Введение к работе
Актуальность проблемы. Успехи, достигнутые в эндокринологии, неразрывно связаны с разработкой и совершенствованием методов контроля качества і ормональных препараюв, используемых как в медицине, так и ветеринарной практике.
Основоположником отечественной ветеринарной эндокринологии М.М.Завадовским и его школой заложены основы применения гормональных препаратов для коррекции гормонального статуса у животных с целью регуляции воспроизводительной функции у самок сельскохозяйственных животных и лечения гинекологических болезней у них.
Сыворотка крови жеребых кобыл (СЖК) является одним из гормональных препаратов, нашедших широкое практическое применение как для лечения гипофункции яичников, так и повышения воспроизводительной функции у самок сел «хозяйственных животных.
Методы, используемые в отечественной биотехнологической промышленности для определения гонадотропний активности СЖК, а также препаратов, получаемых из нес ( гонадотропин очищенный, гравогормон, овариотропнн и др.), требуют своего совершенствования. Так. тест на самцах озерных лягушек, применяемый для формирования промышленных серий СЖК, позволяет весьма приблизительно оценивать ее гормональную активность, что в Значительной степени снижает ее качество.
Исследование гормональной активности СЖК на неполовозрелых самках белых мышей (мышино-маточиый тест) и белых крыс ( по увеличению массы яичников), также имеют ряд недостатков, а именно, продолжительность времени нх проведения (от 72 до 120 часов), выраженная индивидуальная чувствительность животных, зависимость от времени года, особенностей кормления, температуры окружающей среды, влажности, а также высокая стоимость работ. Важно также отметить, что ошибка биологиче-
ского метода контроля гормональных препаратов, в тоХічнєжпи: СЖК, на-
« . „»»„.. m in -„ -їпо/ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА
МОСК. '::-,'. ,-;-:1ДОыИИ
и.,., .і, ,„ .;и*ш|мзааа
ходятся в пределах от 10 до 20%,
Достижения в области препаративной биохимии, иммунологии, биотехнологии позволили на основе получения чистых биологически активных веществ, в том числе и гормонов, разработать радиоиммунологические, иммунофермеигные методы определения их как в биологических субстаи-цичх, тал и в коммерческих препаратах. Эти методы отличаются от ранее известных высокой чувствительностью, воспроизводимостью и временем их проведения. Однако, для реализации одного из этих методов необходимо иметь нммунохимически чистый гормон н высокоспецифические антитела к нему.
Поэтому, разработка тест-системы для быстрого и более точного определения гонадотропного гормона в сыворотке крови жеребых кобыл обеспечит получение гонадотропних препаратов (ГСЖК) высокого качества н позволітт более эффективно использовать их в практике ветеринарии н животноводства.
В связи с вышеизложенным, целью нашей работы являлось: разрабо-тать эффективный способ выделения высокоактивного н иммукохимнче-ски чистого гонадотропного гормона из нативной сыворотки крови жеребых кобыл, изучить его физико-химические свойства и разработать им-муноферментную тест-систему для количественного определен!» как в СЖК, так и в гонадотропных препаратах, полученных из нее.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
I. Разработать технологичный способ получения высокоактивного и имму-
нологически чистого гонадотропного гормона из сыворотки крови жере
бых кобыл.
II. Изучить физико-химические и иммунологические свойства ГСЖК с
целью его стандартизации для создания нммуноферментной тест-системы
количественного определения.
-
Разработать оптимальную схему получения пшериммуннон сыворотки лабораторных животных к ГСЖК для дальнейшею выделения аффинных антител к гонадотропному гормону.
-
Сконструировать иммунофорчентную тест-систему количественного определенна гонадотропина в продуктах биотехнологии (СЖК).
-
Провести апробацию тест-системы для выявления ее диагностической ценности.
VI. Провести сравнительный анализ определения биочогнческой актив
ности препаратов гонадотропина и нативной СЖК посредством бнопробы
на неполовозрелых самках крыс и иммуноферментного анализа.
Научная новизна исследования:
Впервые разработан высокоэффективный июсоб выделения сывороточного гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл методом хро-матофокусирования на ПБИ-Ч4 и дальнейшей его очистки от примесных сывороточных белков с использованием CN Вг-ссфарозного иммуносор* бента с иммобилизованными антителами к сывороточным белкам жеребца (авторское свидетельство Х9 1374488 от 15,(0.87),
Получены моноклоналъные антитела против ГСЖК, Найдено, что эти антитела, взаимодействуя с гормоном, не оказывают влияния на его биологическую активность. Определена константа ассоциации реакции взаимодействия ГСЖК со специфическими антителами, равная 5.74000 М. что указывает на высокое сродство реагирующих макромолекул.
Обоснованы оптимальные условия для разработки иммунофермент-ной тест-системы для количественного определения гонадотропного гормона » препаратах СЖК.
Практическая ценность работы.
Гонадотропний гормон СЖК стандартизован по аминокислотному и углеводному составу. С- и N- концевым аминокислотам и молекулярной массе, что обеспечивает получение специфических моноклональпых кнтн-тел к нему.
Полученные мышиные моноклональные антитела к гонадотропному гормону СЖК являются моноспецнфичными и нс ингнбируют его гормональном акгнвности.
Предложена иммуноферментная тест-система для количественного оипеделения гонадотропного гормона в СЖК, позволяющая определять его концентрацию в сыворотке крови жеребых кобыл и полностью заменить биологические тесты, повысить качество выпускаемых препаратов.
Методические рекомендации по раннеіі экспресс-диагностике жеребости кобыл иммунологическим методом утверждены Трестом конных за* водов и ипподромов МСХ СССР; они нашли также применение в учебном процессе зооинженерного факультета М ВА им. К.И .Скрябина.
Апробация работы. Материалы диссертации были рассмотрены на межлаборлторном совещании ВГНКИ 28 мая 1997 года и на заседании от* дела биотехнологии ВИЖ 5 июня 1997 года.
Результаты исследований были доложены на Всесоюзной научно-технической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы профилактики и лечение болезней сельскохозяйственных животных", г.Москва, 1985 г., на 35-м Всемирном симпозиуме по проблемам диагностики болезней сельскохозяйственных животных, Гаага, 1984 г.
Публикации, Материалы, изложенные в диссертации, опубликованы в 5 работах, список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем диссертации