Введение к работе
Актуальность темы. Проблема ликвидации ущерба, наносимого , хлопководству вертициллезным вилтом,: считается актуальной, несмотря на уже существующие методы (химические, селекционные,агротехнические и др.і снижения вредоносности фитопатогена. Отсутствие надежных яаучнообоснованных рекомендаций на основе , фундаментальных исследовании механизма взаимоотношении патоге- на и растения тормозит внедрение в хлопководство биологических . способов зашита растений от патогена.
3 механизме зашиты растительных клеток хлопчатника от ,повтеждаюцего действия микроскопического . гриба VerticilHur. jdahliae Kleb. существенная роль отводится фитоадексинам. Синтез последних в растительных клетках может индуцироваться, мо-.. лекудами, названными злиситораш. Ими могут быть одигосахарид-ные фрагменты полисахаридов-клеточных стенок как гриба-патоге-t на, гак и гастения-ховяйна.
известен ряд ферментов, разрушавши клеточные сгенки, которые высвобождают из них определенные одигосахариды. Образование > одигосахаридов а ряде случаев катализируют фермента 3-1,3-глюканазы, механизмы молекулярного действия которых составляют самостоятельную научную проблему, В связи с этим, а последнее время з Институте умкробиолсгии АН РУз ведутся исс-. ледов^ния," направленные на выяснение молекулярных механизмов образования и действия нового класса фитогормонов - одигосаха-ринов (фрагментов клеточных стенок), ицдуцируюших защитные реакции хлопчатника против его заболевания винтом. Фрагментом отих исследований и является настояная работа,
Дедь работы, основной целью работы ввилось исследование основного ферментативного звена в образовании олигосахаринов :иетсчных стенок - а-1,3-глюканазы. Для достижения этой вели іеойходимо было решить следующие задачи:
- зылелить а-і.З-глюкапазу из гриба V.dahlias з гоыогеи-
:іом' состоянии;
- изучить физико-химические и кинетические характеристики
, выделенного йермента;
- исследовать гидролитическое действие фермента на поли
сахариды клеточных стенок г&игЗа.
Научнад новизна и практическое значение работы. Б реэудь--тате ос/н.есгвлевд<зго скрининга отобран отами гриба V.dahUae с наиболее вьюокрй в-1,3-гіюканаавой активностью. Определены оптимальные, свокв (культивирования продуцента, при которых обеспечиваете? нз^бодъ.щ<|е нащдание. фермента.
Бізервш Докаааш сУйв?во.«авме двух внеклеточных цолеку-йїшх'і&гш ^*,3чдаканааы, Методами гель-., ионообменной, ад-Мйжк«зв# хзкзмаго?рафий'» препаративного электрофореза; в.по-дя&чрвдагедшод тел» выделены а высокаачиввнном состоянии . обе формы а-4л3ггл»канааьц Научены их основные фиаико-химические и кжадмд«челкв% свойства. Показано; что выделенный фермент по отвошйвию к дзыинарину является зкзо-о-і.а-гдюканазой. Установлена, рола гидтидвновкх остатке» в проявлении каталитической активности а-1,3-тдшааааы. Определено, что активность а-1.3-гаскаваэа регулируется: посредством некоторых аминокислот. Впервые показано, что полисахариды иэ клеточных стенок грийа, парализованные в-і.З-гдвканаарй, значительно увеличивает индукции эадитнкх реакций хлопчатника.
' Совокупность лааучеаньк данных может служить основой для выделений препаратов В-глокзваз с цель» использования их для полученаа олитосахарилныг фрагментов, индукторов защитных реакции хлотзтеика. іпгатив его эабадевания вклтоы.
Научение механизма действия к активных центров а-і.З-гіао-каяаа также служит необходимой предпосылкой для правильного и эффективного использования их в структурной химии углеводсо-держаша биополимеров.
Апробация работы, материалы диссертации доложены на V международном,, симпозиуме по вертицидлизму ( Ленинград... 1990), XV Международном биохимическом Конгрессе' (Израиль, 1991), \ Конференции биохимиков Республик Средней Азии и,Казахстані (Тэдаент, I9fii).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 печ; дых работ, из ксяоф . .журнальные статьи и з тезиса докладов.
Структура и об*»* диссертации. Диссертация состоит и: введения, обзора, литературы, экспериментальной части, результатов я,их обсуждения, заключения, выводов, списка испсльаоваї ней литературы, вкдтаящгго /60 наименований.
работа наложена на страницах машинописного текста
иллюстрирована 37 рисунками и
Скрининг штаммов гриба V.dahliae по способности к биосинтезу молекулярных форм а-І.З-гішаназьі проводили у 14 штаммов . микроскопического гриба V.dahliae. Штаммы получены из лаборатории коллекции микроорганизмов Института микробиологии Ш РУз. ' Гриб выращивали в 1,0-литровых колбах Эрленмейера, содержащих 200 мл среды Чалека-Докса при 2ВС в сгашонарных условиях, с последующим определением й--1,3-гдюканазнсс1 активности в' фильтрате культуральной жидкости по методу Шомодьи-Нельсона (Somogyi, Nelson, 1952), используя в качестве стандарта глюкозу. Субстратом служил ламинарии - 8-1,3-гдюкан из водоросли Liminaria cycharioides (Elyakova, Zwyagintseva, 1974). ' За единицу ферментативной активности принимали количество Фермента, которое образует 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров 'в пересчете на глюкозу ва 1 mm в оптимальных условиях дейс-;твия шермента, Удельную актшшхги» определяли, числом единиц активности на 1 мг белка.
Содержание бедка определяли модифицированным (Larson et al., 1986) методом Лоури.
Гомогенные модекудярные формы й-1,3-глюквназы выделяли, , применяя методь: осаждения кудьтуральной жидкости этиловым спиртом (или изопропаволом), .-гель-хроматографии на сефадексе . . * G-50 ("Pharmacia Fine chemicals", Швеция), TSK-геле HW 50 То-yopearl, ионообменной хроматографии на DEAE-TSK 650М ТоуореагГ . (Toyo Soda МПЗ Со, Ltd, Япония). Высокоочишенные формы а-1.3-гл»каназы получали также и методами адсорбционной хроматографии на HA-Ultrogel (U Молекулярные массы (іюрм I и II о-1,3-гдюканазы определяли методами электрофореза в полиакриламидном геде в присутствии додешлсульфата натрия (Weber, Osborn, 1969) и гель-фильтрации , на сс-фадексе G-1G0 (Дегерман, 1970). Аминокислотные анализы обеих &орм . 0-1,3-гдоканазы. были ' проведены с идентификацией фенилтиокарбомильных .производных, аминокислот с использованием высокоэффективной жидкостной хро- ' матограФии (Cohen. Strydoro, 1988). Температурные оптимумы молекулярных форм в-1.а-гдвканааы определяли в интервале 28 - ЄОС. рИ-оптимумы определяли в интервале рН среды 3,7 - 8.С. Фотоокисдение гясгидида в молекулах 0-1,3~гдюканааы проводили в присутствии рибофлавина (Murachi, 1975). Анализ KHg-кояцевызс аминокислот определяли по методу Грея
(Gray, 1S72). - в