Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Строение семенника и сперматогенез хряка in vivo 12
1.2 Способы выделения сперматогоний и их очистка
1.2.1 Флуоресцентно-активированная клеточная селекция, FACS 18
1.2.2 Магнитно-активированная клеточная селекция, MACS 19
1.2.3 Разделение клеток в различных градиентах плотности 20
1.2.4 Разделение клеток при помощи метода, основанного на различных адгезивных способностях клеток 23
1.3 Двухмерное культивирование ранних мужских половых клеток млекопитающих in vitro 26
1.3.1 Роль микроокружения в пролиферации и дифференцировке сперматогоний in vitro. Клетки Сертоли 26
1.3.2 Роль факторов роста в пролиферации и дифференцировке сперматогоний in vitro 30
1.3.3 Роль внеклеточного матрикса в пролиферации и дифференцировке сперматогоний in vitro 33
1.4 Трехмерное культивирование ранних мужских половых клеток млекопитающих in vitro 34
1.4.1 Трехмерное культивирование в гелях, представленных коллагеном, метилцеллюлозой, альгинатом кальция и мягким агаром . 35
1.4.2 Трехмерное культивирование в твердых порообразных матрицах 40
1.5 Заключение 43
2 Собственные исследования 45
2.1 Материалы исследований 45
2.1.1 Подготовка животных 45
2.1.2 Приборы и оборудование 48
2.1.3 Культуральные среды, растворы и реактивы
2.1.3.1 Ростовые среды 49
2.1.3.2 Специальные среды и растворы 49
2.1.4 Культуральная посуда 51
2.2 Методы исследований 52
2.2.1 Подготовка фидерного слоя 52
2.2.1.1 Выделение клеток Сертоли 52
2.2.1.2 Митотическая инактивация фидерного слоя 52
2.2.2 Выделение и очистка сперматогоний хряка 53
2.2.1.1 Механический метод выделения 53
2.2.1.2 Ферментативный метод выделения 53
2.2.1.3 Очистка сперматогоний хряка
2.2.3 Двухмерное культивирование сперматогоний хряка 56
2.2.4 Трехмерное культивирование сперматогоний хряка
2.2.4.1 Трехмерные матрицы для культивирования 56
2.2.4.2 Культивирование сперматогоний хряка в гелях 57
2.2.4.3 Культивирование сперматогоний хряка в твердых порообразных матрицах 59
2.2.5 Идентификация клеток хряка in vitro 59
2.2.5.1 Идентификация сперматогоний в культуре 59
2.2.5.2 Идентификация клеток Сертоли в культуре
2.2.6 Сравнительный анализ экспрессии генов 61
2.2.7 Анализ клеток в трехмерной системе 62
2.2.8 Определение доли жизнеспособных клеток 63
2.2.9 Криоконсервирование и хранение клеток 64
2.3 Результаты исследований 65
2.3.1 Выделение сперматогоний из семенников хряков: влияние метода разделения клеток на степень очистки сперматогоний от других типов клеток 65
2.3.2 Влияние клеток Сертоли на сперматогонии хряка в культуре 69
2.3.3 Трехмерное культивирование сперматогоний хряка
2.3.3.1 Оценка влияния материала матрикса и концентрации клеток на жизнеспособность сперматогоний хряка 76
2.3.3.2 Культивирования сперматогоний хряка в метилцеллюлозе
3 Обсуждение 91
4 Заключение
4.1 Выводы 100
4.2 Практические предложения
Список литературы
- Флуоресцентно-активированная клеточная селекция, FACS
- Трехмерное культивирование в гелях, представленных коллагеном, метилцеллюлозой, альгинатом кальция и мягким агаром
- Культуральная посуда
- Оценка влияния материала матрикса и концентрации клеток на жизнеспособность сперматогоний хряка
Введение к работе
Актуальность темы. Исследования сперматогенеза млекопитающих
ведутся давно и представляют интерес как с фундаментальной стороны – с целью
расширения понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе процессов
самообновления и коммитации сперматогониевых стволовых клеток (СпСК),
клеточной пролиферации и дифференцировки, так и с практической стороны
(Курило Л.Ф. и др. 2013, 2015; Руднева С.А. и др. 2014). Создание новых
клеточных моделей для использования в ветеринарии является одним из
перспективных направлений развития современной науки (Савченкова И.П. 1997).
Клеточные модели находят свое применение в биотехнологической и
фармацевтической промышленности при разработке, тестировании и
производстве новых медицинских препаратов (Самуйленко С.А. 2000). Известно, что многие вирусы обладают тропизмом к половым клеткам (Dejucq N. et al., 2001; Malolina Е.А. et al., 2014; Bramley J.C. et al., 2017). В связи с этим сперматогенные клетки хряка представляют собой новую клеточную систему для вирусологических исследований.
Возможность культивировать ранние мужские половые клетки и подвергать их дифференцировке для получения зрелых гамет in vitro, является актуальной задачей как для биологии, так и для ветеринарной и регенеративной медицины. Разработка и оптимизация условий поддержания сперматогоний также представляет интерес для сельскохозяйственной биотехнологии, в том числе для сохранении редких, исчезающих видов и создания трансгенных животных. Большой интерес трансгенные свиньи представляют в качестве перспективного материала для решения многих медико-биологических проблем (Брэм Г. и др., 1993; Эрнст Л.К. и др., 2002; Гринь С.А. 2008; Rodriguez-Sosa J.R. et al., 2009; Савченкова И.П. и др. 2009, 2012; Takehashi М. et al., 2010; Эрнст Л.К. и др., 2013). Инъекции полученных in vitro сперматозоидов в ооциты позволят создать генетически модифицированные эмбрионы и разработать эффективный метод получения трансгенных животных.
Известно, что сперматогенез в условиях in vivo происходит в трехмерной (3D) структуре, в извитых семенных канальцах мужских половых желез, при этом клетки Сертоли (КС) и внеклеточный матрикс (ВКМ) оказывают существенное влияние на выживаемость, пролиферацию и дифференцировку ранних половых клеток (Рузен-Ранге Э., 1980; Marret С. et al., 2000; Захидов С.Т. и др., 2010; Cheng C.Y. et al., 2010; Drumond A. et al., 2011; Коржикова С.В., 2002; Савченкова И.П., 2006, 2010, 2011; Полякова М.В., 2013; Iwamori N., 2014; Lucas Т. et al., 2014). Поэтому для успешной дифференцировки и пролиферации сперматогоний in vitro необходимо создать 3D-структуру, которая бы копировала нативную. В настоящее время 3D-условия культивирования ранних половых клеток считаются наиболее близко имитирующими микроокружение семенного эпителия. Создание данной системы позволит расширить понимание о взаимодействии между КС и ранними мужскими половыми клетками, между половыми клетками и ВКМ, а также позволит определить влияние этих взаимодействий на процесс сперматогенеза.
Степень разработанности. Для создания условий дифференцировки
сперматогоний in vitro разработаны и применяются несколько систем. Наиболее
перспективным является создание 3D-условий для культивирования. В качестве
компонента искусственной микросреды предложены: метилцеллюлоза
(Stukenborg J.B. et al., 2009; Huleihel M. et al., 2015), коллаген (Lee J.H., et al., 2006;
Lee J.H., et al., 2007; Noushafarin Khajavi et al., 2014), альгинат кальция (Lee D.R. et
al., 2001; Lee D.R. et al., 2006; Lim J.J. et al., 2014), мягкий агар (Stukenborg J.B. et
al., 2008; Abu Elhija M. et al., 2011; Huleihel M. 2012; Reda A. et al., 2014; Huleihel
M. et al., 2015), желатин и другие материалы. Ведутся исследования по созданию
трехмерной системы для культивирования сперматогоний грызунов. Было
продемонстрировано, что 3D-условия культивирования поддерживают
пролиферацию ранних половых клеток мышей и крыс, а так же способствуют их
дифференцировке до сперматид, и даже до получения единичных спермиев
(Stukenborg J.B. et al., 2008; Abu Elhija M. et al., 2011; Huleihel M., 2012). Эти
данные указывают на то, что 3D-условия культивирования представляют большой
потенциал для изучения механизмов, контролирующих дифференцировку мужских половых клеток. Создание 3D-условий культивирования сперматогоний сельскохозяйственных животных имеет неоценимое практическое значение.
Цель и задачи исследований. Цель исследования заключалась в изучении возможности трехмерного культивирования сперматогониевых клеток хряка in vitro. Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:
-
Выделить из тестикулов и очистить от других клеточных типов ранние половые клетки хряка;
-
Изучить влияние клеток Сертоли на сперматогониевые клетки хряка in vitro;
-
Провести сравнительный анализ влияния материала матрикса на жизнеспособность сперматогоний хряка при трехмерном культивировании;
-
Изучить влияние микроокружения на поддержание сперматогоний хряка при трехмерном культивировании.
Научная новизна исследований. В ходе выполнения диссертационной работы впервые разработан комбинированный метод разделения клеток тестикулов хряка с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте перколла с последующим разделением клеток по адгезии, который позволяет получить сперматогонии высокой степени очистки от других типов клеток.
Впервые было исследовано трехмерное культивирование сперматогоний хряка. Выявлены преимущества использования 2,5% геля метилцеллюлозы в качестве матрикса.
Впервые установлено, что клетки Сертоли играют важную роль в
поддержании сперматогоний хряка как в двухмерных (2D), так и в трехмерных
условиях культивирования. Показано, что клетки Сертоли способствуют
дифференцировке сперматогоний хряка в направлении сперматогенеза до стадии
удлиненных сперматид при совместном трехмерном культивировании в матриксе,
представленном 2,5% гелем метилцеллюлозы. Трехмерное культивирование
очищенных от других типов клеток сперматогоний хряка в матриксе,
представленном 2,5% гелем метилцеллюлозы способствует длительному
культивированию сперматогониевых клеток хряка без признаков
дифференцировки.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанный комбинированный метод разделения клеток, выделенных из ткани семенников хряка, позволяет получить популяцию клеток, состоящую на 99% из сперматогоний.
Полученные данные демонстрируют ключевую роль КС в дифференцировке ранних половых клеток хряка 2D- и 3D-условиях культивирования, и являются перспективным материалом для использования в регенеративной медицине: восстановление репродуктивной функции, изучение последствий действия повреждающих факторов окружающей среды, радио- и химиотерапии, патогенных микроорганизмов.
Получены новые знания по эффективности использования матриксов для трехмерного культивирования сперматогоний хряка. Разработанные методы трехмерного культивирования в матриксе, представленном 2,5% гелем метилцеллюлозы, позволяют поддерживать длительное время сперматогонии хряка in vitro (как с дифференцировкой, так и без дифференцировки) с целью дальнейшего применения их в клеточной и тканевой инженерии, вирусологии, ветеринарии и медицине.
Материалы диссертации использованы для разработки методических
наставлений по поддержанию ранних половых клеток хряка в двухмерной и
трехмерной системах культивирования. Данные системы позволяют
поддерживать длительное время сперматогонии хряка в культуре (как с дифференцировкой, так и без дифференцировки) с целью дальнейшего применения их в клеточной и тканевой инженерии, вирусологии, ветеринарии и медицине.
Методические приемы по получению и культивированию сперматогоний
могут быть использованы при выполнении научно-исследовательских работ
аналогичной направленности.
Основные положения работы, выносимые на защиту:
1. Комбинированный метод разделения клеток, выделенных из ткани
семенников хряков, позволяет получить популяцию клеток, состоящую на 99% из
сперматогоний.
2. Установлено положительное влияние клеток Сертоли на сперматогонии
хряка как в двухмерной, так и трехмерной системах культивирования.
3. Показано преимущество использования 2,5% геля метилцеллюлозы в
качестве матрикса для трехмерного культивирования сперматогоний хряка.
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на 10-й Всероссийской конференции-школы молодых ученых с международным участием «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, БиоТехЖ-2015», Дубровицы, ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2015 г.. А также неоднократно обсуждались и получили одобрение на Методической комиссии и Ученом совете ФГБНУ ВИЭВ (2014-2017 гг.). Результаты работы представлены на Международных научно-практических конференциях (2012, 2014 гг.), Московском Международном конгрессе (2013 г.) и Национальном конгрессе (2015 г.).
Автор является лауреатом стипендии Правительства Российской Федерации 2016 г., стипендии имени академика А.Х. Саркисова 2015 г. и стипендии имени академика Г.Ф. Коромыслова 2016 г.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 14 научных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. Опубликовано 2 методических наставления. Подана 1 заявка на изобретение.
Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы. Участие соавторов отражено в совместных публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 стр., содержит 5 табл., 26 рис. (в т.ч. 15 фотографий, 5 диаграмм), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных
результатов, выводы, список использованной литературы, приложение. Список литературы включает 196 источников, в т.ч. 154 на иностранном языке.
Благодарности. Диссертант выражает благодарность научному
руководителю доктору биологических наук, профессору И.П. Савченковой; за практическую помощь доктору химических наук, профессору В.И. Лозинскому (ИНЭОС РАН).
Флуоресцентно-активированная клеточная селекция, FACS
Получение культуры сперматогоний является важной задачей клеточной биологии. Возможность проведения различных манипуляций с этими клетками открывает для исследователей широкие перспективы для решения ряда практических задач. Однако существует ряд проблем при получении чистых популяций. Поэтому дальнейшие исследования по разработке способов получения сперматогоний по-прежнему остаются актуальными.
Выделение сперматогоний и их очистка от других типов клеток (очистка) являются обязательными первыми шагами для любых дальнейших манипуляций с данной популяцией клеток. На сегодняшний день используют несколько методов для разделения половых клеток семенника от соматических: флюоресцентно-активированная клеточная селекция (FACS) (Moudgal N.R. et al., 1997; Shinohara Т. et al., 2000; Izadyar F. et al., 2002; Gang B. et al., 2005; Lo K.C. et al., 2005; Noushafarin Khajavi, et al., 2014; Rotgers E. et al., 2015; Ana C. Lima et al., 2016), магнитно-активированная клеточная селекция, (MACS) (Schonfeldt V.V. et al., 1999; Stukenborg J.B. et al., 2008; Noushafarin Khajavi, et al., 2014; Park M.H. et al., 2014; Valli H. et al., 2014), центрифугирование в градиенте плотности (Peh A.M.M. et al., 1996; Marret C. et al., 2000; Izadyar F. et al., 2002; Koh K.B. et al., 2004; Goel S. et al., 2007; Herrid M. et al., 2009; Kim B.G. et al., 2010; Yang Y. et al., 2010; Yang Y. et al., 2011; Liu S. et al., 2011; Wang X. et al., 2015), разделение клеток при помощи метода, основанного на различных адгезивных способностях клеток (Коржикова С.В., 2002; Савченкова И.П. и др., 2000, 2006, 2010, 2011, 2016; Herrid M. et al., 2009; Савченкова И.П., 2012; Полякова М.В., 2013).
Флюоресцентно-активированная клеточная селекция (FACS) FACS является одним из типов проточной цитометрии, в котором мишени (клетки, индивидуальные хромосомы и т. п.) мечены флюоресцентным ДНК красителем, возбуждаемым лазерным излучением. Флюоресценция регистрируется фотоумножителем, полученная информация обрабатывается и выводится на монитор в виде двухмерного или трехмерного графика. Разделение осуществляется на флюоресцентно-активирующем сортере клеток. Он представляет собой прибор, который использует флюоресцентный сигнал каждой клетки для сортировки клеток в одну из пробирок для сбора образцов и в резервуар для слива. Критерием для сортировки материала служат различия в эмиссии флюоресцентного сигнала (Vaughan A. et al., 1989, Заид А. и др., 2008; Фрешни Р.Я., 2010). В настоящее время этот метод позволяет выделить 9 типов ранних мужских половых клеток. FACS применяют для изоляции различных типов сперматогоний у разных видов, например у мышей (Shinohara Т. et al., 2000; Lo K.C. et al., 2005, Noushafarin Khajavi, et al., 2014), быков (Izadyar F. et al., 2002), обезьян (Moudgal N.R. et al., 1997) и человека (Valli H. et al., 2014), на данный момент проводятся исследования по адаптации этого метода для морских свинок, собак и домашних карликовых свиней. Ана Лима с коллегами успешно выделили 3 популяции клеток из зародышей этих видов со средней степенью очистки: сперматоциты – 79%, сперматиды – 90% и сперматогонии – 66% (Ana C. Lima et al., 2016). Очевидно, что FACS может быть ценным инструментом для разделения различных типов клеток и, тем не менее, существуют определенные проблемы при работе с СпСК. Данный метод имеет ряд недостатков – большое количество клеток, изначально необходимое для выполнения FACS; потеря клеток во время процедуры сортировки; снижение жизнеспособности клеток после разделения и расходы на приобретение оборудования. Несмотря на эти проблемы, FACS используется во многих областях исследований, в том числе в области репродукции.
MACS – метод разделения клеток с помощью присоединения к ним определенных антител, которые фиксированы на магнитных микрогранулах (микрочастицах). Клеточную суспензию смешивают с микрогранулами с иммобилизированными антителами, разбавляются и наносятся на магнитную разделительную колонку. Ассоциированные с микрогранулами клетки связываются с ферромагнитными шариками колонки, в то время как несвязанные клетки выходят из колонки, не задерживаясь. При удалении колонки из магнитного поля связанные клетки освобождаются от носителя и выдавливаются из колонки с помощью поршня. Разделение клеток с помощью MACS используется во многих видах исследований, включая исследование половых клеток (Фрешни Р.Я., 2010). В настоящее время существуют успешные работы по получению культуры клеток, обогащенной СпСК мыши, обезьяны, хомячка, свиньи и человека (Schonfeldt V.V. et al., 1999; Hofmann M.C. et al., 2005; Stukenborg J.B. et al., 2008; Noushafarin Khajavi, et al., 2014; Park M.H. et al., 2014; Valli H. et al., 2014). В целом, при использовании MACS удается получить клеточную популяцию, обогащенную СпСК, но объем полученных клеток при этом невелик. Счонфилдт с коллегами использовали метод MACS при выделении сперматогоний из тестикул джунгарских хомяков, мышей и обезьян. Полученная клеточная суспензия на 25-55% состояла из сперматогоний, при этом жизнеспособность составила 80-90% (Schonfeldt V.V. et al., 1999). MACS является наиболее широко используемый метод в настоящее время. Это простой и недорогой метод, но требующий наличия определенного оборудования и конкретных маркеров СпСК (Aponte P.M., 2015).
Трехмерное культивирование в гелях, представленных коллагеном, метилцеллюлозой, альгинатом кальция и мягким агаром
Для каждого из исследуемых мишеней готовили индивидуальную реакционную смесь (для проведения ПЦР в реальном времени) в объеме 25 мкл, которая включала: 5 мкл матрицы кДНК (5-20нг), 1-кратный реакционный буфер ПЦР-смесь-2-FRT (Амплисен, Россия), 1 ед. Taq-F-полимеразы (Амплисен, Россия), 200 мкМ каждого из дНТФ (R0191, Fermentas), по240 нМ прямого и обратного праймера (Литех, Россия) и 120 нМ зонда (Синтол, Россия). Каждый зонд с 3-концевого нуклеотида был конъюгирован флуоресцентным красителем FAM, а в качестве тушителя использовали RTQ1. Реакцию проводили на приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия). Температурный профиль амплификации был следующим: 95С – 15 мин (предварительная денатурация и активация Taq-F-полимеразы), затем 50 циклов 95С – 20 с, 60С – 20 с (детекция флуоресцентного сигнала), 72С – 20 с.
Ct-метод. Уровень мРНК и количество копий генов оценивали в режиме относительных измерений (Ct-метод) (Livak K.J. et al., 2001). Относительный уровень мРНК (R) представляет собой изменение содержания копий нуклеотидной последовательности (транскрипта) каждого гена в клеточных популяциях, полученных при культивировании в различных условиях in vitro, по сравнению со свежеизолированными из тестикул 60 сут возраста хряков той же породы, относительно контрольного гена. Значение R рассчитывали по формуле, учитывающей эффективность ПЦР-РВ: R = ( (1+EA)CtlT (1+ER)Ct2N ) / ( (l+EA)Сt3 N (l+EB)Ct4T ) где R – изменение количества копий кДНК/ДНК, ЕА – эффективность реакции для исследуемого гена, Ев – эффективность реакции для контрольного гена, N – норма, Т – эксперимент, Ctl-Ct4 – пороговые циклы.
В связи с тем, что метилцеллюлоза обладает высокой растворимостью при комнатной температуре, очистку клеток от метилцеллюлозы проводили трехкратным промыванием с использованием ФСБ-2 в соотношении 1:3 и осаждением центрифугированием (200g, 5 мин). Морфологическую оценку нативного препарата проводили визуально на инвертированном микроскопе «Carl Zeiss» (Германия) с программным обеспечением Axio Vision Rel. 4.8. Для более детального анализа готовили мазки и гистологические препараты. Полученные препараты оценивали без окраски и с окраской по Романовскому-Гимза.
Пролиферацию оценивали по продолжительности клеточного цикла и определяли на основании данных о времени удвоения количества клеток. Для этого клетки отмывали от метилцеллюлозы, загружали в камеру Горяева и подсчитывали. Среднее время удвоения количества клеток рассчитывали по формуле: td = t/log2 (N1/N0), где td – время удвоения количества клеток; t – время между начальным и конечным подсчетами количества клеток; N0 и N1 – количество клеток в начале и конце эксперимента соответственно (Узбеков Р.Э., 2004).
Долю жизнеспособных клеток в суспензии определяли путем витального окрашивания суспензии 0,1% водным раствором трипановой сини, с последующим подсчетом количества окрашенных и неокрашенных клеток в счетной камере Горяева. Раствор красителя добавляли к суспензии клеток в соотношении 1:1. При данном способе окрашивания живые клетки не окрашиваются, а мертвые окрашиваются всиний цвет. Процент жизнеспособных клеток в суспензии определяли по формуле: X = (a – b) / а 100 % , где X – процент жизнеспособных клеток, а – общее количество клеток во всех квадратах камеры Горяева, b – количество мертвых (окрашенных в синий цвет) клеток во всех квадратах камеры Горяева. 2.2.9 Криоконсервирование и хранение клеток Криоконсервирование и хранение клеток проводили в криозащитной среде, состоящей из среды ДМЕМ, СКПК и ДМСО. Сразу после изоляции клеток, их жизнеспособность была оценена. Сперматогонии хряка замораживали после очистки от соматических клеток. Для этого клетки собирали с поверхности чашек Петри стерильной пипеткой-грушей, добавляли питательную среду ДМЕМ, ресуспендировали, помещали в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 5 мин, 200 g. Надосадочную жидкость сливали, а осадок клеток ресуспендировали в минимальном объеме питательной среды. Подсчитывали концентрацию клеток в суспензии и разводили ее криопротекторной средой до концентрации 1х106 кл/мл. При этом криопротекторную среду добавляли по каплям, в течение 1-2 мин, а после осторожно смешивали путем встряхивания пробирок, для оценки жизнеспособности брали образец суспензии. Взвесь клеток разливали в криопробирки типа объемом 1,8 и 2 мл, которые ставили в холодильник при температуре 4С для эквилибрации в течение 15-20 мин. Криопробирки помещали в специально приспособленный ящик из пенопласта и плотно закрывали.
Дальнейшее замораживание клеток проводили по двухступенчатому режиму понижения температуры: от 0С до -40С – со скоростью 1С/мин, от-40С до -80С – со скоростью 4-6С/мин. Охлажденные до -80С криопробирки с клеточной суспензией помещали в сосуд Дьюара с жидким азотом при -196С.
Для восстановления культуры клеток криопробирки извлекали из сосуда Дьюара и быстро размораживали при температуре +37С. В культуральный флакон наливали ростовую средуи помещали в него клеточную суспензию, слегка помешивали. Через 24 ч культивирования производили смену среды с целью удаления криопротектора.
Культуральная посуда
Часть сформированных суспензионных кластеров сперматогенных клеток, сформированных на 10 сут, продолжили культивировать без фидерного слоя. На 3-5 сут наблюдали формирование жгутика у всех клеток, что свидетельствует об их дифференцировке в удлиненные сперматиды. Через 7 сут культивирования в этих условиях процесс формирования спермиев останавливался. Можно предположить, что условия культивирования, используемые нами, были недостаточны для завершения процесса дифференцировки, и на этом этапе требуется дополнительное введение в ростовую среду гормонов и ростовых факторов.
Клеточные клоны, сформированные на 10 сут мы проанализировали на экспрессия генов-маркеров фенотипа первичных половых клеток, Nanog и Plzf. В таблице 4 представлен график, отражающий экспрессию исследуемых генов в клонах, полученных при культивировании на КС in vitro, по сравнению со свежеизолированными клетками, выделенными из тестикул 60-суточных хряков той же породы, относительно контрольного гена. В результате было обнаружено, что экспрессия гена Nanog в клонах, культивируемых на КС, была в 200 раз выше, чем у свежеизолированных сперматогоний хряка. Ген Nanog экспрессируется специфично в полипотентных стволовых клетках (Chambers I. et al., 2003). Его экспрессия выявлена в первичных половых клетках поросят (Goel S. et al., 2008). Одинаковый уровень экспрессии гена Plzf был выявлен в свежеизолированных сперматогониях и в клонах, формируемых при совместном культивировании сперматогоний и КС хряка. Считается, что ген Plzf играет ключевую роль в самообновлении и поддержании пула стволовых сперматогониевых клеток. Ранее было показано, что ген Plzf является маркером гоноцитов и СпСК свиней (Buaas F.W. et al., 2004; Goel S. et al., 2008). В наших экспериментах обнаружение экспрессии этого гена в сперматогониевых клетках хряка, учитывая возраст животного, может свидетельствовать о наличии в них популяции СпСК.
Полученные нами результаты показывают, что использование КС на начальных этапах культивирования сперматогоний хряка способствует пролиферации сперматогоний и их последовательной дифференцировке до стации удлиненной сперматиды без добавления в культуру других факторов в течение 33 сут. При более длительном культивировании сперматогоний хряка на КС, происходит процесс дифференцировки половых клеток и формирование на 30-33 сут единичных подвижных спермиев хряка. Наши данные согласуются с данными, полученными у грызунов. Было показано, что взаимодействия между КС и сперматогониями очень важны (Rivarola M.A. et al., 1986). К числу ростовых факторов, продуцируемых этими клетками, относятся стволовой фактор роста, активин, инсулиноподобный фактор роста 1, трансформирующий фактор роста, фактор роста семенных канальцев или семенников и ростовой фактор, секретируемый самими КС. Функция этих факторов в сперматогенезе остается неизвестной. Часть факторов и цитокинов продуцируются клетками Лейдига и миоидными клетками, расположенными вокруг семенных канальцев, а также тестикулярными макрофагами, которые могут оказывать влияние на пролиферацию и дифференцировку сперматогоний тоже. В последнее время накапливаются данные о том, что КС продуцируют GDNF (Oatley J.M. et al., 2007). Считается, что в тестикулах ФСГ стимулирует продукцию КС GDNF, который является ключевым фактором для поддержания функции сперматогоний.
Проведенные нами эксперименты выявили важное значение КС для поддержания сперматогенеза хряка in vitro. Полученные результаты указывают на способность КС без стимуляции гормонами продуцировать факторы in vitro. Однако, в культуре в незначительном количестве могут находиться и другие соматические клетки, которые являются индуктором для КС, например миоидные клеткиил и клетки Лейдига.
Наши данные демонстрируют, что тесный контакт сперматогоний хряка и КС, может стимулировать их дифференцировку в направлении сперматогенеза с последующим формированием спермиев и способствовать получению половых клеток хряка in vitro. Анализ литературных данных показал, что микросреда, которая напоминает 3D организацию семенных канальцев, обеспечит наиболее тесный контакт ранних половых клеток хряка и КС, что создаст идеальные условия для завершения сперматогенеза in vitro (Lee J.H., et al., 2006.; Lee J.H., et al., 2007; Stukenborg J.B. et al., 2008; Stukenborg J.B. et al., 2009; M. Abu Elhija et al., 2011; Huleihel M., 2012; Reda A. et al., 2014; Huleihel M. et al., 2015). Пролиферация и дифференцировка сперматогоний является комплексным, упорядоченным процессом, в который вовлекаются различные регуляторные факторы и межклеточные взаимодействия. Для успешного культивирования и дифференцировки ранних половых клеток, помимо факторов роста и наличия соматических клеток, необходимо создание пространственной структуры, в которой возможно воспроизведение последовательности процессов, происходящих в семенных канальцах in vivo. Имеются сообщения, согласно которым в качестве трехмерного матрикса можно использовать твердые пористые или волокнистые матриксы. В настоящее время были протестированы в качестве твердых матриксов: PLLA нановолокно из ПЛМК и коллагена (Eslahi N. et al., 2013); человеческий сывороточный альбумин и наночастицы фосфата кальция (Yadegar M. et al., 2015), синтетические нановолокна, состоящие из полиамидных нанонитей (Shakeri M. et al., 2013), коллагеновые губки (Reuter К. et al., 2012; Reuter К. et al., 2014), макропористые биоразлагаемые матриксы из D, L-молочной и гликолевой кислот (Lee J.H. et al., 2011). Формировались колонии, выживаемость которых варьировалась в пределах 70% при краткосрочном культивировании. Дифференцировка была показана только в исследовании Неда Еслахи.
Оценка влияния материала матрикса и концентрации клеток на жизнеспособность сперматогоний хряка
Исследования по изучению сперматогоний в культуре ведутся уже на протяжении ряда лет, однако до сих пор существует актуальность в разработке наиболее оптимального метода очистки сперматогоний от других клеточных типов. Для разделения половых от соматических клеток семенника используются разные методы, такие как: флюоресцентно-активированная клеточная селекция (FACS) (Moudgal N.R. et al., 1997; Shinohara Т. et al., 2000; Izadyar F. et al., 2002; Lo K.C. et al., 2005; Noushafarin Khajavi, et al., 2014; Rotgers E. et al., 2015; Ana C. Lima et al., 2016), магнитно-активированная клеточная селекция, (MACS) (Schonfeldt V.V. et al., 1999; Stukenborg J.B. et al., 2008; Noushafarin Khajavi, et al., 2014; Park M.H. et al., 2014; Valli H. et al., 2014), центрифугирование в градиенте плотности (Peh A.M.M. et al., 1996; Marretand Durand, 2000; Izadyar F. et al., 2002; Koh K.B.et al., 2004; Gang B. et al., 2005; Goel S. et al., 2007; Herrid M. et al., 2009; Kim B.G. et al., 2010; Yang Y. et al., 2010; Yang Y. et al., 2011; Liu S. et al., 2011; Heidari B. et al., 2014; Wang X. et al., 2015), разделение клеток при помощи метода, основанного на различных адгезивных способностях клеток (Коржикова С.В., 2002; Herrid M. et al., 2009; Савченкова И.П., 2012; Полякова М.В., 2013). Двухэтапное разделение по адгезии, предложенное Савченковой И.И. и Поляковой М.В., позволило добиться получения популяции клеток, состоящей на 99% из сперматогоний типа А. Одна из широко используемых в настоящее время схем очистки половых клеток от соматических основана на использовании высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности. Данный метод был предложен в 1977 г. Беллвом с колл. В результате центрифугирования в градиенте плотности БСА исследователи получили на 90% очищенную фракцию сперматогоний типа А мыши (Bellve A. et al., 1977). Единственным отрицательным моментом является низкая жизнеспособность полученных сперматогоний. Важным положительным моментом в использовании данного метода, является его стоимость, которая значительно ниже, чем стоимость оборудования, необходимого для MACS или FACS. В связи с этим в настоящее время данная схема применяется исследователями в качестве основы с добавлением собственных модификаций. В качестве градиента плотности были использованы менее токсичные вещества - перколл и Найкоденз. Эти среды позволяют получать клеточную популяцию на 78% - 90% обогащенную сперматогониями. Перколл был использован для разделения сперматогоний разных стадий, полученных от молодняка и половозрелых хряков (Marret C. et al., 2000; Goel S. et al., 2007; Kim B.G. et al., 2010), КРС (Izadyar F. et al., 2002; Herrid M. et al., 2009), козла (Heidari B. et al., 2014), крыс и мышей (Peh A.M.M. et al., 1996; Koh K.B. et al., 2004), а также человека (Gang B. et al., 2005; Liu S. et al., 2011). Найкоденз в настоящее время активно изучается в качестве градиента плотности с целью очистки половых клеток хряка (Yang Y. et al., 2010; Yang Y. et al., 2011; Wang X. et al., 2015).
Мы для получения популяции клеток, максимально обгащенной сперматогониями хряка, использовали комбинированный метод разделения клеток, основанный на высокоскоростном центрифугировании в ступенчатом градиенте концентраций 27% и 35 % перколла по методике Ганга (Gang B. et al., 2005), с последующим разделением клеток по адгезии. Согласно литературным данным сперматогонии имеют наименьшую, по сравнению с другими клеточными типамисеменника, способность к адгезии (Dirami G. et al., 1999; Савченкова И.П. и др., 2000, 2006, 2010, 2011, 2016; Савченкова И.П. 2012; Izadyar F. P. et al., 2001; Полякова М.В., 2013). В результате такой комбинированной очистки нами была получена клеточная популяция, на 99% представленная сперматогониями хряка. Связывание полученных клеток антителами против CD45 продемонстрировало отсутствие в клеточной популяции клеток крови, которые, как и сперматогонии, обладают низкими адгезивными свойствами. Предложенный нами метод позволяет получить такую же степень очистки, как и в методе предложенном Поляковой М.В., но за более короткий промежуток времени.
Целью нашей работы было изучить влияние КС на сперматогонии хряка in vitro и их способность индуцировать дифференцировку. Считается, что важную роль в поддержании сперматогониевых клеток играют ростовые факторы (De Rooij D.G. et al., 2008), среди них выделяют GDNF, SCF, LIF, FGF, EGF. Многие из этих факторов продуцируют соматические клетки тестикул млекопитающих. Паракринная регуляция осуществляется на уровне гонад и включает сеть взаимодействий между основными клетками семенника: КС, клетками Лейдига, перитубулярными мышечными клетками и половыми клетками, расположенными в семенном канальце и, возможно, клетками кровеносных сосудов. Согласно современным представлениям, регуляция самообновления и дифференцировки сперматогоний – сложный процесс, в котором важную роль играют КС. Они являются своеобразными медиаторами взаимодействий между соматическими и половыми клетками организма.
КС воспринимают регуляторные сигналы как со стороны соматических, так и со стороны половых клеток и в ответ на них синтезируют факторы, которые, с одной стороны, поддерживают развитие половых клеток, а с другой, образуют обратную связь, как на уровне гонады, так и на уровне всей гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси в целом. Считается, что КС играют ключевую роль в детерминации мужских половых стволовых клеток и их дифференцировке в направлении сперматогенеза (Chen S.R. et al., 2015). В различных исследованиях in vitro было показано, что культивирование ранних мужских половых клеток в присутствии КС и гормонов приводит к индукции постмейотического развития и созреванию сперматоцитов или сперматид (Lee D.R. et al., 2001; Sousa M. et al., 2002). Тезарик с соавторами (Tesarik J. et al., 2000) показали, что культивирование половых клеток человека на КС способствует запуску сперматогенеза в течение короткого периода культивирования. Было продемонстрировано, что наличие этих клеток необходимо для успешной дифференцировки сперматогоний человека в спермии in vitro (Sofikitis N. et al., 2005).