Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 8
2.1. Углеводородные загрязнения окружающей среды 8
2.1.1. Состав углеводородных загрязнителей: нефти, мазута, нефтешламов 9
2.1.2. Восстановление почв, загрязненных углеводородами 12
2.1.2.1. Методы восстановления природных объектов при нефтяных загрязнениях 12
2.1.2.2. Биологическая очистка почв 14
2.2. Свойства и применение бактерий рода Rhodococcus в биоремедиации 18
2.2.1 .Общая характеристика микроорганизмов рода Rhodococcus 18
2.3. ПАУ-разлагающие микроорганизмы 19
2.4. Механизмы биодеградации углеводородов 24
2.'4.1. Механизмы биодеградации алифатических углеводородов 25
2.4.2. Механизмы расщепления ароматических УВ 28
2.4.. Расщепление ароматической структуры 28 2.4.2.2 Механизмы биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ) 33
2.5. Идентификация микроорганизмов в почве 41 2.5.1. Иммунохимические методы идентификации микроорганизмов с акцентом на родококки 42
2.5.1.1. Реакция иммуноагглютинации 42
2.5.1.2. Иммунодиффузия 43
2.5.1.3. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) 45
2.5.1.4. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) 45
2.5.1.5. Иммуноферментный анализ (ИФА) 46
3. Материалы и методы 49
3.1. Объекты исследования 49
3.1.1. Оптимизация состава питательных сред для масштабированного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер» 50
3.1.2. Полевые испытания препарата «Родер» (сухой формы) для биоремедиации почв, загрязненных углеводородами 51
3.2. Условия проведения лабораторных экспериментов 53
3.2.1. Адаптация штаммов к исследуемому субстрату 53
3.2.2. Изучение закономерности потребления смеси парафинов и дизельного топлива в качестве единственного источника углерода 54
3.2.3. Проведение скрининга культур микроорганизмов 54
3.2.4. Выделение чистых культур 55
3.2.5. Изучение способности клеток сорбировать ПАУ 55
3.2.6. Изучение закономерности потребления ПАУ в качестве единственного источника углерода и в присутствии косубстрата 55
3.2.7. Изучение закономерности потребления алифатических углеводородов культурой Pseudomonas sp. 56
3.2.8. Испытания разработанного ммунохимического анализа штаммов R. ruber и R, erytropolis 56
3.3. Методы 56
3.3.1. Гравиметрический анализ почвенных проб 56
3.3.2. Определение содержания летучих жирных кислот (ЛЖК) 59
3.3.3. Определение содержания алканов 59
3.3.4. Определение концентрации ПАУ 60
3.3.5. Определение концентрации растворимого белка 61
3.3.6. Определение СОг в газовой фазе 62
3.3.6. Проведение окраски по методу Грама 62
3.3.7. Расчет кинетических параметров биодеградации углеводородов 63
3.3.8. Определение численности микроорганизмов классическим микробиологическим методом 64
3.3.9. Определение клеток R. ruber и R erythropolis методом ИФА 64
3.3.9.1. Получение антисывороток против R, ruber и R. erythropolis 65
3.3.9.2. Сорбция клеток на планшете 65
3.3.9.3. Тестирование антисывороток 66
3.3.9.4. Построение калибровочной кривой 66
3.3.10. Выделение ДНК 68
3.3.11. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК 68
3.3.12. Детектирование продуктов ПЦР 69
3.3.13. Очистка ПЦР-фрагментов 69
3.3.14. Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нуклеотидных последовательностей 69
4. Результаты и обсуждение 70
4.1. Оптимизация состава питательных компонентов для культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер» 70
4.2. Применение препарата «Родер» для очистки реальных природных объектов 71
4.2.1. Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной застарелым мазутом
(Обуховский завод, участки №1 и №2) 71
4.2.2. Биоремедиация препаратом «Родер» железнодорожного шлама 78
4.2.3. Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной нефтью 82
4.2.4. Сравнительный анализ результатов деградации углеводородных загрязнений
препаратом «Родер» 86
4.3. Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов
штаммами R, ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D) 87
4.3.1. Кинетические закономерности биодеградации жидких парафинов адаптированными штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D) 87 '
4.3.2. Кинетические закономерности биодеградации углеводородов дизельного топлива адаптированными штаммами R. ruber (Ас-1513-D) и R. erythropolis (Ас-1514-D) 90
4.4. Изучение биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ) 94
4.4.1.Изучение биодеградации ПАУ штаммами R. ruber и R. erythropolis 94
4.4.2. Скрининг эффективных биодеструкторов ПАУ 95
4.4.3. Выделение чистой культуры из накопительной культуры 2ПЗ и ее идентификация 97
4.4.4. Кинетические свойства культуры Pseudomonas aeruginosa при росте на различных углеводородах 100
4.5. Исследование влияния P. aeruginosa на рост R. ruber и R. erythropolis 105
4.6. Совместное потребление ПАУ и гексадекана консорциумом трех штаммов 105
4.7. Определение концентрации клеток родококков методом ИФА 108
5. Выводы 114
6. Список литературы 115
- Углеводородные загрязнения окружающей среды
- Объекты исследования
- Оптимизация состава питательных компонентов для культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер»
Введение к работе
В настоящее время, проблемы охраны окружающей среды и рационального природопользования, а также повышения уровня экологической безопасности, рассматриваются как первостепенные в общемировом масштабе. Одними из наиболее опасных загрязнителей практически всех компонентов природной среды (поверхностных и подземных вод, почв, растительного покрова и атмосферного воздуха) являются нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие отходы - нефтешламы.
Ежегодно в мире образуются миллионы тонн жидких и твердых отходов нефтяной и нефтеперерабатывающей промышленности. Места хранения таких отходов представляют серьезную опасность для окружающей среды, а многочисленные аварии при добыче, переработке и транспортировки нефти и нефтепродуктов являются причиной масштабных загрязнений природных объектов. Попадая в окружающую среду, ископаемые углеводороды, в частности нефть и продукты ее переработки, не только губят флору и фауну, но и наносят прямой вред здоровью человека (например, некоторые компоненты нефти проявляют канцерогенную активность). При этом самоочищение загрязненных территорий без вмешательства человека длится десятками лет, кроме того, естественная способность окружающей среды к самовосстановлению с каждым годом снижается. Как следствие, остро встает вопрос о необходимости проведения максимально эффективной очистки загрязненных территорий с учетом состава загрязнителей, экономических и экологических и факторов.
Среди всего спектра методов устранения последствий углеводородных загрязнений, биологические методы справедливо признаны в мире наиболее безопасными для окружающей среды и экономически целесообразными. Особенно перспективным является метод биоремедиации, основанный на использовании микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды в процессе своей жизнедеятельности. В процессе биоремедиации углерод из нефти и нефтепродуктов частично преобразуется в углекислый газ, частично переходит в биомассу клеток, и частично трансформируется в гумус и закрепляется в почве. В настоящее время изучению этой проблемы посвящено большое число научных исследований, и интерес к этой тематике растет. Научные лаборатории всего мира продолжают разрабатывать препараты-нефтедеструкторы, действие которых основано на использовании уникальных возможностей углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в их состав. Тем не менее, при использовании микроорганизмов в биоремедиации возникает ряд проблем.
Например, микробам, часто, и самим нужна определенная помощь, так как в местах сильных загрязнений значительно нарушен необходимый для жизнедеятельности микроорганизмов баланс углерода, азота, фосфора и других питательных компонентов. Для смягчения этой проблемы вместе с препаратами вносятся минеральные и органический удобрения (состав которых специально разрабатывается для конкретного препарата и загрязнения), раскислители почвы (в случае почв с пониженным рН), ПАВы, сорбенты, а также производится периодическая вспашка очищаемых участков для улучшения массообмена.
Кроме того, зачастую препараты проявляют требуемую активность только для загрязнения определенного состава, и присутствие некоторых компонентов нефти в большей концентрации пагубно влияет на общее действие препарата: в качестве примера можно привести загрязнения нефтепродуктами, содержащими повышенное количество смол, асфальтенов, полиароматических углеводородов, которые являются очень токсичными для микроорганизмов. В этом случае для достижения положительных результатов целесообразно использовать методы биоаугментации, т.е., дополнительного внесения микроорганизмов, обладающих повышенной активностью именно к таким компонентам.
Также встает вопрос о том, какое влияние оказывают вносимые с препаратами добавки удобрений на аборигенные сообщества микроорганизмов, так как существуют технологии очистки природных объектов от нефтяных загрязнений, которые основаны на биоремедиации без привлечения микробных препаратов, но использующие активизацию различными способами аборигенной микрофлоры. Поэтому поведение вносимых с препаратом микроорганизмов на фоне аборигенных микроорганизмов и вклад их в процесс биодеградации загрязнения также является важной проблемой. Для ее решения в мире разрабатываются различные методы идентификации и контроля микроорганизмов в почве.
Имеющийся в нашей лаборатории препарат «Родер», состоит из штаммов R. ruber Ac-1513-D и R. erythropolis Ac-1514-D. Он был разработан для ликвидации свежих аварийных разливов нефти и довольно успешно испытывался в различных регионах России для микробиологической очистки водных поверхностей и грунтов от загрязнений углеводородами нефти. В настоящее время востребованы биологические методы облагораживания нефтяных шламов, в том числе отходов НПЗ, железнодорожных шламов, территорий, загрязненных мазутом. Интересным представлялось применение штаммов препарата «Родер» для биоремедиации такого рода загрязнений, изучение самого процесса биоремедиации, его эффективности.
Кроме того, в начале 90-х годов практически полностью прекратилось производство сырья, которое использовалось для полупромышленного получения препарата «Родер» по Регламенту, разработанному в 1994 г. Поэтому встал вопрос о поиске новой сырьевой базы и разработке нового регламента для получения препарата «Родер».
Очень злободневным, в первую очередь для нефтяников, является разработка методов, которые позволили бы доказать, что работают именно микроорганизмы препаратов при ликвидации последствий аварийных разливов нефти, а не аборигенная микрофлора, активизированная внесением удобрений и применением агротехнических мероприятий. Все изложенное выше стало основой исследований, проведенных в настоящей диссертационной работе.
В процессе выполнения диссертационной работы была выявлена недостаточно высокая эффективность деградации ПАУ штаммами препарата «Родер», поэтому встал вопрос о поиске эффективных деструкторов ПАУ для повышения биодеградации нетрадиционных углеводородных загрязнений.
Углеводородные загрязнения окружающей среды
В настоящее время нефть по-прежнему является одним из наиболее востребованных источников энергии в мире, и проблема очистки водных и почвенных ресурсов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами продолжает оставаться одной из самых острых. Россия в этом плане не является исключением. В нашей стране основные места добычи нефти и газа расположены в Западной Сибири и на Севере Европейской части страны. В результате интенсивного транспорта нефти к местам ее потребления, а также в условиях сурового климата, характерного для мест ее добычи и приводящего к быстрому износу и порывам нефтепроводов и емкостей для хранения, аварии и масштабные разливы нефти стали уже привычным явлением. В результате таких аварий на почву и болота ежегодно выливается от нескольких десятков до сотен тысяч тонн нефти. Миллионы тонн нефти ежегодно попадают в моря и океаны [2-3].
В России в настоящее время эксплуатируются более 200 тыс. км магистральных и 350 тыс. км промысловых трубопроводов. Около 70% трубопроводов используются более 30 лет, и 95% порывов внутри промысловых трубопроводов происходит из-за коррозии. Примерно 7% всех функционирующих нефтяных месторождений в России имеют высокую загрязненность территории, 70% - слабую и среднюю. Только в Западносибирских нефтегазодобывающих регионах выявлено свыше 200 тыс. га земель, загрязненных слоем нефти толщиной не менее 5см. По мнению специалистов, хозяйственная деятельность топливно-энергетического комплекса Российской Федерации наносит до 75% ущерба окружающей среде [2, 4, 5].
Повышенные концентрации нефти и нефтепродуктов в почве и воде нарушают дыхательную активность почвы и микробное самоочищение почвенных и водных ресурсов. Изменяя соотношения между отдельными группами почвенных микроорганизмов, крупные нефтяные загрязнения меняют направление почвенного метаболизма, подавляют процессы дыхания, азотфиксации, нитрификации, биодеградации целлюлозы, приводят к накоплению трудно-окисляемых продуктов, уменьшают количество корневых выделений и перегнивающих частей растений, являющихся важнейшими факторами питания микроорганизмов [5, 6].
Нефть представляет собой маслянистую жидкость от светло-желтого (редкие «белые» нефти) до коричнево-бурого, иногда черного цвета, в основном - легко текущую, реже - малоподвижную. Нефть, получаемую непосредственно из скважин, называют сырой нефтью.
В химическом отношении нефть представляет собой смесь углеводородов (УВ) и других соединений углерода, в которой основными элементами являются углерод (84-87%), водород (12-14%), кислород, азот и сера (1-3%). Кроме этого, в нефти присутствуют металлы (ванадий, никель, железо, кальций и др.), входящие в состав различных металлоорганических соединений. Углеводородную часть нефти составляют алканы (парафины), нафтены (циклопарафины) и арены (ароматические углеводороды). Относительное содержание этих групп углеводородов зависит от типа нефти. В большинстве случаев в нефти отсутствуют ненасыщенные углеводороды (олефины, или алкены). Преобладание в нефти той или иной группы углеводородов определяют ее свойства, качество и области применения нефтепродуктов, получаемых из нее. Различают нафтеновые, парафиновые, парафинонафтеновые, парафино-нафтено-ароматические, нафтеноароматические и ароматические нефти [7-9].
Алканы являются химически наиболее устойчивыми линейными УВ. В зависимости от длины углеродной цепи они могут принимать одно из трех агрегатных состояний. Углеводороды СН4 - С4Н10 представляют собой газ и входят в состав нефтяных газов, растворенных в нефти, находящейся под большим давлением в нефтяном пласте. Эта часть углеводородов выделяется в виде свободной газовой фазы в процессе добычи нефти. Углеводороды С5Н16 - СібНз4 (в том числе разветвленные изомеры нормальных алканов) являются жидкостями и входят в состав бензинов, керосинов и дизельных топлив. Углеводороды от СпНзб и выше при нормальных условиях являются твердыми веществами. Их температуры плавления увеличиваются с возрастанием молекулярной массы.
Объекты исследования
Исследования проводились с препаратом-нефтедеструктором «Родер» и индивидуальными штаммами, из которых состоит этот препарат.
Препарат «Родер» был разработан для микробиологической очистки грунтов, почв, естественных водоемов, акваторий, сточных вод предприятий от нефти и нефтепродуктов, а также при комплексной очистке аналогичных объектов после применения механических, адсорбционных и химических методов. Препарат действует при уровне загрязнения объекта нефтью и нефтепродуктами до 20%, но наиболее эффективен при низком уровне загрязнения (0,1-0,5 %%), который остается после механической или химической очистки. Он работает в широком диапазоне температур: от + 10 до + 32 С, с температурным оптимумом 2 С.
Препарат Родер состоит из двух высокоактивных штаммов-деструкторов нефти Rhodococcus ruber Ас-1513 D и Rhodococcus erythropolis Ac-1514 D, выделенных соответственно из сырой нефти и песка, загрязненного нефтью. Штаммы обладают ферментативной системой, способной эффективно окислять углеводороды нефти и нефтепродуктов. Препарат «Родер» (жидкая и сухая формы) имеет Гигиенические Заключения Санэпиднадзора (в настоящее время Роспотребнадзора), разрешающее его применение в природе. Препарат неоднократно успешно тестировался в лабораторных, пилотных и полевых испытаниях в средней полосе России, в Западной Сибири и в Республике Коми [19].
Кроме того, использовались накопительные культуры, выделенные из различных образцов почвы, загрязненных нефтью и хранимые в музее нашей лаборатории (группы экологической биотехнологии кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова).
В качестве субстратов в работе использовались:
- смесь нормальных жидких парафинов, содержащая (об %): С13Н28 -7,5; С14Н30 -24,0; С15Нз2-30,6; Ci6H34-24,2; С,7Нз6-11,2; примеси - 2,5;
- дизельное топливо;
- гексадекан;
- ПАУ: нафталин, антрацен, фенантрен, пирен (использовались в различных
концентрациях и различном составе в зависимости от проводимых экспериментов, что
будет отдельно уточнено ниже при описании этих экспериментов).
Оптимизация состава питательных сред для масштабированного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер»
Штаммы хранили в лиофильном состоянии при температуре +4 +8С, поддерживали на жидкой среде Раймонда с нефтью, размножали на МПА и жидкой среде с гидролизатом рыбной муки или среде Самойленко. Проанализировав используемые на данный момент среды для культивирования бактерий, в качестве оптимизируемой среды была выбрана среда Самойленко, которая создавалась для выращивания бактерий рода Rhodococcus. В состав этой среды входят: пептон (10 г/л), дрожжевой автолизат (50 мл/л), глюкоза (10 г/л), гидрофосфат натрия (4 г/л) и дигидрофосфат калия (1г/л), рН = 7,1 - 7,2. Было решено провести оптимизацию только питательных субстратов, входящие в состав среды, так как представленные фосфаты необходимы лишь для создания буферной емкости среды.
Для оптимизации состава питательной среды применяли метод математического планирования эксперимента: а именно полный факторный эксперимент для трех компонентов среды на двух уровнях (ПФЭ 2 ) с шагом варьирования А. — 1А концентрации каждого из изучаемых компонентов. Используемые концентрации компонентов представлены в таблице 3.1.1. Критерием оценки результатов ПФЭ 23 служили численность углеводородокисляющих (УВО) клеток и сухая биомасса клеток штаммов. Численность общую (ГТ) и УВО клеток штаммов устанавливали классическим микробиологическим методом рассева десятикратных разведений на МПА или среду Раймонда с нефтью или гексадеканом (0,05 об.%). Длительность культивирования штамма R. erythropolis составляла 28 часов, a R. ruber 36 часов.
Оптимизация состава питательных компонентов для культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер
В результате проведенных экспериментов с использованием ПФЭ 2 было установлено, что наибольшее количество накопленной биомассы как для одного, так и для другого штамма наблюдается в том случае, когда в среде присутствует наибольшая из взятых концентраций автолизата и глюкозы (положительные коэффициенты в уравнении регрессии для этих факторов) (табл. 4.1.1.).
Таким образом, можно сделать вывод, что автолизат и глюкоза наиболее значимо влияет на рост данных культур. Напротив, концентрация пептона в заметно меньшей мере оказывала влияние на данный процесс (отрицательный коэффициент в уравнении регрессии). При этом в экспериментах в случае с клетками R. erythropolis потребление глюкозы происходит на 10%, а в случае R. ruber - на 87% в случае минимальной концентрации глюкозы и на 60% в случае максимальной концентрации (для обоих штаммов). Концентрация общего растворимого белка при этом уменьшалась только на 10% (во всех случаях), т.е., потребление этого субстрата происходило далеко не полностью. Поэтому в целях экономии было решено использовать в качестве среды для культивирования среду № 6, но без пептона. В результате потребление глюкозы штаммом R. erythropolis увеличилось до 38%, а штаммом R. ruber - до 88%. Таким образом, найденная минимальная среда (дрожжевой автолизат (75 мл/л), глюкоза (15 г/л), гидрофосфат натрия (4 г/л) и дигидрофосфат калия (1 г/л)) была включена в регламент по производству препарата «Родер» [129] и использовалась нами в дальнейших опытах для культивирования углеводородокисляющих бактерий, входящих в препарат «Родер». При этом выход биомассы на новой среде увеличился в 1,5 раза по сравнению с исходной средой Самойлснко (вариант 9 в табл. 4.1.1.).
На выбранной среде на биокомбинате «Щелково» (Московская обл.) было наработано 10 кг сухого препарата, который использовался в дальнейших полевых экспериментах.
Применение препарата «Родер» для очистки реальных природных объектов
Следующим этапом данной работы стало исследование способности препарата «Родер», состоящего из штаммов R. ruber и R. erythropolis и полученного в соответствии с регламентом [129], деградировать различные типы нефтяных загрязнений. В качестве таких субстратов были выбраны реальные почвенные загрязнения нефтью, мазутом и нефтешламами.
Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной застарелым мазутом (Обуховский завод, участки №1 и №2)
Визуально загрязнение обоих участков было неравномерным и различалось по консистенции. На первом участке мазутное загрязнение напоминало шлаки, на втором участке оно было более вязким и глиноподобным. Результаты предварительного химического анализа почв показали, что загрязнение обоих участков было неравномерным. На первом участке исходная концентрация углеводородов варьировалась от 115 до 120 г/кг св. почвы, на втором участке - от 100 до 115 г/кг. После внесения песка, двукратного перекапывания почв и (по возможности) усреднения загрязнения по площади участков, концентрация УВ снизилась до 54-66,7 г/кг св. на первом участке, и до 20,6 - 42,4 г/кг св. - на втором участке.
