Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ БИОРАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ - ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (БАВ)
1.1. Основные направления в использовании микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в науке и народном хозяйстве
1.2. Особенности и преимущества микроорганизмов экстремальных условий обитания в качестве продуцентов биологически активных веществ
1.3. Сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции (ЭР) - этимологический инструментарий молекулярной биологии
1.4. Микроорганизмы в процессах деградации и трансформации веществ 23
1.5. Антагонистическая активность микроорганизмов 25
1.6. Инсектицидная активность микроорганизмов 27
1.7. Антимикробная активность штаммов Bacillus thuringicnsis ЗО
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Источники отбора образцов для выделения микроорганизмов 33
2.2. Методы выделения и идентификации микроорганизмов 33
2.3. Условия культивирования штаммов-продуцентов БАВ 35
2.4. Определение наличия и специфичности ЭР в штаммах микроорганизмов 36
2.5. Скрининг микроорганизмов на продукцию полисахаридгидролаз 37
2.6. Геномный анализ штаммов микроорганизмов 37
2.7. Анализ профиля жирных кислот 38
2.8. Идентификация, определение инсектицидной и антимикробной активностей штаммов Bacillus thuringicnsis (Bt) 39
2.8.1. Определение инсектицидной активности штаммов Bt 39
2.8.2. Определение антимикробных свойств водорастворимых метаболитов
39 штаммов Bt
2.8.3. Определение антимикробной активности растворенных дельта-
эндотоксинов 40
2.8.4. Определение противовирусной активности штаммов Bt 41
2.8.5. Определение состава белков параспоральных включений штаммов Bt 42
2.9. Определение патогенносте штаммов микроорганизмов 42
2.10. Хранение и поддержание штаммов 42
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА. 3. РАЗНООБРАЗИЕ И ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРИРОДНЫХ ИСТОЧНИКОВ 43 48
3.1. Разнообразие, ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов почвы, воды и осадков Долины гейзеров (Камчатка)
3.2. Разнообразие, ферментативная и антибиотичекая активность микроорганизмов аэрозолей воздуха
3.3. Психрофильные бактерии льда Антарктиды, выделение, идентификация, ферментативная активность
3.4. Разнообразие и ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов осадков глубокого бурения дна оз. Байкал
3.5. Новые виды микроорганизмов, выделенные из природных образцов 59
3.5.1. Грамотрицательные, образующие эндоспоры, бактерии рода Paenibacil-
lus, выделенные из почвы и источников Долины гейзеров 59
3.5.2. Образующая эндоспоры грамотрицательная эубактерня Brevibacilliis barguzinii sp. nov., выделенная из термального источника 68
3.5.3. Roseomonas baikalica sp. nov. - новый вид микроорганизма, выделенного из образца керна глубокого бурения дна озера Байкал 72
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ (ЭР) 77
4.1. Штамм Paenibacillns sp. Dg-1009 - продуцент изошизомера ЭР Psp 10091, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GCCNNNNNGGC -3' 78
4.2. Азотофиксирующие микроорганизмы рода Rhizobium, продуценты ЭР 81
4.2.1. Идентификация штаммов, скрининг на наличие ЭР 81
4.2.2. Штамм R.leguminozarum R-69, продуцент ЭР Rle 691 83
4.2.3. Штамм R. trifolii R-63, продуцент ЭР Rtrl 84
4.2.4. Штамм R. meliloti 21, продуцент ЭР Rme21I 85
4.2.5. Штамм R. trifolii 20, продуцент ЭР Rtr20I 86
4.3. ВтеЗбП — новая сайт-специфическая ЭР II типа из штамма Bacillus megaterium 361 87
4.4. Психрофильный штамм Acinetobacter sp. ОК-103р - продуцент ЭР
Asp 1031, узнающей нуклеотидную последовательность 5'- GGATCC-3' 90
4.5. Штамм Klebsiellae pneumoniae 378- продуцент ЭР Крп3781 92
4.5.1. Идентификация штамма К. pneumoniae 378, определение специфичности ЭР 92
4.5.2. Селекция штамма К. pneumoniae 378 по технологически важным признакам 96
4.6. Штаммы термофильных бактерий вида Bacillus stearothermophihts - продуценты изошизомеров ЭР BstEII и BsiYI 99
4.6.1. Штаммы В. stearothermophihts Т-10 и Т-9 - продуценты изошизомера ЭР BstEII 100
4.6.2. Штамм В. stearothermophilus Т-22 - продуцент изошизомера ЭР BsiYI. 102 ГЛАВА 5. АНТИМИКРОБНАЯ И ИНСЕКТИЦИДНАЯ АКТИВНОСТИ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS THURINGIENSIS
5.1. Идентификация и биотестирование штаммов Bt, выделенных из аэрозолей воздуха и осадков Байкала 104
5.2. Атипичные штаммы Bt, выделенные из почвы, воды и осадков горячих источников Долины Гейзеров 107
5.2.1. Идентификация штаммов 107
5.2.2. Антимикробная активность штаммов 113
5.2.3. Противовирусная активность штаммов. 115
5.2.4. Гепотипирование штаммов 116
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 118
ВЫВОДЫ 125
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 127
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 141
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 146
- Основные направления в использовании микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в науке и народном хозяйстве
- Источники отбора образцов для выделения микроорганизмов
- Разнообразие, ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов почвы, воды и осадков Долины гейзеров (Камчатка)
Введение к работе
Лкт>'алы10сть исследования. Микроорганизмы и нродук1ы их жизнедеятс;п.ности
я)5Л51101ся наиболее доступными и рентабелы1ыми источниками ферментов и многих других биологически активных веществ (БАВ), необходимых для иромытленности и научных исследований. Продуцируемые микробными клеткалш ферменты, такие как липазы, протеазы, амилазы, эпдонуклсазы рестрикции, экзонуклеазы, фосфатазы и др., находят nuipoKoe применение в биотехнологии. Экстремофильные микроорганизмы обладают фермент(П11лн1 cиcтeмa^нl, продуцирующими биологически активные веи1,ества, проявляюпп1е активность в более широком диапазоне температур и рН среды по сравнению с мезофильнылп! прототипами, благодаря чему имеют особое значение для биотехнологии (Бoич-Oc^юлoвcкaя, 2004; Бонч-Осмоловская, Мирошниченко и др., 2004; Гальчснко, 2005). Экстремофилы являются также ценным источником генов, обесиечиваюпц1х возможность создания рекомбинантных суперпродуцентов с расширенными возможностями (Pecigou et al., 2001; Bell et al., 2002; Robertson, Steer, Успешное развитие молекулярной биологии, ген1юй инженерии и их прикладных направлений невозможно без нши1чия эидонуклеаз рестрикции (ЭР) - эизпмологичсского инструментария, способного специфически фрагментировать и модифицировать нуклеиновые кислоты (Roberts et al., 2002). Большое внимание уделяется поиску новых продуцентов сайт-специфических ЭР, легко культивируемых, высокопродуктивных штамлюв, продуцируюин1х ферменты с новой специфичностью, или же более технологичных продуцентов ЭР извест1юй спсцифичпости.
Микроорганизмы применяются для запп1ты и очистки окружающей срсщл от нефтяных и других загрязнителей с использова1П1ем аборигенных или иривнесенпых микроорганизмов-деструкторов (Стабникова и др., 1995; Коронелли, 1996; Барьппникова и др., 2001; Киреева и др., 2004), а также для борьбг !^ с насекомылп1-вредителя1\т ccjn.cKoro и лесного хозяйства. Более всего, как основа биопрепаратов инсект1щидного назначения, используются штамлп,! Bacillus thiiringiensis (Bl) (Шехурина, 1963; Grimont el al., 1998; Глупов, 2001; Rampersad, Amnions, 2005). Энтомонатогенная активность, a также действующее начшю биоинсектицидов на основе Bl обусловлены, преимун1ественно, присутствием параспорати^ных включений, состоящих из бе;н<ов, извест1н,1х как инсектицидные Сгу-белки или дельта-эндотоксины. Эндотоксины отличаются между co6oii гю спектру инсектицидной активности. Раз;п1чные подвиды Bl обладают избирательным действием не 'юлько в отноиюнии насекомых, но и микрооргашпмов.
Несмотря на известное разнообразие Сгу-бслков обнаружение новых продуцентов энтомонатогенных токсинов актуально, так как значительное число вредителе!! не контролируются доступными Сгу-белками (Глупов, 2001; Rampersad, Aminons , 2005).
Для обеспечения прикладных и фундаментатн,ных исследований чрезвычайно важным является своевременное сохранение полученных продуцентов и пополненнс генофонда коллекций культур новыми охарактеризованными штаммами микроорганизмов, депонирование и гарантированное хранение производственно важных штаммов. По данным 5-го издания Всемирного справочника коллекций культур микроорганизмов (Sugawara et al., 1999) в мире уже насчитывалось около 500 зарегистрированных коллекций различного профиля и содержания. Коллекции являются центрами сохранения и изучения м1Нфобного разнообразия, депонирова1Н1Я нггaм^юв, ИМСЮНН1Х значение для производства медицинских и ветеринарных препаратов, разработки штаммов, перспективных для биотехнологичес1сого применения (Ившина, 1994; Родичева и др., 1998; Синеокий, Агранович, 2001).
Из Bbmie сказанного следует, что создание базовой коллекции природных микроорганизмов в качестве основы для разработки новых препаратов БАВ является своевременной и актуальной задачей.
Цель и задачи псследонания. Цель настоящей работы состояла в выделении и изуче1нн1 микроорганизмов из различных природных источников, создании базовой коллекции микробных изолятов для выявления новых продуцентов БАВ, перспективных для разработок биотехнологичсских препаратов.
Задачи исследования:
1. Выделить iNHiKpo6Hoc разнообразие образцов почвы, воды и донных осадков водоемов различных природных территорий, включая экстремшн>ные, создать коллекцию тер\юфильных, мезофи]ня1ЫХ и психрофильных природных микробных изолятов.
2. Провести скрининг выделенных Анжроорганизмов на наличие фсрмен'гат1И1но11 и антибиотической активностей.
3. Выявить активные продуценты БАВ, перспективные для бнoтexнoJЮIтпl, определить их таксоно\и1ческую принадлежность.
4. Провести сслек1нно по выделению наиболее активных cy6KyjH/iyp продуцентов, оптимизировать условия культивирования.
5. Составигь коллекцию штаммов Bacillus thurmgiensis, нровссти оценку их инсектицидной н антибиотической активностей.
Научная новизна работы. Из природных образцов, отобранных из раз]И1чных экологических ниш, выделено 6938 новых микробных изолятов, представленных мезофпльными, термофилы1ЫМИ и психрофильными бактериялт. Обнаружены и иде}ггифицированы новые виды микроорганизмов родов Paenibacillus, Brevibacilliis, Roseomonas, не имеющие аналогов в доступных базах да1и1ых. В резу;н>тате CKpinninra выделенных изолятов на наличие амилолитичсской, фосфатазно!!, эндонуклсазной и другой ферментативно!! активности, выявлены высоко продуктивные iHTaMMbi.
сохраняющих способность к росту п продукции БАБ в широком диапазоне температур и рМ среды. Среди бактерий родов Rhizobhmi, Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Micrococcus и др. обнаружены новые продуценты эидонуклеаз рестрикции (ЭР), имеющие преимущества относительно ранее известных прототипов и нх изошизомеров. Выделены HOBbie штаммы, относящиеся к Bacillus thwingiensis ssp. kiirstaki, В. thwingiensis ssp.
galleria, обладающие высокой активностью относительно ряда патогенных микpoopгaниз^юв и комаров Aedes aegypti. Обнаружены атипичные, не1тсект1щид1и>1е штамхмы В. thwingiensis, проявляюиц1е выраженный антагонизм по отношению к патогенным бактериям кишечно11 группы и Candida albicans, эффективно подавляющие размножение вируса A/(M5N1) на клетках МОСК. Выявленные признаки позволяютсчитать их подвидами Bl, ранее не представлепнылш в базах данных.
Практическая значимость. Основная часть полученно!! коллекции представлена микроорганизмами экстремалыи^гх условий обитания, что позволяет прогнозировать выделение новых продуцентов БАВ, активных в ннфоком диапазоне рН и температуры культивирования. Исследование и использование генов выделенных 1%п1кроорганпзмовэкстремофилов имеет значение для конструирования штамлюв с более итрокими возможностями применения в биотехнологии. Вновь выделенные изошизомер!»! ЭР, обладающие рядом преимуи^еств, в сравнении с ранее известными ферментамипрототипами и их нзошизомерами, могут заменить эти ЭР в прово;п1мых генноинженерных работах. Выделенные из аэрозолей воздуха и осадков Ба^псала высоко инсек'пщидные штаммы В. thwingiensis ssp. kiirstaki и В. thwingiensis ssp. galleria пригодны в качестве основы энтолюпатогенных препаратов токсичных для комаров Aedes aegypti и для разработки антили1кробных средств, направленных против ряда патогенных
1\п1кроорганиз1%юв. Атипичные штаммы В. thwingiensis Долины гейзеров интересны как для фундаментальных исследований в области систематики бацилл, так и для разработки эффективных антимикробных и противовирусных препаратов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на 28 Всероссийских и Международных конференциях, в том числе: Fourth USA/CIS Joint Conference on Environmental Hydrology and Hydrogeology (San Francisco, California, 1999),
23d Biotechnological Symposium for Fuels and Chemicals (Brcckcnridge, 2001), 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы разв1ггия» (Москва, 2002), International Conference «Microbial diversity: cun-ent situation, conservation strategy and biotechnological potentialities ICOMID-2005» (Pcrm-Kazan-Pcrm, 2005), 9"' International Colloquium in Invertebrate Pathology and Microbial Control, 39" Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology and 8"' International Conference on Bacillus thuringiensis (China, 2006), II International conference «Biospheere Origin and Evolution» (Loutraki, 2007), Международной научно-нрактическо!! конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 2008), IV Международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008) и др.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 26 статей, получено 9 патентов РФ. Вклад автора. Автору принадлежат постановка задач, выполнение работ по выделению и идентификации природных микроорганизмов, культивированию и селекции продуцентов, определению факторов патогенности штамлюв, чувствительности к антибиотикам, антагонистической активности. Коллекция штамлюв В. thuringiensis (Bl), продуцентов БАВ, штаммов, исследуемых в качестве новых видов, создана, охарактеризована и поддерживается автором лично. Инсектицидная активность штаммов Bt исследована па базе ИСиЭЖ СО РАН совместно с к.б.н. Бурцевой Л.И. и к.б.н.
Калмыковой Г.В. Молекулярное типирование (RABD-анализ) штаммов Bl Долины гейзеров выполнен совместно с сотрудниками ФГУН ГИЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора Моксевой А.В. и к.б.н. Орешковой Ф. Анализ биохимической активности штаммов проведен автором совместно с научным сотрудником «Вектора» Печуркиной Н.И., скрининг штаммов на продукцию ферментов - совместно с к.б.н. Пучковой Л.И., к.б.н.
Лебедевым Л.Р., Афиногеновой Г.Н. Электронная микроскопия ультратоиких срезов клеток выполнена сотрудником «Вектора» д.б.н. Рябчиковой Е.И. Анализ нуклеотидпых последовательностей 16S рРНК штаммов выполнен д.б.н. Морозовой О.В. и Пилипенко А.С. в Межинстит>тском Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск).
Исследование противовирусной активности препаратов проведены совместно с к.б.н.
Мазурковой Н.А. на базе отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах, содержит 38 таблиц и 44 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материшп^! и методы», трех глав собственных исследован и ii, заключения, выводов, двух нриложениГ! и списка использованной литературы, включающего 115 отечественных и 171 зарубежный источник.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы - «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы», с частичной поддержкой Региональным грантом РФФИ 97-04-96171, грантами DOE-IPP CRDF 10618 и DOE-IPP АЛХ-8-18652-01, субконтракт DE-AC36-
83CY10093, грантами DOE-IPP № 6480540 и МНТЦ № 2490р, а также - междисциплинарным интеграционным грантом Президиума СО РАН № 24 «Роль ^нIкpoopгaнизмoв в функционировании живых систем: фундаментшн.ные нроблелнл и биоинженерные приложения».
Основные положения, выносимые на защиту1. Созданная коллекция в составе 6938 природных лшкробных изолятов, охарактеризованных по основным фенотипическим и ферментативным признакам, нрелставляю1цих собой научную и практическую ценность для разработки 1ювых перспективных штамлюв для биотехнологии.
2. Новые виды микроорганизмов, ранее не представленные в базах данных, относянц1еся к родам Roseomonas, Brevibacilliis и Paenibacillus, обнаруженные в образцах ДoJп^ны гейзеров и осадков Байкала, представляющие интерес для прикладных и фундаментальных нсследований.
3. Новые продуценты эндонуклеаз рестрикции, в том числе, более технологичные при использовании или превышающие по уровню биосинтеза ранее известные прототипы ЭР SacII, BstEII, BbvII, Bgll, Ppal, Hae III, Clal и их изошизомеры.
4. Штаммы В. thitr'mgiensis ssp. kiirstaki и В. thiiringiensis ssp. galleria, вьщслснные из аэрозолей воздуха и осадков Байкала, обладаюпцю высокой антибгютнческой и инсектицидной активностью, пригодные для разработки антимикробных средств и эн'юлюпатогенных препаратов.
5. Образуюнще эндоспоры и параспоральные включения, неинсектицидные атипичные штаммы вида В. thwingiemis Долины гейзеров, перспективпыс для разработки антилн^кробных и противовирусных препаратов, представляющие интерес для таксономических исследований.
Основные направления в использовании микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в науке и народном хозяйстве
Биотехнология в целом и ее отдельные разделы находятся в ряду наиболее приоритетных направлений научно-технического прогресса и являются примером «высоких технологий», с которыми связывают перспективы совершенствования многих производств. Развитие современного общества невозможно представить без использования разнообразных биотехнологических процессов, в которых бы не производились или не применялись микроорганизмы, их компоненты или продукты жизнедеятельности (Kirk et al., 2002; Van Beilen, Li, 2002; Van den Burg, 2003; Woodley, 2006; Beloqui et al., 2008; Demain, Adrio, 2008).
Количество существующих на Земле микробных клеток оценивается величиной 6x1030 бактерий, 1,3х1028 археи и 3,1х1017 эукариот (Beloqui et al., 2008). В этом контексте сбор и использование новых биологических объектов является важнейшим направлением и источником технических решений многих проблем человечества в настоящем и будущем. Уже к 2005 году фундаментальной и промышленной микробиологией было описано около 6500 промышленно значимых видов микроорганизмов (Bode, Muller, 2005), из которых для 762 видов определены полные геномы. Эти данные, в сочетании с теми, которые могут быть получены в будущем, при завершении текущих 2773 проектов по ссквенированию (в разработках используются 89 архей, 1749 бактерий и 935 эукариот), составят для разработчиков обширную базу данных по генетике и энзимологии перспективных микроорганизмов (Beloqui et al., 2008).
Технология ферментов определена Организацией экономического сотрудничества и развития (Organization for Economic Cooperation and Development - OECD) как междисциплинарная область деятельности, являющаяся важным компонентом устойчивого индустриального развития (Van Beilen, Li, 2002). Несмотря на то, что уже идентифицировано более 3000 различных ферментов, многие из которых нашли применение в науке и промышленности, существующий ферментный инструментарий не удовлетворяет всех потребностей (Van den Burg, 2003).
В номенклатуре используемых биологических агентов до настоящего времени важнейшее место занимает традиционный объект - микробная клетка. Микроорганизмы, являющиеся источником получения разнообразных биологически активных веществ, существенно различаются между собой по способности к их синтезу. Выбор продуцента необходимого соединения сопряжен с проверкой на его наличие огромного количества микробных культур, приводящей к отбору наиболее активного продуцента. Однако подавляющее большинство микробов не культивируются в лаборатории. Выделенные, культивируемые и идентифицированные микроорганизмы составляют по оценке (Lorenz et al., 2002) менее 1% от существующих в природе.
Альтернативный подход для использования генетического разнообразия из определенных экологических ниш заключается в исследовании полных геномов (мегагеномов) для поиска новых генов целевых белков (Henne et al., 2000; Beloqui et al., 2008). При секвенировании больших фрагментов мегагеномной ДНК определяются гены таких ферментов, как хитиназы, липазы, эстеразы, протеазы, амилазы, ДНКазы, ксиланазы (Lorenz et al., 2002). С применением праймеров к консервативным областям генов липаз и метода ПЦР гены этих ферментов были выделены непосредственно из неидентифицировашюй «природной» ДНК (Bell et al., 2002). Обнаруженные скринингом «природных» ДНК целевые гены могут быть использованы для последующего клонирования в Е. coli (Henne et al., 2000).
Прогрессивные методы создания новых рекомбинантных суперпродуцентов активно развиваются, тем не менее, в настоящее время многие промышленные микробные технологии базируются на традиционном использовании гетеротрофных организмов, таких как: Saccharomyces cerevisiae (хлебопекарная промышленность, виноделие), Streptococcus thennophilus (производство йогуртов), Clostridium acetobutylicum (производство ацетона), Xanthomonas campestris (полисахариды), Cory neb acterium glutamicum (L-лизин), Candida utilis (микробный белок), Propionibacterium (витамин Віз), Aspergilus oryzae (амилаза), Saccharomycopsis lipolytica (липаза), штаммы рода Bacillus (протеазы), рекомбинантные штаммы Е. coli (инсулин, гормон роста, интерферон), Bacillus thuringiensis, Bacillus popilliae, Bacillus sphaericus (биоинсектициды) и других (Смирнов и др., 1982; Харвурд, 1992; Волова, 1999; Сафронова и др., 2003).
Производство и промышленное применение ферментов микроорганизмов является одной из обширных групп объектов и процессов биотехнологии (Kirk et al., 2002; Глик, Пастернак, 2002; Van Beilen, Li, 2002; Van den Burg, 2003; Woodley, 2006; Egorova, Antranikian, 2008). Преимущества микробиологического метода получения ферментов заключаются в разнообразии ассортимента ферментов, синтезируемых микроорганизмами, в возможности управления ферментативными системами и составом
Источники отбора образцов для выделения микроорганизмов
В работе использованы микроорганизмы, выделенные из различных природных источников: почвы и водных объектов Новосибирской, Иркутской областеіі, ВасюганскоГі низменности, Алтайского края, воды, донных осадков оз. Байкал и оз. Кротовая Ляга, почвы, воды и осадков источников Долины гейзеров, льда Антарктиды, аэрозолей воздуха Западной Сибири. Изоляты рода Rhizobhim, выделенные из клубеньков бобовых растепиіі Новосибирской области, предоставлены для совместных исследований ЦСБС СО РАН.
Пробы осадочных пород Байкала были отобраны во время буровых работ по международному проекту «Байкал-бурение» в районе подводного хребта Академический (1998 г.) и во время бурения на Посольской банке (1999 г.). Максимальная глубина бурения достигала 320 м. Пробы почвы, воды и осадков источников Долины гейзеров (Камчатка) были собраны в августе 2004 года на удаленных друг от друга участках Долины гейзеров, отличающихся значением рН, температурой, флористическим разнообразием и другими характеристиками. Пробы аэрозолей воздуха отбирали с помощью лаборатории «Оптик-Э», смонтированной на базе самолета АН-30 на импинджеры, заполненные 50 мл стерильного физиологического раствора над лесным массивом в 50 км к югу от Новосибирска. Пробы льда Антарктиды переданы для микробиологического исследования Институтом Минералогии и Петрографии СО РАН. Пробы взяты в феврале 2006 г. в районе острова Кинг Джордж рядом с материковой частью Антарктиды, использованы для выделения психрофильпых и психротолерантных микроорганизмов.
Методы выделения и идентификация микроорганизмов
Образцы почвы (грунта, осадков) гомогенизировали в ступке в физиологическом растворе, затем, для лучшей десорбции микробных клеток с частиц грунта использовали обработку образцов ультразвуком (от 10-20 секунд до трех минут). Полученную взвесь отстаивали в течение 30 секунд, готовили ее десятикратные разведения, высевали на чашки с питательными средами и инкубировали, в зависимости от задачи опыта, при различных температурах: от 4 и до 60С.
Условия выделения и культивирования микроорганизмов. Исследуемые образцы высевали на питательные среды различного состава: рыбно- пептонный агар (РПА, ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ); жидкую и агаризованную среду LA ("Difco", США); среду А (0,7% пептона, 0,4% рыбного гидролизата, 0,5%) NaCl, 1,7% агара), почвенный агар (ПА), крахмало-аммиачный агар (КАА, состав (г/л): растворимый крахмал - 10, (NH.})2S04 - 1, MgSO.,x7H20 - 1, NaCl - 1, CaC03 - 3, агар 20) (Сэги, 1983). Применяли также среду LB, разведенную дистиллированной водой в 5-Ю раз (жидкую или агаризованную). При высевах использованы различные значения рН питательных сред (5,0; 7,0; 9,0 и др.). Высевы инкубировали при температурах от 4-6 до 60С, выросшие колонии, отличающиеся морфологически, использовали для получения чистых культур
Работы по выделению психрофильных микроорганизмов выполнены с использованием охлажденных инструментов, питательных сред и растворов. Пробы воды, полученной при таянии образцов льда Антарктиды, кроме сред указанных выше, высевали на питательную среду, состоящую из соответствующей пробы воды, стерилизованной фильтрованием через питроцеллюлозные фильтры с размером пор 0,2 мкм, и 1,6% агара. Инкубировали засеянные чашки при температуре 4-бС в камере бытового холодильника.
Просмотр посевов и подсчет численности выросших колоннії проводили в течение 1 -4 недель. Индивидуальные колонии, появившиеся на поверхности агаризованных сред и отличающиеся морфологическими признаками, переносили на свежие питательные среды и инкубировали в аналогичных условиях.
Изучение морфологических свойств микроорганизмов. Особенности морфологии колоний изучали визуально и с помощью стереоскопического микроскопа Stemi 2000-С (Carl Zeiss, Германия). Клетки микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Окраску клеток по Граму определяли методом (Grcgersen 1978). Ультраструктуру клеток исследовали с применением электронного микроскопа (Hitachi Н-600, Япония). Для этого клетки микроорганизмов последовательно обрабатывали 4% параформом, 1% OsOa, заливали смесью Epon-Araldite. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Reichert-Young.
Определение физиологических и биохимических признаков включало в себя исследование роста штаммов при различных значениях рН и температуры среды, концентрации NaCl, в присутствии лизоцима, в аэробных или анаэробных условиях в соответствии с (Герхард и др. 1983, 1984; Holt et al., 1986; Хоулт, 1997). При необходимости проводили косвенные тесты на патогенность штаммов (Герхард и др., 1983, 1984), определяли чувствительность к антибиотикам с помощью аппликации дисков производства НИЦФ (Санкт-Петербург, Россия) на поверхность питательного агара, засеянного испытуемым микроорганизмом. Количество антибиотиков в 1 диске составляло: для рифампицина - 5 мкг, пенициллина, оксациллина, ампициллина и гентамицина - 10 мкг, олеандомицина, эритромицина, линкомицина - 15 мкг, стрептомицина, неомицина, канамицина, мономицина, тетрациклина, левомицетина и ристомицина - 30 мкг, карбенициллнна - 100 мкг, для по-лимиксипа - 300 ёд.
Разнообразие, ферментативная активность микроорганизмов, выделенных из образцов почвы, воды и осадков Долины гейзеров (Камчатка)
Долина гейзеров - всемирно известный природный объект Камчатки. Здесь продолжается активная гидротермальная деятельность и можно наблюдать все известные формы ее проявления в природе: горячие озера, пульсирующие кипящие источники, парогазовые струи, грязевые котлы и гейзеры.
Рис. 2. Географическое расположение Долины гейзеров и гейзеры - Большой (верхнее правое фото) и Сахарный (нижнее фото), находящиеся в настоящее время под завалами селевого потока 2007 года.
Термофильные микробные сообщества Долины гейзеров, рассматриваемые как реликтовые, привлекают пристальное внимание учёных для решения таких глобальных проблем, как построение филогенетического древа жизни и создание модели биосферы Земли в ее развитии, служат источником штаммов, применяемых в различных биотехнологических целях. При микробиологическом анализе образцов, отобранных на территории Долины гейзеров, выделено 1480 культивируемых микробных изолятов, из которых к экстре-мофилам можно отнести термофильные микроорганизмы, составляющие 10,5 % от общего числа полученных изолятов, галофильные бактерии - 7,5%, ацидофильные - 20,8% и алкалофильные - 27%.
Изоляты, охарактеризованые по фенотипическим признакам, являются в основном спорообразующими и неспороносными бактериями, в меньшем количестве представлены актиномицеты, дрожжи и плесневые грибы. Выделенные бактерии отнесены к микроорганизмами родов Calorbacillus, Aneurinibacillus, Апохуbacillus, Wantersia, Paenibacillus, Thermus, Geobacillus, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus и ряду других. В числе спорооб-разующих бактерий рода Bacillus выделены штаммы, относящиеся к видам В. stearother-mophilus, В. cereus, В. coagulans, В. circulans и В. thuringiensis. При идентификации микробных изолятов Долины гейзеров обнаружены микроорганизмы, не имеющие аналогов в базах данных и определенные как вновь обнаруженные виды бактерий рода Paenibacillus (Dg-1009, К-58, К-59, Dg-824 и др.).
Скрининг штаммов на содержание ферментов. Проведено тестирование 450 выделенных микроорганизмов на наличие секретируемой протеолитической, амилолитичс-ской, лецитиназной и липолитической активностей (рис. 3).
Про/неолитическая активность обнаружена у 149 изолятов. Штаммы, обладающие наиболее активными протеазами, представлены в основном термофильными и мезофиль-пыми бактериями рода Bacillus. Около сорока из них, в том числе, термофильные споро-образующие бактерии Anoxybacillus sp. Dg-326 и Gi-621, Aneurinibacillus sp. Dg-480t, Calorbacillus sp. Dg-382t и Dg-383t, Geobacillus sp. Dg-321t и Dg-491 и ряд других, проявили высокую протеолитическую активность при всех трех использованных значениях рЫ среды (5,0, 7,0, 9,0). Галотолерантные бактерии Dg-397, Dg-784, Dg- 637, Dg-324, Dg-542 обладали протеазами, активными при повышенной засоленности среды с содержанием 3% NaCl.
Липазы содержали 114 изолятов, из них 37 являлись высокоактивными. За исключением четырех штаммов, все они обладали протеазами. Наиболее перспективными в качестве продуцентов лииолитических ферментов можно назвать термофильные штаммы Gi-361-1, Gi-385t, относящиеся к роду Geobacillus и мезофильный штамм Anoxybacillus sp. Km-999. Лецитиназной активностью обладали 72 изолята (Dg-700, Dg-367, Dg-404, Dg-630 и др.), из них 17 штаммов не имели амилаз. Все эти микроорганизмы представлены мезофилами, продуцирующими также липазы и протеазы.
