Введение к работе
Актуальность темы. Уникальная структура хитозана обуславливает его широкое применение в биотехнологии, медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности (Быков В.П., 1992; Гамзазаде А.И., 1999; Hудьга Л.А., 2002; Вихорева Г.А., 2002; Варламов В.П., 2004; Албулов А.И., 2005; Немцев С.В., 2006; Muzzarelli R.A.A., 1997; Peter M.G., 1997). Хитин и хитозан являются природными биополимерами и их синтез, модификация и деградация связана с ферментативными превращениями. Установлено, что хитозан является слабым аллергеном, обладает низкой токсичностью и пирогенностью.
В последние годы учеными различных стран проводятся исследования по использованию хитозана при конструировании вакцин. Одним из основных мер борьбы с инфекционными заболеваниями животных является специфическая профилактика. При конструировании противовирусных вакцин вопрос использования эффективных адъювантов до настоящего времени остается актуальным. При этом хитозан используется как в качестве сорбента антигена, так и в качестве стимулятора поствакцинального иммунного ответа (Маркушин С.Г., 2010; Переверзев А.Д., 2012; Черникова М.И., 2015; Ghendon Y., 2008; Wang X., 2012; Vasiliev Y., 2015 и др.).
Хитозан обладает широким спектром антимикробной активности, в том числе по отношению к патогенной микрофлоре (Бондаренко В.М., 2006; Куликов С.Н., 2010), способен стимулировать рост бифидобактерий и лактобактерий (Червинец В.М., 2001; Панин А.Н., 2006; Кириленко Ю.К., 2007; Huean-Woo L., 2002; Lee W.H., 2002), что позволяет применять его в комплексе с пробиотическими препаратами.
Степень разработанности проблемы. Особое внимание и важнейший интерес для перспективных применений хитозана представляют его низкомолекулярные формы. Главным образом в промышленных масштабах такие низкомолекулярные соединения получают методами химического гидролиза. Вопросу гидролиза хитозана, в том числе и ферментативного, в последнее время уделяется достаточно много внимания.
В последние годы в ветеринарии большое значение приобретают адъюванты, получаемые из природного сырья. Это связанно с побочными эффектами (такими, как аллергия, кумулятивные свойства) препаратов,
изготовленных путем химического синтеза. На этом фоне обращает на себя внимание хитозан, получаемый из панциря ракообразных. Свободные аминогруппы хитозана образуют хелатные комплексы с ионами металлов, активно взаимодействуют со сложными органическими молекулами, такими как белки и пептиды. Эта активность объясняется не только наличием высокого положительного заряда, но и, в большей степени, вторичной и третичной структурой полимера, что указывает на возможность использования хитозана в качестве адсорбента, адъюванта и иммуномодулятора. Известны работы по включению модификатов хитозана в качестве адъюванта в составе вакцин ветеринарного назначения (Самуйленко А.Я., 1995; Жоголев К.Д., 2006; Варламов В.П., 2010; Албулов А.И., 2012; Okawa Y., 2003; Chang N., 2010; Allison C., 2011 и др.).
Пребиотические свойства хитозана изучены недостаточно, поэтому оценка симбиотического действия хитозана с различными пробиотическими штаммами микроорганизмов представляет научный и практический интерес.
Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в разработке технологии получения низкомолекулярного хитозана и изучении возможности применения различных форм хитозана при конструировании вакцинных и пробиотических препаратов.
Для достижения поставленной цели были определены следующие
основные задачи:
-
Разработать технологию регулируемого ферментативного расщепления хитозана для получения его низкомолекулярных производных.
-
Изготовить опытные образцы низкомолекулярных форм хитозана, определить их основные физико-химические свойства.
-
Исследовать адъювантную и биологическую активность производных форм хитозана и эффективность их применения при конструировании антибактериальных и противовирусных вакцин.
-
Изучить влияние хитозана в составе защитной среды высушивания на выживаемость микроорганизмов на этапе лиофилизации и жизнеспособность в процессе хранения.
-
Исследовать эффективность воздействия пробиотического препарата «Муцинол Экстра», содержащего хитозан, на организм молодняка крупного рогатого скота.
Научная новизна исследований. Разработана технология
регулируемого ферментативного расщепления хитозана для получения его низкомолекулярных производных. Определены технологические параметры получения низкомолекулярного хитозана. Показано, что использование ферментного препарата дает возможность регулировать молекулярную массу хитозана в широких пределах.
Исследованы адьювантные свойства производных форм хитозана. Введение хитозана в составы вакцин против инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота, репродуктивно – респираторного синдрома свиней (РРСС), некробактериоза животных способствовало повышению титра поствакцинальных антител и уменьшению воспалительного процесса в месте введения вакцины, увеличению продолжительности иммунного ответа.
Разработанная защитная среда высушивания, содержащая хитозан, для симбиотического препарата на основе штамма Escherichia coli VL-613, позволяет получить более стабильный по биологическим свойствам препарат и увеличить срок его хранения (патент РФ № 2571157).
Впервые получена сухая инактивированная безвредная
высокоиммуногенная вакцина против ИРТ крупного рогатого скота,
содержащая в качестве защитной среды высушивания хитозана сукцинат,
обеспечивающая создание у привитых животных напряженного и
длительного иммунитета (заявка на изобретение, рег. № 2016132302).
Научно обоснована и экспериментально доказана эффективность влияния пробиотика «Муцинол Экстра», содержащего хитозан, на микробиоценоз толстого кишечника, динамику живой массы и морфо-биохимические показатели гомеостаза телят.
Теоретическая и практическая значимость исследований.
Разработана и в производственных условиях апробирована технология
получения низкомолекулярных форм хитозана. По результатам
исследований разработаны ТУ «Хитозан низкомолекулярный» (ТУ 9289-
038-11734126-15). Изготовлены опытно-промышленные партии
низкомолекулярного хитозана для изучения адъюватной активности
хитозана при конструировании вакцинных и пробиотических препаратов.
Полученные результаты подтверждают перспективность использования производных форм хитозана в составе бактерийных и вирусных вакцин.
Установлено, что производные формы хитозана нетоксичны и могут
безопасно и эффективно вводиться внутримышечно и внутрикожно, что
может служить основанием для их использования при разработке лечебно-
профилактических препаратов. Показано, что введение хитозана в состав
вакцин способствует повышению эффективности специфической
профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота,
репродуктивно-респираторного синдрома свиней, некробактериоза
животных.
Методология и методы исследований. Методология включает
стандартные для данной области знаний процедуры с использованием
различных материалов и естественно-восприимчивых животных.
Экспериментальные исследования осуществляли в отделе получения БАВ ВНИТИБП, ООО «Биопрогресс», Центре «Биоинженерия» РАН, Брянской ГСХА, УО «Белорусская государственная академия ветеринарной медицины» и отделе вирусных инфекций РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» (Республика Белорусь), ФГБУ «ВНИИЗЖ» Федеральный центр охраны здоровья животных г. Владимир, ФКП «Щелковский биокомбинат», в хозяйствах Витебской и Брянской областей (ОАО «Возрождение» Республика Беларусь, ООО «Снежка – Бетово» Брянской области).
Объектами исследований: служили кислоторастворимый хитозан из панциря камчатского краба (ММ 700 кДа, СДА 85%), сукцинат хитозана (ММ 330 кДа, СЗ 75,2 %), хитозан низкомолекулярный пищевой (гидрохлорид) (ММ 50 кДа); хитозан гелевый (2%-ный раствор в 2%-ной уксусной кислоте). В качестве ферментного препарата для гидролиза использовали Целловиридин Г 20х на основе штамма Trichoderma reesei.
Животные: телята черно-пестрой породы 2 – 2,5 и 3-4 месячного возраста, кролики, подсвинки белой породы 1–1,5-месячного возраста живой массой 15–20 кг, белые беспородные мыши-самцы массой 18-20 г.
Пробиотический препарат: «Муцинол Экстра».
Симбиотический препарат: «Симбиохит».
Культуры клеток: перевиваемые культуры клеток почки телёнка ПТ-80 и Таурус-I (T-I), культура клеток МДБК, перевиваемая культура клеток почки макаки резус (Мarc-145).
Вакцины: против ИРТ крупного рогатого скота, репродуктивно-респираторного синдрома свиней, некробактериоза животных.
Адъюванты: хитозан, хитозана гидрохлорид, хитозана сукцинат, полиоксидоний, гидроксид алюминия, сапонин, эмульсиген, продукция фирмы SEPPIC(Франция): Montanide ISA 15, Montanide ISA 70 VG и Montanide ISA 206 VG.
Методы: измерение рН - потенциометрическим методом анализа; определение динамической вязкости растворов модификаций хитозана - на ротационном вискозиметре «Reotest-2» в системе коаксиальных цилиндров №/№ и S/S; молекулярно-массовые характеристики модификаций хитозана -на хроматографе высокого давления фирмы Gilson (США); остаточную влажность образцов модифицированного хитозана - высушиванием пробы при Т=105С; наличие антител - в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием эритроцитарных диагностикумов; иммуногенность вакцины против некробактериоза животных - в РГА, антигенную активность - в ИФА и РН, реактогенность - на кроликах и белых мышах.
Основные положения работы, выносимые на защиту:
1. Технология регулируемого ферментативного расщепления хитозана
позволяет получать его низкомолекулярные производные с заданными
свойствами.
2. Применения производных форм хитозана при конструировании
антибактериальных и противовирусных вакцин.
3. Использование хитозана в составе защитной среды высушивания при
изготовлении сухих вакцин.
4. Оценка эффективности выпаивания пробиотического препарата
«Муцинол Экстра» на организм молодняка крупного рогатого скота.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов исследований подтверждена соответствием теоретических данных с результатами проведенных экспериментальных исследований. При анализе и статистической обработке результатов использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office, 2010», построение технологических и аппаратурных схем – с помощью программы «Microsoft Office Visio, 2016». Для выявления статистически значимых
различий использовали критерий Стьюдента-Фишера (Н.А. Плохинский, 1961).
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены
на заседаниях ученого совета ВНИТИБП (2013-2016 гг.). Результаты работы
представлены на Международных конференциях 2013-2016гг.
(Екатеринбург, Пермь, Щелково, Минск, Уфа, Армавир). Автор является лауреатом премии им. П.П. Шорыгина в 2015, 2016, 2017 гг.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 18 научных работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. Получен 1 патент на изобретение.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Результаты исследований соответствуют п.п 1, 3, 4, 9, 11 паспорта специальности 03.01.06. и п.п 9, 14 паспорта специальности 06.02.02.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», « Собственные исследования», «Обсуждения результатов», «Выводы», «Практические предложения», «Список использованной литературы», «Приложения». Работа изложена на 117 страницах, содержит 13 рисунков и 14 таблиц. Список литературы включает 229 наименований, из которых 119 отечественных 110 зарубежных.