Введение к работе
Актуальность проблемы. Род Brassica отличается большим морфологическим разнообразием форм н является источником ценных масличных, овощных, пряных, кормовых и декоративных культур, широко используемых по всему миру. Большинство культурных форм Brassica произошло от шести основных видов: В. napus (масличный рале, брюква). В. гара (азиатские листовые капусты, репа и турнепс). В, oferacea (кочанная, брюссельская н цветная капуста, брокколи, кольраби), B.juncea (горчица сарептская) В. cannula (горчица эфиопская) и В. nigra (горчица черная). Филогенетические взаимосвязи между этими видами хорошо описаны моделью так называемого «U-треугольника» [U, 1935). Согласно згой модели в результате естественной гибридизации трех диплоидных видов В. гара, В. nigra. В, окгасеа. геномы которых условно обозначены как АА, ВВ, СС, соответственно, возникли аллотетраплоидные формы B.juncea (ААВВ), В. napus (ААСС), В. caritmta (ВВСС). Таким образом, род Brassica представляет собой удобную модель для исследования генетического разнообразия и интрогресемм генетического материала в результате межвидовой и межродовой гибридизации.
Исследование генетического разнообразия культурных ы дикорастущих видов Brass tea и родственных представителен семейства Brassteaceae представляет большое научное значение для выяснения филогенетических взаимосвязей и эволюции геномов, уточнення границ таксонов и практическое значение для выявления потенциальных источников новых культур и доноров важных агрономических признаков, которые могут быть включены в различные селекционные программы.
Важной сферой описания и использования растительных генетических ресурсов
является регистрация растительных форм. Новые сорта культурных растений должны пройти
ряд тестов иа отличимость, однородность и стабильность (DUS - Distinctness, Uniformity,
Stability), которые составляют основу защиты интеллектуальной собствен ностн
селекционеров. Современная система диагностирования, основанная на ряде
стандарти зованных морфологических характеристик, требует длительных полевых
испытаний и многочисленных статистических исследований. Кроме того, в связи с широким
применением в селекции новейших биотехнологий растительные коллекции значительно
пополнились гибридными сортами и генетически модифицированными формами, которые
невозможно надежно различать и идентифнпировать, используя ограниченное число
морфологических характеристик. Для быстрого и надежного различения и идентификации
растительных форм возникла необходимость анализа полиморфизма на генетическом
уровне. \ РГАУ-МСХА
[ имени К.А. Тнмиряа і ЦНБ имени НИ. Желе I Фонд вауч
УРШ&
Наиболее перспективным подходом для исследования генетического полиморфизма представляется использование методов молекулярного анализа, основанных на анализе полиморфизма ДНК, позволяющих получить индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль. Существующие методы анализа геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации. Метод анализа полиморфизма микросателлитов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома, является наиболее перспективным для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как идентификация, паспортизация и сертификация сортов, поддержание генетических коллекций, составление родословных, зашита интеллектуальной собственности, подбор родительских пар при скрещивании, контроль иитрогрессии генетического материала, и решения проблем молекулярной систематики и эволюции. В связи с этим, большое практическое значение представляет разработка надежной, высокопроизводительной и удобной в эксплуатации технологии генотипнроваиия растений рода Braxsica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Цель работы. Разработка технологии генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма мнкросателлнтов.
Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ;
1. Исследовать возможность применения метода микросателлитного анализа для генотипирования растений рода Bimsice и родственных представителен семейства Brassicaceae. Разработать универсальную технологию для генотипирования растений рода Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Отобрать оптимальный набор праймеров к полиморфным микросателлиткым локусам для различения и идентификации растений рода Brassica.
1. Применить технологию микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия представителей семейства Brassicaceae на родовом, видовом и внутривидовом уровне, а также для генотипирования близкородственных сортов и гибридов Brassica.
-
Изучить природу межвидового и внутривидового полиморфизма микросателлитных локусов.
-
Исследовать возможность применения технологии микросателлитного анализа для исследования филогенетических взаимосвязей видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae на модели «треугольника U», а также для осуществления контроля иитрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях.
Научная нпвизна. На основании проведенных исследований нами были отобраны 18 пар праймеров к микросателлитным локусам. являющиеся перспективными для идентификации
видов, сортов и дикорастущих форм Brassica. С применением технологии микросателлитного анализа были получены уникальные генетические профили 98 растительных форм родов Brmstea* Sinapte, Raphanus и Cametina. В результате микросателлитного анализа впервые были идентифицированы фрагменти, специфичные для геномов А, В и С диплоидных видов Brosslca и подтверждена их интрогрессия в амфидиплоидные виды, а также межвидовые и межродовые гибриды. Впервые показана возможность контроля ннтрогрессии генетического материала родительских форм {сортов В. гора) в гибриды с помощью технологии микросателлитного анализа. В результате клонирования и секвенирования микросателлитных фрагментов локусов Nal2-A02 и BRMS-042 было установлено, что исследуемые фрагменты представляют собой сложные микрасателлитные повторы, включающие несколько вариабельных областей. На основе сравнительного анализа микросателлитных фрагментов локусов было установлено, что полиморфизм между геномами А, В н С определяется числом микросатедлитных повторов и ннсерциями/делеииями во фланкирующих участках генома, а полиморфизм внутри геномов определяется исключительно числом микросателлитных повторов. Результаты анализа полиморфизма микросателлитов на генетическом уровне подтвердили филогенетические взаимосвязи шести видов Brassier описанные моделью «U-треугольника», тесную взаимосвязь А и С-ген омов (В. rapa/B. oleracea) и более отдаленную связь с В-геномом {В. nigra).
Практическая значимость работы. Предлагаемая технология генотипирования на основе микросателлитного анализа позволяет надежно различать рода, виды н сорта, в том числе и близкородственные, выявлять генетическую разнородность фенотипкчески однородного материала, осуществлять контроль ннтрогрессии генетического материала от родительских форм в межродовые, межвидовые н сортовые гибриды. Показана перспективность применения технологии для идентификации, генетической паспортизации и сертификации, подбора генетически однородного материала для скрещиваний и контроля селекционной работы, а также для решения проблем молекулярной систематики и эволюции. В результате микросателлитного анализа выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, которые могут быть использованы в качестве маркеров ннтрогрессии генетического материала при межвидовых и межродовых скрещиваниях. На основе специфичной последовательности микросателлитного локуса Nal2*A02 создан яокус-спецнфичный SCAR-маркер генома В Srassica, который может быть эффективен для контроля ннтрогрессии генома В при создании форм Brassica, устойчивых к болезням и неблагоприятным условиям среды, а также для исследования филогенетических взаимосвязей и эволюции видов Brasslca.
Публикации я апиоСяиня работы. По результатам диссертации опубликовано б печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 19 октября, 2004), ІП Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, I -4-1S марта, 2003) и на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов («Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 19 - 22 мая, 2005).
Структура и обьем работы. Диссертация состоит нз введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 204 библиографические ссылки. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, содержит 17 таблиц и 30 рисунков.