном коллективе, вызванном непатогенным штаммом Escherichia coli К12 С600. Экспериментальную инфекцию вызывали путем перорального однократного введения по 20 мл Е. coli К12 С600 в титре 5x10 КОЕ/мл в сутки натощак в течение 3-х дней. Добровольцев опытной группы подвергали заражению на фоне профилактического приема специализированного продукта «Фудфаг» 2 раза по 50 мл «Фудфага» в сутки на прием до, во время и спустя сутки после периода инфицирования. Добровольцы контрольной группы вместо профилактического продукта получали физиологический раствор в таком же количестве. В эксперименте принимали участие 45 здоровых добровольцев в возрасте 25-45 лет из числа сотрудников МНИИЭМ им Г.Н.Габричевского и ограниченного контингента Федеральной Службы Безопасности (ФСБ) г. Астрахани. 30 добровольцев составляли опытную группу и 15 - контрольную. В эксперименте принимали участие только добровольцы, не имеющие в исходном анализе кала лактозонегативных штаммов Е. coli (таблица 46).