Введение к работе
Актуальность темы. Обеспечение населения России продовольствием и биологическая защита людей и животных в стране являются основными задачами АПК на современном этапе, что делает актуальными научные исследования в области биотехнологии, направленные на решение этих проблем.
В настоящее время техническая микробиология является активно развивающимся научным направлением, исследующим биотехнологические процессы при разработке и производстве широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагностикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Применение таких препаратов в животноводстве и птицеводстве способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств.
Современная ситуация в России остро поставила задачу по импортозамещению препаратов, что повышает требования к конкурентоспособности отечественной продукции, делает необходимым реконструкцию (реинжиринг) производств многих предприятий биологической, химической и пищевой промышленности и разработку новых или усовершенствование традиционных промышленных технологий производства препаратов.
Степень разработанности. Основы разработки, оптимизации, моделирования технологий микробиологических производств и процессов микробиологического синтеза отражены в работах В.М. Кантере, В.В. Бирюкова, А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан, Ю.П. Грачева, И.В.Павленко (1979 – 2013 г.г.). Данные исследования актуальны для предприятий, выпускающих лекарственные средства для животных, в том числе и пробиотические, симбиотические препараты, с точки зрения обеспечения их безопасности и качества.
В настоящее время в области создания и усовершенствования существующих промышленных технологий производства пробиотических, симбиотических препаратов для животных и человека не существует единого методологического подхода.
Группа бактерий, включенная в род Escherichia, насчитывает большое число разновидностей, отличающихся между собой по ферментативным и серологическим свойствам, подвижности, по чувствительности к бактериофагам и колицинам, по степени антагонистической активности и патогенности. Непатогенные виды колибактерий традиционно используются для изготовления пробиотических препаратов (А.Н Панин, 2008; А.Я. Самуйленко, 2010; Н.И. Малик, 2009; В.И. Еремец с соавт., 2008 г., И.В.Павленко, 2013).
В настоящее время достоверно установлено, что только симбиоз макроорганизма и полезных микроорганизмов обеспечивает нормальное функционирование организма животных и человека. Именно наличие полезной микрофлоры в организме реализует генетический потенциал продуктивности животных и здоровья человека. В современных условиях ведения животноводства активно развивается направление использования симбиотиков не только как антагонистов патогенной микрофлоры, но и как продуцентов лизина - незаменимой аминокислоты. Лизин входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, является важным фактором биологически полноценного кормления, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании
костяка, повышении продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы. Такие симбиотики используются в животноводстве (свиноводстве и птицеводстве) в качестве альтернативы дорогостоящему синтетическому лизину (моногидрохлорид лизина), в основном, импортного производства. Поэтому разработка новых препаратов такой группы и технологии их производства является актуальной проблемой. Начало решения этого вопроса было положено Л.К. Эрнстом (1985, 2007), В.И. Фисининым (2007), А.Я. Самуйленко (2007), А.А. Раевским (2007), А.А. Нежутой (2009), Е.Э. Школьниковым (2007), и др. Достойное продолжение эти работы нашли в исследованиях И.В.Павленко и соавторов (2012-2013 гг.).
В процессе изготовления готовых форм лизинсинтезирующих препаратов
осуществляется стабилизация биологических и физико-химических свойств
микроорганизмов, стандартизация дозировки и оптимизация условий сохранения биологической активности препарата. В настоящее время большинство пробиотиков такого класса изготавливаются в форме порошка, таблеток, капсул или свечей, в том числе лиофильно высушенных препаратов. Эти формы имеют длительные сроки годности (до года) и не чувствительны к непродолжительным изменениям температуры хранения.
Преимуществом сухих форм биопрепаратов является уменьшение объемов конечного продукта, что сокращает затраты при транспортировке и хранении. Одним из способов получения ТЛФ является сублимационное высушивание, однако в процессе сублимационного высушивания снижается концентрация живых микроорганизмов в готовой сухой форме и это может снижать эффективность их применения. Существенным недостатком является то, что процесс сублимации переводит бактерии в анабиоз (неактивное состояние). Для возвращения в активное физиологическое состояние им требуется 8-10 часов пребывания при температуре активации, а за это время большая часть их уже выводится из кишечника. Вместе с тем, в процессе лиофилизации бактериальные клетки теряют специфические рецепторы, которые помогают им закрепляться на слизистой кишечника, т.е. теряют способность к адгезии. В результате этого эффективность сухих пробиотиков снижается. Кроме того, затраты на производство сухих препаратов часто превышают затраты на транспортировку и хранение жидких препаратов.
При производстве жидких пробиотиков микробные клетки остаются в активном
состоянии и способны к адгезии и колонизации желудочно-кишечного тракта уже в
первые часы после попадания в организм. Жидкие формы препаратов содержат
дополнительный лечебный фактор – продукты метаболизма активных форм живых
бактерий, часть из которых (например - ферменты) могут разрушаться в процессе
сублимационного высушивания. Кроме того они на 30 – 40 % дешевле сухих форм
Недостатком нативных (жидких) форм препаратов являются трудности с их хранением и
транспортировкой. Жидкие формы менее стабильны, имеют более короткий срок и более
жесткие условия хранения, поэтому не всегда эффективны
.
В связи с вышеизложенным, научно обоснованное решение проблемы производства стабильных жидких форм препаратов и до настоящего времени является актуальной задачей, имеющей практическую ценность.
Цель и задачи исследований. Цель работы – разработать технологию производства нативного симбиотического препарата и оценить эффективность его применения в свиноводстве.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. научно обосновать и разработать технологические процессы, схемы
изготовления жидкой формы симбиотического препарата;
-
разработать эффективную питательную среду для изготовления жидкой формы симбиотического препарата;
-
оптимизировать состав защитной среды, используемой для стабилизации жидкой формы симбиотического препарата;
4. изготовить опытные серии нового препарата;
5 провести доклинические испытания препарата;
6. разработать схему применения препарата для поросят;
7. изготовить опытно-промышленные образцы нативного препарата и определить
эффективность их применения в свиноводстве.
Научная новизна. Разработана технология производства нативной формы симбиотического препарата, обеспечивающего ежедневную потребность свиней в лизине путем перорального применения препарата с кормом или водой.
Определен оптимальный состав защитной среды сохранения для жидкой формы симбиотического препарата.
Теоретическая и практическая значимость. Разработана технология
производства жидкого симбиотического препарата из штамма E. coli VL-613,
обладающего лизин синтезирующей активностью. Подготовлена и утверждена в
установленном порядке временная нормативная документация по изготовлению и
применению препарата в свиноводстве. Использование предложенной технологии
позволяет снизить себестоимость препарата на 30 – 40 % без потери его биологической
активности в течение 3 месяцев (срок наблюдения). Применение препарата в
свиноводстве повышает суточные привесы у поросят и создает экономию 6,68 рублей на 1 рубль дополнительных затрат, связанных с приобретением и применением симбиотика.
Методология и методы исследования. При исследовании и разработке технологических процессов производства жидкой формы симбиотического препарата использовали штамм E. coli VL-613, полученный из ФГУП ГосНИИГенетика. Культивирование эшерихий проводили на питательной среде основой которой являлся перевар Хоттингера.
Технологическое оборудование. Культуру эшерихий выращивали в пробирках и флаконах на шуттель-аппарате, а также в ферментере АНКУМ-2М емкостью 3 и 10 дм3, который оснащен системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН, рО2, еН, расход воздуха на аэрацию, скорость вращения мешалки и оптическая плотность бактериальной суспензии).
С целью пеногашения при интенсивном росте в ферментере эшерихий применяли пеногаситель пропинол Б - 400.
Содержание рН в культуральной жидкости определяли потенциометрически, уровень растворенного кислорода рО2 - датчиками изготовленными в СКБ БП (г.
Пущино), еН - потенциометрически с использованием электродов с ионной проводимостью типа ЭО – 01.
Оптическую плотность культуры E.coli измеряли на фотоколориметрах ФЭК - 56, ФЭК - 60, КФК - 2 и блоке определения оптической плотности аппарата АНКУМ - 2М.
Концентрирование бакмассы E.coli осуществляли с помощью лабораторных центрифуг К-70Д, S-60 и установки «Сартокон-мини» («Владисарт», г. Владимир).
Лизин синтезирующую активность симбиотика определяли путем измерения состава и содержания аминокислот на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "KNAUER" (Германия).
Структурно-методологическая схема достижения цели работы представлена на рисунке 1.
Этапы разработки
Исследования
Форма завершения
Разработка аппаратурно-технологической
схемы производства жидкой формы
симбтиотического препарата
Изготовление и контроль посевных материалов
Разработка защитных сред сохранения для
изготовления жидкой формы симбиотических
препаратов
Технологические
инструкции,
Лабораторный
технологический
регламент
А
Изготовление
опытных серий
нативного препарата
Доклинические испытания
Разработка схемы и дозы дачи препарата
Технологические
регламенты, проект
СТО, временная
инструкция по
применению
Клинические испытания
Испытания препаратов в хозяйствах
Разработка и утверждение НД
Технические
условия,
Инструкция по
применению
Технология производства жидкой формы симбиотических
препаратов
Рис 1 - Структурно-методологическая схема достижения цели по разработке технологии производства жидкой формы симбиотического препарата
Методы доклинических испытаний. Морфологию бактериальных культур определяли путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Культуральные свойства - путем высева их на МПА и МПБ. Жизнеспособность определяли методом последовательного десятичного титрования на чашках Петри с мясопептонным агаром. Длительность фаз роста, максимальной удельной скорости, минимального времени удвоения культур определяли графическим методом.
Образцы симбиотического препарата испытывали на безвредность на белых мышах и морских свинках. Препарат считается безвредным, если животные опытной и контрольной групп остаются живыми и здоровыми в течение 10 сут.
Клинические испытания. На ФКП «Армавирская биофабрика» была изготовлена опытно-промышленная серия жидкого симбиотического препарата и эффективность его применения на поросятах испытана в свиноводческих хозяйствах Краснодарского края. Испытания проводились по следующим показателям: увеличение среднесуточного привеса и их живой массы в конце эксперимента.
Положения выносимые на защиту:
Разработка эффективной питательной среды для изготовления жидкой формы симбиотического препарата.
Оптимизация состава защитной среды сохранения (ЗСС), используемой для изготовления жидкой формы симбиотического препарата.
-Технология изготовления жидкой формы симбиотического препарата.
-Результаты доклинических испытаний препарата.
-Результаты определения экономической эффективности при применение жидкой формы симбиотического препарата в свиноводстве.
Степень достоверности и апробация результатов. Для оптимизации технологического этапа приготовления защитных сред для сохранения симбиотического препарата использовали метод математического планирования: полный факторный эксперимент (ПФЭ) типа 2n, где n - число факторов. Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем – с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010.
Обработку результатов зоотехнических экспериментов (с числом повторов 3) проводили статистическим методом анализа и обработки данных - методом определения грубых ошибок («промахов»), а для определения эффективных доз симбиотика в свиноводстве использовали метод математического планирования эксперимента Гаусса – Зайделя.
Достоверность результатов подтверждена статистической обработкой данных в т.ч. методами математического планирования эксперимента: Гаусса – Зайделя и полного факторного эксперимента (ПФЭ) типа 2n, актами испытаний, расчетом экономического эффекта от внедрения технологии изготовления и апробации препарата.
Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на международной научно – практической конференции «Инновации как фактор развития АПК и сельских территорий – Смоленск, ФГБОУ ВПО «Смоленский ГСХА», 2013; научной конференции ВНИИПБТ «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов», - Москва,
2014; международной научно – практической конференции посвященной 45-летию ВНИТИБП, «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» - Щелково, 2014; международной конференции посвященной 85-летию Самарской научной – исследовательской ветеринарной станции Российской академии сельскохозяйственных наук «Актуальные проблемы развития ветеринарной науки» - Самара, 2014.
Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 13 научных работах, в том числе 6 статей в изданиях по перечню журналов, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций. По результатам исследований подана заявка на патент РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Результаты научных исследований соответствуют пунктам 2, 3, 4 и 11 паспорта специальности 03.01.06 и пунктам 2, 3, 9, и 14 паспорта специальности 06.02.02.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований; заключения; выводов; практических предложений; списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 148 источников, из которых 106 отечественных и 42 зарубежных авторов. В приложении представлены таблицы расчетов коэффициентов уравнений, копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимал личное участие в изготовлении и контроле опытных серий препаратов, в подготовке научных публикаций и разработке нормативных и методических документов.
Благодарности. Автор выражает благодарность директору ВНИТИБП, академику РАН, академику НААН Украины А.Я. Самуйленко; научным руководителям Павленко И.В. и Нежуте А.А., а также за оказанную практическую и консультативную помощь сотрудникам ФГБНУ ВНИТИБП А.И. Албулову, М.А. Фроловой, Е.Э. Школьникову, В.И. Еремцу, А.А. Раевскому, Т.А. Скотниковой, Л.А Неминущей, Л.Б. Соловьеву, Л.В. Анисимовой, Л.А. Коротеевой, директору ФКП «Армавирская биофабрика» Е.В. Сусскому.