Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы «везикулярный транспорт в клетках эукариот» 11
1. Организация путей секреции в клетках дрожжей 11
2. Транспортные везикулы 13
2.1 СОРИ везикулы 13
2.1.1 Структура комплекса СОРИ 13
2.1.2 Сортировка белков в СОРИ везикулы 14
2.2 COPI везикулы 17
2.2.1 Структура комплекса COPI 17
2.2.2 Участие COPI везикул в прямом транспорте между эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи 20
2.2.3 Участие COPI везикул в обратном транспорте между эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи 22
2.2.2.1 Транспорт белков, содержащих дилизин овый сигнал 22
2.2.2.2 Транспорт белков, содержащих сигнал K/HDEL и белка Secl2p 25
2.2.3 Модели СОРГзависимого транспорта между эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи 26
2.3 Клатриновые везикулы 28
3. Транспорт между цистернами аппарата Гольджи 29
3.1 Структура аппарата Гольджи 29
3.2 Модели транспорта белков между цистернами аппарата Гольджи 31
4. Слияние мембран 35
4.1 Молекулы SNARE 36
4.2 Регуляция сборки комплекса SNARE 39
4.2.1 SM-белки - семейство белков Sccl/Muncl8 39
4.2.2 Белок SeclSp 40
4.3 Система связывающих белков 41
5 Роль ионов кальцияв секреторных путях 44
5.1 Кальциевые помпы 45
5.2.1 Кальциевые помпы дрожжей 46
5.3 Ответ клетки на снижение Са2+ в секреторных путях 47
Заключение 49
Материалы и методы 51
1. Плазмиды и штаммы микроорганизмов 51
1.1 Плазмиды, использованные в работе 51
1.1.1 Плазмиды, полученные в данной работе 51
1.2 Штаммы микроорганизмов 52
1.2.1 Штаммы дрожжей 52
1.2.2 Штаммы бактерий 58
2. Условия культивирования и генетические методы 58
3. Генно-инженерные манипуляции и полимсразиая цепная реакция 59
4. Выделение и анализ ДНК клеток Н. polymorpha 60
5. Выделение и анализ РНК клеток Н, polymorpha 61
6. Анализ секреторных белков дрожжей 61
6.1 Анализ белка Gaslp в клетках Н. polymorpha и S. cerevisiae 61
6.2 Получение антител и анализ белка Pmrlp в клетках Я polymorpha 62
6.3 Определение ферментативной активности и количества uPA 64
6.4 Зимография инвертазы 66
6.5 Анализ секретированной хитиназы 66
7. Иммупоблоттинг белков 66
8. Флуоресцентная микроскопия 67
Результаты 69
1. Клонирование и секвенировапие гена RET1 Н. poiymorpha 69
2. Делеция 3-концевой части кодирующей области гена HpRETl не летальна для клеток дрожжей 71
3. Ген HpRETl Н, poiymorpha является жизненно важным 75
4. Дефект сс-СОР приводит к секреции неправильно свёрнутых форм урокиназы 76
5. а-СОР Н. poiymorpha участвует в транспорте GPI-заякоренного белка Gaslp 80
6. Функциональное взаимодействие между а-СОР и Pmrlp Н. poiymorpha 82
6.1 Сверхэкспрессия HpPMRl супрессирует фен оптические проявления мутации ret 1-27 82
6.2 Мутация в гене HpRETl приводит к снижению количества белка Pmrlp и нарушению его распределения в клетках Н. poiymorpha 83
6.3 Мутация rctl-27 не приводит к нарушению гликозилирования секретируемых белков 84
6.4 Летальность сочетания мутации ret 1-27 с делецией гена HpPMRl 86
7. Идентификация генов Н. poiymorpha, в мультикопийном состоянии супрессируїощих мутаптные проявления retl-27 91
8. Изучение влияния сверхэкспрессии гена SES1 на фенотипические проявления мутаций retl-27 к Apmrl 93
9. Делеция гена HpSESl приводит к нарушению морфологии вакуолей в клетках Н. poiymorpha 94
Обсуждение результатов 96
1. а-СОР дрожжей Н. poiymorpha: структурные особенности и роль в поддержании гомеостаза кальция 96
1.1 Мутации, затрагивающие С-концевую область белка а-СОР у S. cerevisiae и Н. polymorpha, приводят к различным фснотипическим проявлениям 97
1.2 Дефект а-СОР И. polymorpha приводит к нарушению обратного транспорта белков из Гольджи в эндоплазматический ретикулум 98
1.3 Функциональное взаимодействие белков Retlp и Pmrlp Я polymorpha 99
Заключение 109
Выводы 112
Список литературы 113
Благодарности 138
- Участие COPI везикул в прямом транспорте между эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи
- Получение антител и анализ белка Pmrlp в клетках Я polymorpha
- Делеция 3-концевой части кодирующей области гена HpRETl не летальна для клеток дрожжей
- Функциональное взаимодействие белков Retlp и Pmrlp Я polymorpha
Участие COPI везикул в прямом транспорте между эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи
Отбор так называемых strc-мутантов, проведенный для идентификации штаммов, дефектных по процессу секреции, выявил мутации, распределённые по более чем 30 группам комплементации. При этом были отобраны мутанты, дефектные по транспорту белков на различных этапах секреторного пути (Novick et al,, 1980, Duden et al., 1994, Wuestehube et al., 1996), Поскольку почти все SEC-геиы являются жизненно важными, этот отбор выявил аллели, условно дефектные по скорости роста и функции секреторных путей. Примером могут служить температуро-чувствительные (ts) мутанты, фенотип которых проявляется только в условиях повышенной температуры культивирования (непермиссивная температура), тогда как в условиях более низкой температуры (пермиссивная температура), процесс роста и секреции не нарушен.
Впервые роль комплекса СОРІ в транспорте между ЭР и Гольджи была показана после выявления гена SEC21, кодирующего у-СОР (Hosobuchi et al., 1992, Stenbeck et al,, 1992). У мутанта sec21-l при непермиссивной температуре был нарушен транспорт вакуолярной гидролазы CPY (Hosobuchi et al., 1992). Электронно-микроскопические исследования выявили, что клетки этого мутанта накапливают мембраны ЭР и транспортные везикулы диаметром 50 им, что подтверждало участие у-СОР в прямом транспорте из ЭР в Гольджи (Kaiser and Schekman, 1990). Были также обнаружены гены ещё двух субъединиц комплекса COPI - р и р , проявляющие дефект прямого транспорта белков из ЭР в Гольджи (Hosobuchi et al., 1992, Duden et al., 1994) Однако, в дальнейшем, была получена мутантная аллель у-СОР sec2l-2, которая не приводила к нарушению прямого транспорта CPY (Lctoumcur et al., 1994). При отборе гс/-мутантов (см. ниже) были также выявлены штаммы, дефектные по прямому транспорту из ЭР в Гольджи (jretl-l, rctl-3t ret2-lt sec33-l), хотя большинство полученных в этой работе мутантов не проявляли такого дефекта.
Доказательства участия комплекса СОРІ в прямом транспорте из ЭР в Гольджи были получены и при исследовании клеток млекопитающих. Микроинъекция антител против [Ї-СОР в клетки млекопитающих приводила к ингнбированию транспорта VSV-G из ЭР в Гольджи (Peter ct al., 1993). Кроме того, в клетках млекопитающих были обнаружены участки ЭР, обогащенные комплексом СОР] (Orci et al., 1994), а добавление компонентов СОРІ и ARF к дрожжевым мембранам iv vitro стимулировало отпочковываиие и формирование СОРІ везикул (Bednarek et al., 1995).
Приведённые выше доказательства подтверждают что нарушение СОРІ транспорта влияет на экспорт из ЭР по крайней мере части белков. Транспорт молекул по секреторным оргаиеллам, также как и целостность структуры этих органелл, зависят не только от факторов, которые непосредственно участвуют транспорте в прямом направлении к плазматической мембране и вакуоли, но также и от факторов, влияющих на возврат белков и липидоо. Например, обратный транспорт из Гольджи в ЭР служит как для возврата резидентных белков ЭР, «проскочивших» место своей нормальной локализации, так и для повторного использования факторов, необходимых для прямого транспорта из ЭР в Гольджи. Данные, полученные как па клетках млекопитающих, так и на дрожжевых системах, свидетельствуют о том, что обратный транспорт из Гольджи в ЭР осуществляется с помощью COPI везикул. Сейчас известно три типа белков, транспортируемых при помощи COPI везикул: белки, содержащие дилизиновый сигнал (ККХХ-сишал), белки, содержащие сигнал KDEL (у млекопитающих)ДШЕЬ (у дрожжей) и белок Secl2p (Gaynor and Emr, 1997). Дилизиновый сигнал был впервые идентифицирован в мембранных белках I типа клеток млекопитающих. Он представляет собой два остатка лизина в -3,-4 положении (ККХХ) или в -3,-5 (КХКХХ) положении С-концсвого цитоплазматического домена белка. Генетические и биохимические данные, полученные при исследовании клеток дрожжей, подтвердили влияние этого сигнала на обратный транспорт мембранных белков из Гольджи в ЭР (Rothman and Wieland, 1996; Schekman and Orci, 1996). Было показано, что коатомер, а также субкомплекс [ее, Р , е]-СОР, непосредственно взаимодействует с ККХХ-мотивом, а затрагивающие его мутации приводят к нарушению возврата белков в ЭР (Cosson and Letoumeur, 1994). В других исследованиях стабильный субкомплекс [а, р\ г]-СОР был также способен связывать С-концевой домен белков семейства р24, содержащий дилизиновый сигнал, что позволило предположить, что одна или несколько этих субъединиц (а-СОР, (1 СОР и є-COP,) содержат специфический сайт узнавания для сигнала ККХХ (Fiedler et al., 1996). В дальнейшем было показано, что для обеспечения обратного транспорта белков, содержащих дилизииовый сигнал, необходим WD-40 домен а-СОР (Eugster et al., 2000). При отборе мутантов, дефектных по обратному транспорту из Гольджи в ЭР белков с дилизиновым сигналом (/- -мутантов), были выявлены гены а-СОР, у-СОР, S-COP и -СОР, что подтвердило участие комплекса COPI в этом процессе (Letoumeur et al., 1994, Cosson et al., 1996). Количественные эксперименты in vivo с использованием химерного репортерного белка, представляющего собой инвертазу, слитую с Wbplp показали, что все COPI-мутаиты, исследованные до сих пор, за исключением штамма с делецией гена SEC2S, проявляли дефект обратного транспорта из Гольджи в ЭР белков, содержащих дилизииовый сигнал (Gaynor and Emr, 1997). Мутации и WD40 домене а-СОР {ret1-2, ret 1-4, ret 1-5) приводили к нарушению обратного транспорта из Гольджи в ЭР, но не приводили к нарушению прямого транспорта из ЭР в Гольджи (Таблица 2) (Letoumeur et al., 1994, Schroder-Kohne et al., 1998), Исключение составлял мутант retl-1, который проявлял дефект прямого транспорта белка Gaslp (Sulterlin et al., 1997). Однако, мутация retl-З в С-домеие а-СОР и мутация ret2-l в 5 СОР также приводили к нарушению прямого транспорта CPY (Duden et al., 1998, Cosson and Letoumeur, 1994). Интересно, что комплекс COPI из лизатов клеток мутантов retl-І и sec27-l был не способен связывать дилизииовый сигнал in vitro; однако, COPI из лизатов клеток с мутациями sec21-l, ret2-l и ret3 l связывал этот сигнал (Cosson et al., 1996; Letoumeur et al., 1994). Было также показано, что локализация белка Етр47р, который циркулирует между ЭР и Гольджи, но функционирует в Гольджи зависит от его сигнала ККХХ, но в мутанте retl-1 не происходило нарушения его транспорта (Schroder et al., 1995).
Получение антител и анализ белка Pmrlp в клетках Я polymorpha
Урокиназа человека, или активатор плазмшюгена урокиназного типа (иРА), является сериповой протеазой и осуществляет реакцию превращения плазмшюгена в плазмин. С полноразмерного гена урокиназы синтезируется неактивный одноцепочечный предшественник (scuPA, single chain form of urokinaseype plasminogen activator) с молекулярным весом 54 kDa. После ограниченного протеолиза с помощью плазмина или каллекреипа образуется активная двуцепочечная форма (tcuPA, two chain form of urokinaseype plasminogen activator) с таким же молекулярным весом. Последующий протеолиз с помощью плазмина приводит к удалению N-копцевых доменов, не существенных для каталитической активности урокиназы, и образованию активной формы с молекулярным весом 33 kDa (Lijnen and Collen, 1991).
Помимо активации урокиназы, плазмин осуществляет гидролиз фибриновых сгустков, образующихся из фибриногена под действием тромбина (Hollander, 1987). Реакция полимеризации фибриногена под действием тромбина может быть проведена in vitro с получением фибринового геля. Урокииаза при нанесении на фибрииовый гель активирует плазминоген, содержащийся в виде примеси в большинстве коммерческих препаратов, и вызывает лизис фибрина. Зоны лизиса фибрина определяются как области просветления геля. На этом эффекте основан использованный в работе метод тестирования активности урокиназы (Astmp Т, and Muellerts S., 1952).
Качественную оценку способности дрожжевых клонов секретировать uPA проводили по образованию зон лизиса при росте на твёрдой среде, содержащей фибрин (Agaphonov et al., 1995). Количественное определение активности секретируемой урокиназы проводили при нанесении серийных разведений аликвот культуральных сред на фибриновый гель и выявлении зон лизиса фибрина после инкубации при 37С в течение 14-20 часов. Анализ подвижности активных форм урокиназы в педенатурирующих условиях проводили следующим образом. После индукции экспрессии uPA (как описано выше), аликвоты культуральных сред обрабатывали эндогликозидазои Н (Sigma), смешивали с буфером для нанесения SB2 (62.5mM Tris-HCl рНб.8, 10% глицерин, 0.5% SDS, 0.002% бромфеноловый синий) и разделяли белки в 10% SDS-ПААГ. После проведения электрофореза, гель промывали 1% Triton Х-100, переносили на фибриновый гель и инкубировали при 37С в течение 14-22 часов. Количество урокиназы в культуральных средах нормировали на концентрацию общего белка в клетках, которую определяли с помощью микробиуретового метода (Herbert et al, 1971).
Анализ агрегации внутриклеточной uPA проводили как было описано ранее (Agaphonov et al., 2002). Для исследования агрегации uPA, клетки разрушали с помощью стеклянных бус в буфере TBST (30mM tris-HCl рН7.5, I50mM NaCl, 2% Triton XI00), содержащем ImM PMSF и смесь ингибиторов протеаз («Complete», Boehringer Mannheim). Клеточный дебрис и бусы удаляли при помощи центрифугирования при 300xg, 10 мин. Лизаты центрифугировали при 10000xg, 10 мин. Фракцию осадка разводили в 5 раз относительно исходного объёма лизата буфером для нанесения SB1. Белки из фракций осадка и супернатанта разделяли в 10% SDS-ПААГ и анализировали методом иммупоблоттинга с использованием моноклональных антител к uPA (Красатюк и др., 1989). Сравнение количества секретируемой uPA проводили следующим образом. Белки культуральных сред концентрировали в 30 раз переосаждением с помощью 10% ТХУ в присутствии 0.017% дезоксихолата натрия. Последовательные разведения полученных проб анализировали методом иммуноблоттинга с использованием моноклональпых антител к иРА.
Для индукции экспрессии гетерологичной инвертазы в клетках Н. polymorpha, штаммы, несущие ген SUC2 S. cerevisiae, интегрированный в геном, или штаммы, трансформированные плазмидой pLDIN, выращивали в жидкой среде YEPG в течение 30-50 часов. Анализ периплазматической инвертазы и инвертазы из культуральной среды проводили в 7% полиакриламнлиом геле без добавления SDS в недепатурирующих условиях с последующим проявлением пятен активности инвертазы, как было описано ранее (Ballou С.Е., 1990).
Хитиназу, секретированную клетками Н. polymorpha в культуральную среду, выделяли согласно описанной ранее методике (Kuranda and Robbins, 1991) с небольшими изменениями. 15 мл культуральной среды ночной культуры клеток YEPD инкубировали с 50мг хитина в течение 3 часов, при 4С, с перемешиванием. Хитин осаждали центрифугированием, промывали 3 раза раствором 0.8%NaCl, 0.02%КС1, 0.12%Na2HPO4, 0.02%КгНРО4- Хитиназу смывали с хитина добавлением буфера для нанесения SB1 и нагреванием при 100С в течение 10 минут. Образцы анализировали в 6% SDS-ПААГ с последующим окрашиванием солями серебра (Kuranda and Robbins, 1991).
Электрофорез и иммуноблоттинг белков клеточных лизатов и культуральных сред проводили согласно стандартной методике (Towbin ct al., 1979).
Иммунофлуоресцентное окрашивание белка Pmrlp в клетках Н. polymorpha было выполнено по Pringle et al. (1991) с изменениями. Клетки в логарифмической фазе роста фиксировали сначала в кулыуралыюй среде добавлением в нее формальдегида до 3,7% в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем в 0.1 М К-фосфатном буфере (К2НРО4 -КНгРОд, рН 6.4), содержащем 4% формальдегида, в течение 1 часа также при комнатной температуре. После этого клетки промывали 0.1 М К-фосфатным буфером без формальдегида и обрабатывали литиказой (0.002 мкг/мкл) (Sigma) в сорбитол-К-фосфат-цитратном буфере (1.2 М сорбитол; 0.1 М К-фосфат-цитрат [К2НРО4 - лимонная кислота], рН 5.9) в течение 1 часа при 30С. Затем клетки осаждали центрифугированием при 735xg и обрабатывали охлажденным металолом в течение 3 мин при -20С, после чего проводили забивку неспецифических антигенных сайтов в буфере для забивки [PBS (4.3mM Na2HPC 4, 1.4тМ КНгР04( 137mMNaCl, 2.7тМ КС1, рН 7.3), содержащий 6% казеина] в течение ночи при комнатной температуре. Далее клетки инкубировали в буфере для забивки, содержащем иммунную сыворотку к белку Pmrlp Н. polymorpha в течение 1 часа при 37С. После этого клетки промывали буфером для забивки, добавляли антитела козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с AIcxaFluor (Molecular Probes) и инкубировали в течение 1 часа при 37С. Затем клетки промывали буфером для забивки и заключали в мовиол (10% мовиол (Mowiol, Aldrich), 25% глицерин, 0,1 М Tris-HCl, рН 8.5, 0,1%) триэтилеидиамии). Просмотр и фотографирование препаратов выполняли на микроскопе "Axioskop 40" с использованием объектива 100х "Plan-Neofluar" (Carl Zeiss) и цифровой камеры "Micropublishcr" (Qlmaging).
Прижизненное окрашивание вакуолей клеток Н. polymorpha с помощью флуоресцентного красителя FM 4-64 проводили согласно методике, описанной ранее (Vida and Emr, 1995) с некоторыми изменениями. Клетки в стационарной фазе роста (ночная культура YEPD) осаждали, ресуспендировали в свежей среде YEPD, содержащей 30р.М FM 4-64 и инкубировали с перемешиванием в течение 15 минут при 37С. После этого клетки осаждали, ресуспендировали в свежей среде YEPD и инкубировали в течение 30-60 минут при 37С. Затем клетки опять ресуспендировали в свежей среде YEPD и помещали па предметное стекло для просмотра. Ли поф ильный флуоресцентный краситель FM 4-64 специфично встраивается и окрашивает последовательно все мембранные структуры пути эпдоцитоза, начиная с плазматической мембраны и заканчивая вакуолями, Специфичиость окрашивания той или иной структуры пути эпдоцитоза зависит от времени и температуры инкубации (Vida and Emr, 1995).
Делеция 3-концевой части кодирующей области гена HpRETl не летальна для клеток дрожжей
Чтобы проверить, действительно ли плазмида рАМ409 содержит фрагмент мутантного гена, её разрезали по сайту Есо47Ш, и линеаризованной ДНК трансформировали штамм дикого типа DLU происходящий от штамма DL-1. Штаммы Н. polymorhpa DL-1 и CBS4732 отнесены к одному виду дрожжей, однако, по генетическим и физиологическим характеристикам их, скорее, можно выделить в два близкородственных вида. Штамм DL-1 отличается от штамма CBS4732 более высокой частотой гомологичной рекомбинации, поэтому в некоторых экспериментах мы использовали штаммы, происходящие от DL-1, для повышения вероятности получения трансформантов, содержащих единичные копии генов, интегрированных в строго определённый локус. В результате гомологичной рекомбинации в геноме штамма DLU должна была появиться полноразмерная мутантная копия гена HpRETI и нетранслирусмая копия дикого типа, лишённая З -концевой области. Такой штамм должен проявлять мутантный фенотип. В результате трансформации были получены медленно растущие клоны, сверхсекретирующие иРА и чувствительные к 25mM EGTA в среде. Таким образом, мы показали, что плазмида рАМ409 содержит фрагмент ДНК с мутацией, отвечающей за фенотип мутанта retl-27, и что эта мутация вызывает сходные проявления в штаммах //. polymorpha разного происхождения.
Сскиенирование мутантного гена выявило наличие нуклеотидной замены, которая приводила к появлению нонсенс кодона TGA вместо кодопа TGG (Тгр) в 818 положении аминокислотной последовательности соответствующего белка (Рисунок 13). Таким образом, охарактеризованная нами мутантная аллель гена HpRETI, продукт трансляции которой не содержит последних 389 аминокислотных остатков, способна поддерживать жизнь клеток //. polymorpha. Чтобы подтвердить, что мутантный фенотип возникает в результате удаления С-концевои области белка HpRetlp, был сконструирован штамм DLU-CA с делецией 3 -концсвои области гена HpRETI (Рисунок 15А). Для этого штамм дикого типа DLU трансформировали плазмидой рСОРІВЕ, разрезанной по сайту Есо41Ш. В результате гомологичной рекомбинации в геноме штамма DLU должна была появиться копия гена HpRETJ с делецией З -концевой области, соответствующей последним 305 аминокислотным остаткам, и нетранслируемая копия с делецией 5"-концевой и промоторной области. В результате трансформации, действительно, были отобраны клоны с делецией З -концевой области гена HpRETl, проявляющие мутантный фенотип, характерный для мутантного штамма 2dMA63. Правильность интеграции плазмиды рСОРШЕ была подтверждена с помощью гибридизационного анализа ДНК, выделенной из полученных трансформаїїтов (Рисунок 15 Б). У S. cerevisiae С-копцевая область белка Retlp является существенной для поддержания жизнеспособности, и делециопный вариант гена RET1 без З -концевой области, соответствующей последним 170 аминокислотным остаткам, был способен обеспечивать рост клеток лишь в мультикопийном состоянии (Eugster ct al., 2000). Поэтому то, что удаление с З -конца гена HpRETl почти третьей части нуклсотидной последовательности не приводит к гибели клеток позволило нам предположить, что у Н. polymorpha этот ген либо не является жизненно важЕіьш, либо для поддержания жизнедеятельности клеток его 3 -концевая область несущественна. Для проверки этих предположений был сконструирован штамм DL1-LA/MC, содержащий ген HpRETl под контролем регулируемого промотора гена метаполоксидазы (МОХ) (Рисунок 16), Для этого штамм DL1-LA трансформировали плазмидой pMCOPl-L, содержащей З -концевуга область гена HpRETJ, соответствукшгую первым 270 аминокислотным остаткам, под контролем промотора гена МОХ. Перед трансформацией плазмиду разрезали по сайту Hindlll внутри последовательности фрагмента гена HpRETJ. Гомологичная рекомбинация плазмидиой ДНК с геномной копией HpRETJ должна была привести к появлению в геноме штамма DL1-LA полноразмерной копии HpRETl под контролем МОХ промотора и копии гена с делецией большей части нуклеотидной последовательности {Рисунок 16).
Фермент мстанолоксидаза участвует в метаболизме метанола в клетках Н. polymorpha. Промотор гена этого белка активируется при отсутствии в среде других источников углерода, кроме метанола, и репрессируется глюкозой. В случае правильной интеграции плазмиды pMCOPI-L и при условии, что ген HpRETl является жизненно важным, трапсформанты должны расти на среде, содержащей метанол, и погибать на среде, содержащей глюкозу. Примерно 70% траисформаитов, полученных на минимальной среде, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода, были не способны расти на среде, содержащей глюкозу. Один из этих трансформаптов был назван DL-LA/MC Несколько независимых клонов этого штамма трансформировали плазмидой pCHA6-270PU, содержащей ген HpRETl дикого типа. Отобранные трансформанты были способны расти на среде с глюкозой, тогда как трансформапты с пустым вектором не вырастали (Рисунок 17). Полученные данные позволили нам сделать вывод, что ген HpRETl является жизненно важным у Н. polymorpha,
Ранее в нашей лаборатории было показано, что гетерологичный белок урокиназа человека плохо секретируется клетками дрожжей И. polymorpha из-за нарушения формирования правильной конформации этого белка в ЭР. Неправильно свёрнутая урокиназа задерживается в ЭР, агрегирует и деградирует за счет системы деградации белков, ассоциированной с ЭР (ER-associated degradation, ERAD) (Agaphonov et al., 2002), При фракционировании лизатов клеток дрожжей с мутацией retl-27 было выявлено, что в этих клетках значительно снижено количество агрегированной uPA (Рисунок 18А). uPA, секретируемая в культуральную среду клетками мутанта также отличалась по своим свойствам от uPA, секретируемой клетками дикого типа. Это было выявлено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих для uPA условиях с последующим анализом зон лизиса на фибриновом геле (Рисунок 18Б).
Функциональное взаимодействие белков Retlp и Pmrlp Я polymorpha
Вторая гипотеза, объясняющая Са +-зависимый фенотип мутанта retl-27 предполагает, что дефект СОРІ-зависимого транспорта приводит к нарушению гомеостаза Са2+ в секреторных путях. В свете этой гипотезы можно себе представить два механизма участия СОРІ везикул в поддержании кальциевого гомеостаза, которые могут как существовать независимо друг от друга, так и дополнять один другой: (1) СОРІ везикулы непосредственно участвуют в транспорте Са + (т.е. ионы Са + содержатся в везикулах и переносятся вместе с ними); и (2) неэффективный COPI-зависимый транспорт приводит к нарушению систем, участвующих в транспорте Са2\
Ионы Са принимают участие во многих процессах, происходящих в ЭР, таких как например, задержка резидентных белков ЭР (Booth and Koch, 1989), экспорт секреторных белков (Sambrook, 1990), сворачивание белковых молекул и деградация неправильно свёрнутых форм (Gething and Sambrook, 1992, Lodish and Kong, 1990, Wileman et al., 1991). ЭР дрожжей не содержит гомологов SERCA-помп клеток млекопитающих и каких-либо других кальциевых помп. На сегодняшний день известен только один белок секреторных компартментов дрожжей, который осуществляет транспорт ионов Ca2f - Са2+/Мп2+-АТФаза мембран Гольджи Pmrlp (см. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ, Раздел 5). Исследование штаммов S. cerevisiae с делецией гена PMR1 выявило, что эти мутанты способны сверхсекретировать иРА и, кроме того, имеют фенотипические проявления, характерные для повреждения системы ERAD (Dun; et al„ 1998). Такие проявления указывают на нарушение процессов, происходящих в ЭР. Следовательно, можно предположить, что данные фенотипические проявления мутанта Дртг! S. cerevisiae связаны с уменьшением поступления ионов Са2+ в ЭР. Помимо этого, было показано, что мутанты S. cerevisiae с делецией гена PMR1 содержат в ЭР примерно половину от физиологической нормы Са2+ (Strayle et al., 1999). Поскольку ScPmrlp локализован в мембранах промежуточных компартментов Гольджи (Schroder et al., 1995), то участие COPI везикул в транспорте Са2+ на этапе Гольджи - ЭР могло бы объяснить, каким образом ионы Са2+ попадают в ЭР у дрожжей. Физиологическая концентрация ионов Са2+ в ЭР дрожжей значительно ниже, чем у клеток млекопитающих (Strayle et al., 1999), поэтому, вероятно, у этих организмов отсутствует специальная помпа, снабжающая ЭР ионами Са2+, и столь незначительные потребности в ионах Са2+ могут быть удовлетворены за счёт везикулярного транспорта. В клетках //. polymorpha с дефектным геном RET1 значительно снижено количество белка HpPmrlp, что может объяснять Са2+-зависимый фенотип мутантов. На настоящий момент существует ряд данных, указывающих на роль СОРІ-зависимого везикулярного транспорта в поддержании структуры аппарата Гольджи и в нормальном распределении резидентных ферментов этого компартмента. Например, у S. cerevisiae, мутация sec21-3 в гене, кодирующем у-субъединицу комплекса COPI, приводила к нарушению распределения белка Ї/УС-ГОЛЬДЖИ Ochlp, однако, распределение белка транс-Гопьджи Mnnlp у этих мутантов не было нарушено (Gaynor and Emr, 1997). Кроме того, дефект СОРІ-зависимого транспорта приводил к нарушению распределения другого белка уг/оГольджи Мпп9р и накоплению его в вакуолях (Todorow ct al., 2000). В нашей работе мы показали, что у Н. polymorpha мутация retl-27 приводит к нарушению распределения мембранного белка Гольджи HpPmrlp. Эти данные позволяют предположить, что уменьшение количества белка HpPmrlp у мутанта retl-27 возникает в результате нарушения структуры Гольджи, следствием чего является изменение нормального распределения белка HpPmrlp и ускорение его деградации. Сверхэкспрессия гена HpPMRl приводит к компенсации некоторых фенотипических проявлений мутации retl-27, в частности, вызывает снижение чувствительности к EGTA, уменьшение секреции иРА и увеличение количества внутриклеточной агрегированной иРА. Тем не менее, супрессия Са3+-завнсимости и сверхсекреции урокиназы была неполной. Кроме того, пведение дополнительных копий гена HpPMRl не приводило к супрессии других фепотипических проявлений мутации retl-27, таких как снижение скорости роста на полной среде и дефект созревания белка HpGaslp. Деления гена PMR1 у S. cerevisiae приводит к нарушению функционирования ферментов аппарата Гольджи, участвующих в гликозилировании белков (Antebi and Fink, 1992). Мутация в гене RET1 не нарушает процесс N- и О-гликозилировапия в клетках Н. polymorpha. Исходя из полученных данных можно сделать заключение, что хотя дефект гена HpRETl и приводит к уменьшению количества и нормального распределения белка HpPmrlp, и несмотря па то что мутантный фенотип частично компенсируются при сверхэкспрессии гена HpPMRl, нельзя утверждать, что фенотипические проявления, возникающие при нарушении гена сс-СОР связаны исключительно с дефектом функционирования белка HpPmrlp. Таким образом, фенотип мутантов Н. polymorpha с дефектом сс-субъединицы комплекса COPI складывается из двух составляющих. (1) Нарушение СОРІ-зависимого везикулярного транспорта приводит к нарушению структуры промежуточных компартментов Гольджи, изменению нормального распределения белка Pmrlp, что ведёт к усилению его деградации и уменьшению количества. Снижение количества Pmrlp неизбежно должно вызывать снижение концентрации ионов Са + в секреторных путях, что и объясняет Са +-зависимый фенотип мутантов. (2) С другой стороны, дефект СОРІ-зависимого везикулярного транспорта приводит к нарушению возврата из Гольджи резидентных белков ЭР, что объясняет такие фенотипические проявления, как нарушение прямого транспорта Gaslp, снижение агрегации внутриклеточной иРА и секреция неправильных форм иРА. Кроме того, если предположить, что снабжение ЭР ионами Са2+ у дрожжей происходит за счёт СОРІ-зависимого везикулярного транспорта, то снижение эффективности этого транспорта также может вносить свой вклад в проявление Са2 103 зависимого фенотипа и объяснять снижение скорости роста мутантов Н. polymorpha red-27 и ml АС. Ещё одним подтверждением функциональной взаимосвязи между белками HpRetlp и HpPmrlp является летальный эффект совмещения двух мутации ret 1-27 и Apmrl. Делеция гена PMR1 не является летальной у S. cerevisiae (Rudolph et al., 1989) и у Я. polymorpha (М.О. Агафонов, неопубликованные данные). Увеличение концентрации кальция в среде приводило к комплементации таких фенотипических проявлений мутанта Apmrl S. cerevisiae, как нарушение гликозилировамия инвертазы, нарушение протеолитического процессипга предшественника а-фактора и увеличение секреции гетерологичного белка прохимозяна быка (Antebi and Fink, 1992). Кроме того, увеличение концентрации ионов Саг+ в среде приводит к восстановлению скорости роста клеток Н. polymorpha с делецией гена PMR1. Вышеперечисленные данные, во-первых, подтверждают, что дефекты мутантов Apmrl связаны с нарушением гомеостаза Са2+, а во-вторых, позволяют предполагать, что в клетках дрожжей существует обходной путь доставки ионов Са2+ в секреторные компартменты. Наличие комбинативного летального эффекта двойной мутации retl-27Apmrl позволяет сделать заключение, что клетки с дефектом везикулярного транспорта не способны выживать в условиях дефицита Са+ в секреторных путях. Этот вывод подтверждают полученные нами данные, что увеличение концентрации Са+ в среде выращивания снимает этот комбинативный летальный эффект.
