Введение к работе
Актуальность исследования
В диагностике заболеваний инфекционной и неинфекционной патологии важное место занимают качественные диагностические системы, сочетающие в себе высокую чувствительность, специфичность и простоту выполнения исследования. Следует отметить, что эти важные свойства присущи реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), однако данной реакции часто не хватает чувствительности. Предполагается, что невысокая чувствительность тест-систем в РПГА может быть связана либо с низкой концентрацией антигена на поверхности эритроцита-носителя, либо с неполным раскрытием антигенных структур для связи с антителами (авидностью) [Патрушев Л. П., 2004]. В связи этим, особую актуальность приобретают поиски перспективных соединений, сочетающих в себе как высокую конъюгирующую активность с антигеном, так и способность обеспечивать стабильность полученного препарата.
Другим важным компонентом при конструировании тест-систем является получение контрольных высокотитражных сывороток, производство которых также зависит от наличия высокоиммуногенных комплексов антиген-адъювант [Хаитов P.M. и др., 1996; Петров Р.В., Хаитов P.M., 2003; Tagliabue A., Rappuoli R., 2008]. Спектр имеющихся качественных адъювантов в настоящее время невелик, к тому же, они, не всегда полноценно выполняя свою главную задачу - повышать иммуногенность антигена, часто обладают рядом нежелательных характеристик: вызывают аутоиммунные осложнения, образование кист, свищевых абсцессов и гранулём [МедуницинН.В., 1993].
Всё возрастающий интерес к адъювантам на основе полимеров был обусловлен новыми открытиями в иммунологии. Интенсивное развитие органической химии в этом направлении позволило предложить исследователям широкий спектр полимерных соединений в качестве конъюгирующих компонентов и низкотоксичных адъювантов [Петров Р.В., Хаитов P.M., Атаулла-хановР.И., 1993].
Комплексирование синтетических полимеров с вирусными или бактериальными антигенами позволяло существенно усилить их иммунизирующие свойства [Хаитов P.M., Зверев В.В. и др., 2005]. При конъюгировании с полимерами, выполняющими роль биологически активного иммуноадъюванта, слабо антигенные белки различного происхождения превращаются в высоко иммуногенные препараты, что позволяет резко снизить иммунизирующие дозы антигена [Krupers M.J., Van Der Gaag F.J., Feijen J., 1996]. Имеющиеся достижения в области синтеза полимерных структур [Allcock Н., 1990; Annenkov V.V.et al., 2001; Анненков В.В., 2002], способных прочно связываться с белком (антигеном), весьма актуальны, поскольку они дают перспективу создания нового класса иммунодиагностикумов для РПГА, отвечающих современным требованиям.
Цель исследования:
Определение оптимальных условий и способов повышения функциональной активности эритроцитарных диагностикумов, используемых в РПГА для оценки общей иммунореактивности организма.
В соответствии с целью решались следующие задачи:
Подобрать эффективный метод извлечения специфических антигенов из культуральной биомассы бактерий для использования их в качестве компонентов диагностических систем;
Провести сравнительную оценку функциональной активности разных фракций микробных клеток бифидобактерий в технологии получения эритроцитарных диагностикумов;
Оценить конъюгирующие свойства «синтетических полимеров» с бактериальными антигенами при изготовлении эритроцитарных диагностикумов (ЭД) для РПГА;
Оценить адъювантную активность «синтетических полимеров» в сочетании с микробными антигенами;
С помощью разработанных ЭД исследовать иммунореактивность организма человека к симбионтной микрофлоре по уровню специфических антител в биологических субстратах организма (сыворотки крови, копрологи-ческие пробы).
Положения, выносимые на защиту
Конструирование эритроцитарных диагностических систем с помощью конъюгирующих компонентов (синтетических полимеров ПВИ, ПМАК и АК-ВИ) и антигенов фракции клеточных стенок бактерий позволяет улучшить качественные характеристики диагностикумов: чувствительность, специфичность, стабильность и воспроизводимость результатов;
Подобранные оптимальные концентрации полимеров (ПВИ, ПМАК и АК-ВИ) в комплексе с антигенами значительно повышают иммуногенную активность, что делает их перспективными в качестве адъювантов при получении высокотитражных сывороток, используемых для контроля эритроцитарных диагностикумов;
Высокая чувствительность и специфичность усовершенствованных эритроцитарных диагностикумов позволяет изучать особенности микробной экологии человека в современных условиях по уровню иммунореактивности макроорганизма к симбионтной микрофлоре.
Научная новизна
Осуществлена научно-методическая разработка технологии конструирования эритроцитарных диагностических систем с помощью новых конъюгирующих компонентов и высокоактивных белковых фракций, способствующих повышению их функциональной активности: чувствительности, специфичности и стабильности. Показана возможность создания узкоспецифичных (видовых) иммунодиагностикумов для оценки иммунореактивности организма к разным видам бифидобактерий. С помощью эритроцитарных диагностикумов отработан метод изучения локального иммунитета организма
человека по уровню интестинальных антител к бифидобактериям в копро-фильтратах. Показана возможность оценки специфической и неспецифической иммунорезистентности по уровню антител к симбионтной микрофлоре - нетоксигеннным коринебактериям дифтерии. Теоретическая значимость
Научно обоснована и экспериментально доказана принципиальная возможность совершенствования технологии конструирования иммунодиаг-ностикумов для РПГА на основе комплексов бактериальных антигенов с водорастворимыми полимерами-конъюгатами;
Доказана перспектива применения водорастворимых полимеров (ПВИ, АК-ВИ, ПМАК) в качестве адъювантов в составе современных вакцинных препаратов.
Практическая значимость
Эритроцитарная иммунодиагностическая система для оценки специфической и неспецифической иммунорезистентности населения по уровню антибактериальных антител была апробирована в практическом здравоохранении (инновационный проект 2005-2006 «Внедрение нового иммунодиагно-стикума для оценки антибактериального противодифтерийного иммунитета с целью предупреждения заболеваний (вспышек) дифтерии у населения Иркутской области);
С помощью диагностических тест-систем в РПГА по концентрации антител определяется уровень реактивности организма к представителям симбионтной микрофлоры (бифидобактериям) кишечника на видовом уровне, что даёт дополнительную информацию о состоянии микроэкологического статуса организма (популяции);
Неинвазивный метод исследования локального иммунитета организма к симбионтной микрофлоре по уровню антител в копропробах позволяет расширить диагностику микроэкологического статуса у детей и взрослых. Оформляется медицинская технология по оценке системного и локального иммунитета к индигенной микрофлоре;
Материалы выполненных исследований легли в основу четырёх патентов РФ на изобретение: Патент РФ №2142807; Патент РФ №2205408(72); Патент РФ.№ 220280; Per. заявка № 2009144839(РФ);
Усовершенствованные эритроцитарные иммунодиагностикумы используются в практической деятельности института эпидемиологии и микробиологии и гастроэнтерологического отделения клиники НЦ ПЗСРЧ СО РАМН, материалы диссертации внедрены в учебный процесс ИГУ.
Апробация материалов диссертации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Ассамблее «Здоровье человека в Сибири», (Новосибирск, 1994); Научной конференции с международным участием: «Экология и общественное здоровье», (Новокузнецк 1994); Научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепататов и инфекций управляемых специфическими средствами профилактики», (Пермь
1998); На VIII Съезде Всеросс. Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, (Москва, 2002); II научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новые технологии в медицине», (Новосибирск, 2002); Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования, (Москва, 2002); Российской научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно - Сибирском регионе», (Иркутск, 2002); Международной конференции: «Пробио-тики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», (Москва, 2004); Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы права, экономики и управления в Сибирском регионе», (Иркутск, 2005, 2008); Межрегиональной научно-практической конференции «Итоги, проблемы и перспективы государственной санитарно-эпидемиологической службы Иркутской области», (Иркутск, 2007); Форуме «Роснанотех», (декабрь 2008, Москва).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 37 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК, одиннадцать. Материалы исследований защищены четырьмя патентами.
Личный вклад автора
Автором проведен анализ научной литературы по данной проблеме, поставлена цель, сформулированы задачи исследования. Выполнены иммунологические, микробиологические, физико-химические исследования, а также все этапы конструирования эритроцитарных диагностикумов с последующим анализом материала на основе статистической обработки. Экспериментальный материал обобщен и изложен в публикациях. Осуществлено оформление диссертационной работы. Личный вклад автора составляет 80%.
Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», двух глав собственных исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, 22 рисунка. Библиографический указатель включает 173 работы, из них отечественных 142 и 31 зарубежных.
Благодарность. Автор выражает искреннюю признательность за консультативную и практическую помощь в выполнении всех разделов диссертационной работы и особенно разделов, касающихся изучения популяцион-ного иммунитета населения, заведующей лабораторией микроэкологии Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН, д.б.н. Софии Марковне Попковой.
Похожие диссертации на Способы повышения эффективности эритроцитарных диагностикумов для оценки иммунореактивности организма в реакции пассивной гемагглютинации
