Выявление и филогенетический анализ геномов возбудителей болезни Найроби и лихорадки долины Рифт Сальников, Николай Игоревич

Введение к работе

1.1 Актуальность

Вирусы болезни Найроби и лихорадки долины Рифт (ЛДР) - представители семейства Bunyaviridae - являются возбудителями опасных заболеваний животных и человека [1,17].

Болезнь Найроби инфекционная вирусная болезнь овец, характеризующаяся острым течением, поражением нервной системы, органов кровообращения и дыхания. Представляет опасность для человека, вызывая лихорадку и геморрагические явления. Переносчиками возбудителя являются иксодовые клещи, в изобилии распространенные в Кении, Уганде, Конго (район озера Киву) и ЮАР (провинция Наталь), где постоянно регистрируется болезнь Найроби [6,10].

Лихорадка долины Рифт – это антропозоонозная, особо опасная вирусная инфекция, распространенная во многих странах Африки и Ближнего Востока. Вирус ЛДР обладает выраженной патогенностью для человека и многих видов диких и домашних копытных животных. Вирус передается через укусы комаров, при контакте с тканями и кровью заболевших животных, а также аэрогенным путем при вдыхании вируссодержащих аэрозолей. Лихорадка долины Рифт наносит огромный экономический ущерб сельскому хозяйству, т.к. обуславливает высокую гибель молодняка, а также приводит к возникновению абортов у 80-100% больных животных. Болезнь зарегистрирована в Кении, Уганде, Южно – Африканской республике, Родезии, Судане, Анголе, Мозамбике, Нигерии, Экваториальной Гвинее и Австралии [2].

Поскольку оба вируса поражают одни и те же виды животных, обладают перекрывающимися ареалами и вызывают инфекции со сходными клиническими проявлениями, дифференциация их друг от друга является актуальной.

1. 1. Степень разработанности проблемы

   Изучению вирусов болезни Найроби и ЛДР посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных исследователей. За рубежом разработаны и широко используются тест – системы для выявления генома вируса ЛДР методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени [7,11,15,16]. Кроме того, в базе данных генетической информации (GenBank) депонировано большое количество полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов и изолятов вируса ЛДР. Помимо молекулярно-генетических, разработано большое количество серологических методов для обнаружения вируса ЛДР и антител к нему. В ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии разработана методика твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющая обнаруживать вирус ЛДР в различных образцах биологического материала (пробах органов, культурах клеток, крови) [3].

   В отличие от вируса ЛДР, исследованием генома вируса болезни Найроби занимается лишь небольшая группа сотрудников Центра по контролю и предотвращению особо опасных заболеваний (США). Ими проведены секвенирование и филогенетический анализ азиатских и африканских штаммов вируса болезни Найроби [13]. Однако в научной литературе нет данных о разработке методов генодиагностики вируса болезни Найроби, а также методов дифференциальной диагностики вирусов болезни Найроби и ЛДР.

   В данной работе определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов и проведен филогенетический анализ музейных штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР. Предложены способы выявления генома вируса болезни Найроби методами гнездовой ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Представлена методика дифференциации геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР на основе мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

   1.3 Цель и задачи исследования

   В связи с вышеуказанным, основной целью исследований являлась разработка средств выявления геномов вирусов болезни Найроби и лихорадки долины Рифт.

   Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

   1) разработать тест - системы для выявления генома вируса болезни Найроби методами ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией результатов и в режиме реального времени, определить их чувствительность и специфичность;

   2) разработать тест - систему на основе мультиплексной ОТ - ПЦР в режиме реального времени для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР, определить её чувствительность и специфичность;

   3) определить нуклеотидные последовательности различных участков генов музейных штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР;

   4) провести филогенетический анализ геномов музейных штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР.

   1.4 Научная новизна работы

   Впервые определены нуклеотидные последовательности генов N и Gn четырех штаммов вируса болезни Найроби (NSD-X, МК, ММ, ММ/К-05), депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и установлено, что геномы этих штаммов филогенетически близки геному африканского штамма NSD 708 (степень нуклеотидной идентичности относительно гена N составляет 88 - 90 %, а относительно гена Gn - 97 - 98 %).

   Впервые определены нуклеотидные последовательности генов NSs и Gc четырех штаммов вируса ЛДР (RVF(s)13, RVF(s)113, RVF 2002/09-ПС, 1974-ВНИИВВиМ), депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и установлено, что геномы этих штаммов филогенетически близки геномам эпизоотического вирулентного штамма Entebbe и аттенуированного штамма Smithburn (степень нуклеотидной идентичности между последовательностями генов NSs и Gc составляет 99,0 – 99,7 %).

   Впервые разработана тест-система для выявления генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР, авторство изобретения которой подтверждено патентом РФ № 2416647 (бюллетень № 11 от 20 апреля 2011 г.).

   Впервые разработаны тест – система для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени и тест-система для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной ОТ - ПЦР в режиме реального времени.

   1.5 Практическая значимость работы

   Разработаны "Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби методом гнездовой полимеразной цепной реакции", "Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени", "Методические положения по выявлению РНК вирусов болезни Найроби и лихорадки долины Рифт методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени", утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым А.М. 16.11.2011, 30.11.2011 и 10.11.2011, соответственно.

   1.6 Публикации результатов

   По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринарная патология», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

   1.7 Апробация работы

   Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2009-2011 гг.).

   Материалы диссертации доложены на конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины", посвященной 50-летию ВНИИВВиМ (г. Покров, 2009 г.), Всероссийской научно – практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика -2010" (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, прикладные и фундаментальные исследования в фармакологии, физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011 г.), 4^ом, 5^ом и 6^ом Международных конгрессах EPIZONE (г. Сент-Мало, Франция, 2010г.; г. Арнем, Нидерланды, 2011; г. Брайтон, Великобритания, 2012).

   1. 8. Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

      В соответствии с формулой специальности 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) – область науки об использовании живых организмов, культур клеток и биологических процессов в производстве с целью получения полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии, целенаправленно улучшающих воздействие на окружающую среду и формирование экологически доброкачественной среды обитания человека и животных. В диссертационной работе проведены исследования по созданию тест-систем на основе ПЦР и её модификаций, позволяющие выявлять геномы вирусов болезни Найроби и ЛДР в различных пробах биологического и патологического материала. К данным тест-системам разработаны рекомбинантные положительные контроли, при создании которых применялись методы клонирования ДНК в составе плазмидных векторов в клетках Escherichia coli. проведено секвенирование фрагментов S - и M - сегментов геномов штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также их филогенетический анализ.

      Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 1, 9, 11.

      1. 9. Структура и объем диссертации

         Похожие диссертации на Выявление и филогенетический анализ геномов возбудителей болезни Найроби и лихорадки долины Рифт

         Конструирование и клонирование искусственных генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины РифтИматдинов Ильназ Рамисович

         Разработка решающих правил для выявления пациентов с ремоделированием сердца на этапе скрининга на основе компьютерного анализа ЭКГЧерных, Светлана Павловна

         Разработка рещающих правил для выявления пациентов с ремоделированием сердца на этапе скрининга на основе компьютерного анализа ЭКГЧерных Светлана Павловна

         

         Новые подходы к совершенствованию методов иммунохимического анализа с помощью синтетических полимеров для ряда возбудителей инфекционной патологииЛещук Светлана Ивановна

         Идентификация возбудителей болезней Шмалленберг и Акабане на основе ПЦР в режиме реального времениНикитина, Елена Григорьевна

         Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремииМаракасова, Екатерина Семеновна

         

         Молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика вируса лихорадки долины рифт и создание тест-систем для диагностики этой инфекцииБелов Артем Владимирович

         

         Использование ПЦР и секвенирования для выявления и анализа генома коронавируса крупного рогатого скота Кудрявцев Владислав Александрович

         

         Выявление и анализ активного механизма импорта ДНК в растительные митохондрии Кулинченко Милана Вячеславовна

         

         Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических группСпиридонова Елизавета Михайловна