Введение к работе
Актуальность исследования.
Cтремительный рост бактериальных инфекций, резистентных к антибиотикам, диктует насущную необходимость создания новых терапевтических антибактериальных агентов. В ряде случаев антибиотики из имеющегося арсенала лекарственных средств уже не обеспечивают эффективного контроля над возбудителем при развитии хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваний. Ряд штаммов Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium и Pseudomonas aeroginosa все труднее подавляются конвенциальными антибиотиками. Возрастающая резистентность наблюдается также в отношение таких распространенных патогенов человека, как Staphylococcus aureus и Staphylococcus pneumoniae. Открытие пептидных антибиотиков и изучение их биологических функций показывает, что эти природные соединения являются перспективными молекулами для создания новых антимикробных средств.
В процессе эволюции многоклеточные организмы выработали эффективные механизмы защиты от патогенов. Лимфоцитарный иммунитет возник лишь с появлением челюстных рыб и существует менее чем у 2% видов многоклеточных организмов. Однако в первые часы взаимодействия с патогеном даже те животные, которые обладают способностью вырабатывать антитела, могут полагаться только на защитные механизмы системы врожденного иммунитета. Эндрогенные антимикробные пептиды (далее АМП) являются неотъемлемыми молекулярными факторами системы врожденного иммунитета организмов, обеспечивающими их выживание в окружении потенциальных патогенов (бактерий, грибков, простейших, вирусов). Результаты исследований структурного разнообразия и распространения АМП в природе дают основание полагать, что каждый биологический вид вырабатывает свой уникальный набор защитных пептидов, позволяющий ему успешно бороться с окружающей его патогенной микрофлорой. В настоящее время определены структуры около тысячи природных пептидных антибиотиков, выделенных из различных тканей беспозвоночных и позвоночных животных, растений, грибов, бактерий и обладающих способностью инактивировать широкий спектр микроорганизмов. Поиск и исследование новых АМП позволяет лучше понять закономерности функционирования врожденного иммунитета у человека. По мере углубления наших знаний о пептидных антибиотиках появляется все больше сведений об их участии в процессах регуляции иммунитета и регенерации тканей.
Наряду с фундаментальными исследованиями структурно-функциональных свойств АМП важное прикладное значение имеют работы по созданию эффективных лекарственных средств на их основе. Природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить проблему резистентности к существующим антимикробным средствам. Подавляющее большинство АМП относятся к мембранотропным антибиотикам, поэтому развитие резистентности патогенов к ним менее вероятно из-за низкоизбирательного механизма их действия и возможно только при существенных изменениях структуры и свойств клеточной мембраны. Кроме того, многие АМП усиливают действие традиционных антибиотиков. Известно, что длительная антибиотикотерапия в ряде случаев вызывает состояние иммунодефицита и эндотоксемию, однако многие АМП наряду с антибиотической обладают иммуномодулирующей и эндотоксин-нейтрализующей активностью. Все это создаёт предпосылки для создания новых эффективных антибиотических лекарственных средств на основе природных пептидных антибиотиков, лишенных перечисленных выше недостатков. Учитывая наличие выраженной антибиотической и иммуномодулирующей активности у природных АМП, многие зарубежные фармацевтические компании уже приступили к созданию нового класса антибиотиков на их основе, а первые из них уже проходят клинические испытания. Структурно-функциональные исследования природных пептидных антибиотиков могут внести существенный вклад в развитие этого перспективного направления медико-биологической науки, а разработка способов их получения с целью создания на их основе лекарственных средств нового поколения является одной из актуальных задач современной биотехнологии.
Диссертация выполнялась по разделам основных направлений научных исследований ИБХ РАН «Структура и функции белков и пептидов” и „Биотехнология”, утвержденных Ученым Советом ИБХ РАН. Работа проводилась при поддержке РФФИ; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы; ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»; ФЦП «Национальная технологическая база» на 2007-2011 годы; целевой программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине».
Цель и задачи исследования.
Цель данной диссертационной работы состоит в исследовании структуры, биологических свойств и молекулярных механизмов действия природных эндогенных пептидных антибиотиков, а также в разработке биотехнологических способов их получения. Объектами исследования являются антимикробные пептиды ареницины из целомоцитов морского червя Arenicola marina [тип – кольчатые черви (Annelida), класс – многощетинковые (Polychaeta)]; аурелин из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita [тип – кишечнополостные (Cnidaria), класс – сцифоидные (Scyphozoa)]; буфорин из желудка азиатской жабы Bufo bufo gargarizans [тип – хордовые (Chordata), класс – земноводные (Amphibia), отряд – земноводные бесхвостые (Anura), семейство – жабы настоящие (Bufonidae)]; дефенсин и липид-траспортирующий белок из чечевицы обыкновенной Lens culinaris [отдел – покрытосеменные (Magnoliophyta), класс – двудольные (Dicotyledones), порядок – бобовоцветные (Fabales), семейство – бобовые (Fabaceae), подсемейство - мотыльковые (Faboideae)]; зервамицин и антиамебин из мицелиальных спорообразующих грибов Emericellopsis salmocynnemata и Emericellopsis minima [отдел – настоящие грибы (Eumycota), подотдел – аскомицеты (Ascomycotina), класс - эуаскомицеты (Euascomycetes)]; латероцидин и латероцин из аэробной грам-положительной бактерии Brevibасillus laterosporus; лихеницидин из термофильной грам-положительной бактерии Bacillus licheniformis. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить структуру и свойства антимикробных пептидов ареницинов, аурелина, дефенсина и липид-транспортирующих белков чечевицы, зервамицина, антиамебина, латероцидина, латероцина, лихеницинов.
2. Разработать биотехнологические способы получения ареницинов, аурелина, буфорина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы в искусственных экспрессирующих системах, включая методики их выделения и очистки.
Научная новизна работы.
Все результаты, изложенные в настоящей работе, получены впервые.
1. Впервые установлена структура новых антимикробных пептидов ареницинов из целомоцитов морского кольчатого червя Arenicola marina, нового антимикробного пептида аурелина из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita, нового дефенсина и новых липид-траспортирующих белков из семян чечевицы Lens culinaris, новых антимикробных пептидов латероцидина и латероцина из штаммов аэробных грам-положительных бактерий Brevibасillus laterosporus, новой двухкомпонентной системы лантибиотиков из термофильных грам-положительных бактерий Bacillus lichenifromis. Впервые определены полные нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих белки-предшественники ареницинов, аурелина, дефенсина и липид-траспортирующих белков чечевицы, лихеницидина и соответствующие им полные аминокислотные последовательности белков-предшественников.
2. Впервые сконструированы биотехнологические системы для гетерологичной экспрессии ареницина, аурелина, буфорина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы. Впервые получены штамм-продуценты, позволяющие экспрессировать гибридные белки, содержащие искомые антимикробные пептиды. Впервые разработаны способы получения, методики выделения и очистки рекомбинантных ареницина, аурелина, буфорина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы, полностью идентичных природным пептидным антибиотикам по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и антимикробной активности.
3. Впервые разработаны биотехнологические способы получения аналогов ареницина, аурелина, зервамицина, антиамебина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы, меченных стабильными изотопами.
4. Впервые проанализированы структурные особенности выделенных антимикробных пептидов и спектр их биологического действия в сравнении с другими представителями этого класса биологически активных веществ. Впервые изучены физико-химические свойства рекомбинантных ареницина, аурелина, дефенсина чечевицы, а также зервамицина, антиамебина и лихеницидина. С использованием полученных данных, предложены модели, описывающие механизмы антимикробной активности ряда исследованных пептидных антибиотиков.
Полученные сведения обогащают наши знания о защитных пептидах как природных молекулярных факторах врожденного иммунитета и могут стать основой для дальнейших исследований механизмов биологической активности этих веществ, а также могут представлять ценность для исследований в области молекулярной эволюции АМП.
Практическая ценность работы.
Полученные в ходе выполнения данной работы АМП могут представлять большой практический интерес в качестве антибиотиков нового типа. По своей антимикробной активности ряд полученных пептидов не уступают лучшим мировым аналогам. Широкому применению АМП в клинической практике препятствует высокая себестоимость их производства. Проблема может быть успешно решена методами биотехнологии, применение которых является значительно более экономически оправданным по сравнению с химическим синтезом. Полученные в ходе данной работы новые АМП могут быть также использованы для решения задач сельскохозяйственной биотехнологии по повышению устойчивости растительных культур по отношению к микробным, в особенности грибковым патогенам.
Апробация работы
Результаты исследований были представлены на IV, VI и VIII Гордоновских международных конференциях по антимикробным пептидам (Gordon Research Conferences “Antimicrobial peptides”, Барга, Италия, 2003, 2007, 2011), 33-м и 36-м Конгрессах ФЕБО (Афины, Греция, 2008 и Турин, Италия, 2011), XVIII Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирмингем, Великобритания, 2000), Международной конференции “Peptaibols: Biosynthesis, Structural Diversity and Mode of Action” (Йена, Германия, 2002), Международных конференциях по магнитному резонансу “EUROMAR-2009” и “EUROMAR-2010” (Гётеборг, Швеция, 2009 и Флоренция, Италия, 2010), Международном симпозиуме «Nuclear magnetic resonance in condensed matter. The 4th meeting «NMR in life sciences» (Санкт-Петербург, 2007), российско-шведской конференции “NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition” (Москва, 2000), XI и XII международных конференциях “New information technology in medicine, biology, pharmacology, and ecology” (Гурзуф, Украина, 2003, 2004), IV, V и VI Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009, 2011), Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2009), Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008), Международной конференции «Scenarios for a coordinated approach to sustainable cooperation with the Eastern neighbors of the EU” (Москва, 2007), Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004), Международной конференции «Фармацевическая биоэтика» (Москва, 1997), рабочих совещаниях участников международного проекта INTAS (Санкт-Петербург, 2005; Триест, Италия, 2006), симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008), III съезде Биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), III съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007, 2008, 2009), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), 50-й научной конференции МФТИ (Москва-Долгопрудный, 2007), научных конференциях ФИБХ РАН (Пущино, 1999, 2004), школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), XV-XXIII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003-2011).
Публикации и патенты
По теме диссертации опубликовано 139 работ, в том числе 46 статей в ведущих отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, из них 15 статей в российских журналах (Биоорганическая химия, Биотехнология, Биохимия, Доклады Академии наук и др.), 28 статей в зарубежных журналах (Anal. Bioanal. Chem., Appl. Magn. Res., BBA, Biochem. Biophys. Res. Commun., Biochemistry (USA), Bioorganic Chemistry (USA), Biochem. J., Biophys. J., Biopolymers, Chemistry & Biodiversity, FEBS Letters, J. Am. Chem. Soc., J. Biol. Chem., J. Biomol. NMR, J. Peptide Sci., Protein Pept. Letters, Proteomics и др.) и 3 статьи в сборниках научных работ. По результатам исследований получено 9 патентов на изобретение РФ, подано 2 заявки на выдачу патента РФ. В 2009 г. патент на изобретение РФ №2316595 «Способ получения антимикробного пептида ареницина» вошёл в число 100 лучших изобретений России и получил диплом Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. По теме работы опубликовано также 82 тезиса докладов, в том числе 43 тезиса на международных конференциях и 39 тезисов на российских конференциях.
Личный вклад автора.
Автору принадлежит решающая роль в выборе направления и объектов исследований, разработке и проверке предложенных в работе экспериментальных подходов на всех этапах работ по выделению, изучению структуры, биотехнологическому получению аналогов и исследованию биологической активности природных пептидных антибиотиков - от постановки задачи и планирования экспериментов до анализа, обсуждения, обобщения и оформления полученных результатов. Весь экспериментальный материал получен при непосредственном участии автора и под его научным руководством, за исключением физико-химических исследований, выполненых в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН.