Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ПРИРОДА И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ МЕТИЛИРОВАННЫХ ОСНОВАНИЙ В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ 9
1. Метилированные основания в ДНК и механизм их возникновения 9
2. Органоидная специфичность и внутригеномное распределение п?С II
ГЛАВА II. СОДЕРЖАНИЕ 5-МЕТИЛЦИТОЗИНА В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ 15
1. Видовая специфичность 15
2. Тканевая /клеточная/ специфичность метилирования ДНК 17
3. Изменение метилирования ДНК в онтогенезе 20
4. Влияние фитогормонов и других факторов на изменение содержания 5-метилцитозина в ДНК 22
ГЛАВА III. МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК У РАСТЕНИЙ .... 25
1. Синтез ДНК и ее метилирование in vivo 25
2. Особенности метилирования ДНК in vitro 27
3. ДНК-метилазы эукариот и их свойства . . 29
ГЛАВА ІV. ВОЗМОЖНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК У ЭУКАРИОТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
I. Материалы и обьекты исследований . . . 39
2. Методы исследований 40
1. Проращивание семян пшеницы 40
2. Введение радиоактивной метки в ДНК проростков Контроль за синтезом новообразованной ДНК с помощью / Н/ тимидина 41
Исследование степени метилирования вновь синтезируемых ДНК в присутствии /2- С /
оротовой кислоты и/ 8- дЗ / аденина . . 41
3. Выделение ДНК
а/ Модифицированный метод Мармура ... 41
б/ Выделение и очистка из замороженных проростков высокомолекулярной ядерной ДНК центрифугированием в градиенте плотности С sCI 43
в/ Выделение ДНК из замороженных жидким азотом
проростков пшеницы ...... 44-
4. Подготовка препаратов ДНК для анализа нуклеотидного состава 44
5. Определение нуклеотидного состава и уровня метилирования ДНК 45
а/ Гидролиз суммарной ДНК 45
б/ Подготовка целлюлозы и пластинок ... 45
в/ Хроматография оснований 45
6. Получение бесклеточного экстракта с ДНК-метилазнои активностью '
а/ Осаждение нуклеиновых кислот сульфатом стрептомицина ....... 47
б/ Фракционирование белков бесклеточного экстракта сульфатом аммония .... 48
в/ Гельфильтрация материала на Сефадексе -50
"грубый" 48
г/ Проведение реакции метилирования in vitro 4-9
7. Выделение хроматина из этиолированных проростков пшеницы 50
Прочие методы 51
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА V. ОБНАРУЖЕНИЕ ДНК-МЕТИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТАХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ 52
1. Особенности метода определения ДНК-метилазной активности in vitro 52
2. Получение бесклеточного экстракта из 3-х суточных этиолированных проростков пшеницы 53
ГЛАВА II СВОЙСТВА ЦИТОЗИНОВОИ.ДНК-МЕТИЛАЗЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ 3-Х СУТОЧНЫХ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ 59
ГЛАВА III. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНК-МЕТИЛАЗЫ ИЗ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ 68
ГЛАВА ІУ. ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЦИТОЗИНОВОИ ДНК-МЕТИЛАЗЫ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ 72
ГЛАВА V МЕТИЛАДЕНИН В ДНК ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ 81
1. Включение / 8- / аденина и метилирование адениновых остатков в ДНК первого листа проростков пшеницы 81
2. Адениновая ДНК-метилазная активность в первом листе этиолированных проростков пшеницы ... 84
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89
ВЫВОДЫ 94
ЛИТЕРАТУРА 96
- Метилированные основания в ДНК и механизм их возникновения
- Тканевая /клеточная/ специфичность метилирования ДНК
- Синтез ДНК и ее метилирование in vivo
- Проращивание семян пшеницы
- Особенности метода определения ДНК-метилазной активности in vitro
Введение к работе
Одной из центральных проблем молекулярной биологии является изучение структуры и функции генома. Внимание многих исследователей привлечено, в частности, к проблеме метилирования ДНК в про-и эукариотических клетках, геном которых в результате подобной модификации приобретает уникальные специфические черты. У бактерий энзиматическое метилирование ДНК связано с явлениями хозяйской модификации и рестрикции. В последнее время получены сведения о том, что метилирование ДНК может служить одним из путей регуляции функциональной активности генов, транскрипции и клеточной дифференцировки /Razin ,Riggs 1980 ; Ванюшин,1983 ; Cooper, 1983 /.
В связи с этим изучение природы и характера метилирования ДНК в эукариотических клетках при различных функциональных состояниях приобретает особый интерес.
Геном большинства изученных видов высших растений, в отличие от всех других про- и эукариотических организмов, характеризуется очень высокой степенью метилирования /содержание 5-ме-тилцитозина в ДНК отдельных видов достигает 10мол% /. Метилирование ДНК у растений видо-, тканево- и органоидоспецифично, оно изменяется в онтогенезе и под влиянием различных факторов /вирусные, грибковые инфекции и другие/ /Ванюшин, 1972, 1983; Дох:ием и др. 1978; Хвойка и др., 1978 / и под воздействием фитогормонов /Ванюшин, 1983 /.
У растений существует репликативное и пострепликативное метилирование ДНК /Башките и др., 1980/. Репликативное метилирование ДНК осуществляется по крайней мере в два этапа: сначала метилируются фрагменты Оказаки, а после их лигирования происхо-
дит дополнительное метилирование ДНК..Репликативное метилирование ДНК является ведущим элементом регуляции степени метилирования ДНК в клетке. Практически ничего неизвестно, как метилируется ДНК в клеточном цикле у растений, какие и сколько ДНК-метилэз функционируют при этом, каковы свойства этих ферментов и узнаваемые ими нуклеотидные последовательности ДНК. Изучение этих моментов, на нэш взгляд, имеет принципиальное значение, так как с одной стороны, позволит вплотную приблизиться к объяснению механизмов модификации генома растений и регуляции его активности при дифференцировке клеток, а с другой стороны, оно исключительно важно для выяснения биологической роли метилирования ДНК у высших растений.
Основной целью настоящей работы является выделение и исследование свойств ДНК-метилаз из развивающихся этиолированных проростков пшеницы.
Исходя из цели работы, конкретной задачей исследования было:
Выделить цитозиновую ДНК-метилазу из проростков пшеницы, изучить ее свойства и установить, какими отличительными чертами она обладает по сравнению с ранее изученными растительными ДНК-метилазами;
Установить, как изменяется ДНК-метилазная активность в клеточном цикле и коррелирует ли она с синтезом ДНК;
Выяснить, содержится ли в ДНК пшеницы я-метиладенин и присутствуют ли в бесклеточных экстрактах этиолированных проростков пшеницы адениновые ДНК-метилазы.
В результате проведенных исследований в проростках пшеницы ньйдена ДНК-метилаза, способная переносить СН3-группы с s-аде-нозилметионина на цитозиновые остатки ДНК с образованием остатков 5-метилцитозинз.
Показано, что цитозиновая ДНК-метилаза пшеницы способна метилировать эндогенную и экзогенную гомологичные ДНК. Бактериальные ДНК из клеток Photobacterium Belozerskii метилируются в этих же условиях значительно хуже. Впервые установлено, что в процессе развития первого листа этиолированных проростков пшеницы в клетках меристемы изменяется цитозиновая ДНК-метилазная активность, коррелирующая с интенсивностью синтеза ДНК.
В ДНК проростков пшеницы впервые найден її -метиладенин в качестве дополнительного минорного основания /0,2% от включенного в ДНК меченого аденина/. В бесклеточных экстрактах из проростков пшеницы впервые обнаружена адениновая ДНК-метилазная активность, осуществляющая in vitro перенос метильных групп с S-аде-нозил- L-метионина на адениновые остатки гомологичной и бактериальной ДНК.
Выполненная работа носит теоретический характер. Полученные данные могут быть использованы при чтении курсов лекций и проведении практикумов по физиологии и биохимии растений и молекулярной биологии. Экспертиментальные результаты вносят вклад в понимание механизмов энзиматической модификации генома растений и регуляции его активности при дифференцировке клеток, полученные результаты могут быть использованы для разработки методов целенаправленного изучения ДНК-метилаз, в частности, для изучения существования рестрикции у растений и влияния зависимости матричной активности ДНК и экспрессии генов от степени и характера ее метилирования.
Настоящее исследование выполнено в Межфакультетской проблемной лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им.А.Н.Белозерского Московского государственного университета им.М.В.Ломоносова и на кафедре общей и молекулярной генетики Киевского государственного университета им.Т.Г.Шевченко.
Метилированные основания в ДНК и механизм их возникновения
В!.ДНК разного происхождения наряду с обычными могут встречаться дополнительные метилированные основания /fyatt , 1951/. В ДНК высших растений уже давно выявлен 5-метилцитозин /т - С/ и он обнаруживается в суммарных ДНК всех изученных до сих пор высших растений /Ванюшин,1959, 1965, 1971, 1972/.
Минорные основания в ДНК возникают на полинуклеотидном уровне, в результате метилирования соответствующих нуклеотидных остатков в специфических нуклеотидных последовательностях ДНК-метилэза-ми /Ванюшин, Кирнос, 1976; Кудряшова, Ванюшин, 1976а, 19766; Simon, Grunert, 1978; Catо, Burdon, 1979/.
При инкубации проростков пшеницы с мечеными по метильной группе га 5Q и его нуклеозидами заметной активности в выделенном из ДНК т С не обнаружено /Хвойка и др.,1974; Сулимова и др., 19786/. Сделан вывод, что п С и его нуклеозиды не могут включаться в ДНК в готовом виде, а весь обнаруживаемый в ДНК растений m С, по-видимому, является продуктом энвиматического метилирования цитозиновых остатков в цепях ДНК.
Количество m % варьирует в ДНК разных видов растений от I до Ю Mtmfo /Ванюшин, 1959, 1965, 1971, 1972/.
Для исследования специфичности метилированиа генома высших растений особый интерес приобретают поиски в их ДНК других оснований, и в частности, іг-метиладенина /m А/. Это основание обычно для ДНК бактерий /Ванюшин, 1965а, 1968/; грибов /Бурьянов и др., 1970/ и водорослей /Пахомова и др., 1968 ; Rae,1976;Hattman et al.,1978), был также обнаружен в ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae /Веножинскис и др. 1982/. После инкубации проростков кукурузы, ячменя, редиса, гороха, огурца и подсолнечника с [8 С]-аденином в течение ночи при комнатной температуре заметная радиоактивность /до 0,2% от включенного в ДНК аденина/ обна-руживается как в аденине, так и в m А, выделенных из ДНК этих проростков /Ванюшин и др., 1971/. У хлопчатника, в описанных условиях инкубирования происходит значительное включение [Q- С]-аденина в ДНК проростков /до 1-Ю инп/мин на I мкМ аденина ДНК/. После разделения оснований гидролизата меченой ДНК в зоне Н-метиладенина всегда обнаруживалась радиоактивность, которая сохранялась после многократной рехроматографии на бумаге /Ванюшин, 1971/, радиоактивность в зоне этого основания составляла 0,04% от радиоактивности включившегося в ДНК аденина.
Тканевая /клеточная/ специфичность метилирования ДНК
Известно, что в животных клетках метилирование ДНК характеризуется тканевой, клеточной и субклеточной специфичностью /Бердышев и др Капплер считает, что генотипические отличия, проявляющиеся в различном тканево-спёцифическом содержании ы С, обуславливают фенотипичес-кие особенности данной ткани Дарр1ег,1971/. Используя ферменты рестриктазы Нра П, Марі, Ша и др. ряд исследователей подтвердили это предположение (McGhee,Grinder,1979;Van Der Ploeg,Plavell, 1980;Razin,Riggs,1980;Bird et al.,1981;Dorfler,1981;Ehrlich,1981).
Установлено, что в разной степени могут быть метилированы ДНК различных субклеточных органоидов животных клеток. ДНК из ядер глии содержит больше тС, чем из ядер нейронов /Гуськова и др., 1977/, а ДНК митохондрий иногда может быть прометилирована в большей степени, чем ядерная ДНК /Ванюшин, Кирнос, 1976/. Показано, что в 5S соматических ДНК эритроцитов и гепатоцитов все исследованные сайты метилированы (: Sims et al., 1983) соответственно, в 95% и не менее, чем в 90% повторов. Используя ферменты рестрикции Нра П и Ms р I Ваалвик и Шлавелл выявили ткане-воспецифическую вариабельность уровня метилирования последовательности CCGG В большом интроне глобинового гена ( Waalwi;jM, Plavell, 1978).
Сейчас различают, по крайней мере, два типа метилирования генома: репликативное и пострепликативное (Демидкина и др.,1979; Башките и др., 1980; Кирьянов и др., 1982); репликативное метилирование ДНК в животных клетках контролируется гормонами, касается повторяющихся последовательностей в геноме и коррелирует с индуцированной гормонами в тканях-мишенях транскрипцией и белковым синтезом (Ванюшин, 1974; Романов и др.,1976, Романов, Ванюшин и др.,1977). Кинетика индуцированного обратимого суперметилирования генома в клетках печени крысы совпадает с кинетикой накопления гормонрецепторных комплексов (ГРК) в ядрах и связывания ГРК с активным хроматином (Смирнов и др., 1978). Это индуцируемое и контролируемое гормонами специфическое обратимое пострепликативное метилирование ДНК, в основном, затрагивает умеренно повторяющиеся последовательности (Смирнов и др., 1977) и, по-видимому, регуля-торные зоны генома и рассматривается как новый механизм регуляции транскрипции на уровне модификации самой транскрибируемой матрицы.
Синтез ДНК и ее метилирование in vivo
При изучении специфичности метилирования ДНК у растений неизбежно встает вопрос о том, в какой момент и какая, материнская или новосинтезированная ДНК подвергается модификации, то есть какова связь репликации ДНК и ее метилирования. Использование меченых радиоактивных предшественников синтеза ДНК / 3Н / -уридин или /14с/ оротовая кислота/ позволяет количественно исследовать метилирование ДНК при репликации. При короткой инкубации растений с /1 С / урацилом уровень метилирования новообразованной ДНК отличается от уровня метилирования суммарной /Ваншин и др., 1961/. В то же время при длительной инкубации с меткой /более 2-х суток/ уровень метилирования новообразованной ДНК совпадал с уровнем метилирования суммарной ДНК растений /Ванюшин и др., 1981/. При исследовании динамики синтеза и метилирования ДНК в колеоптиле и первом листе этиолированных проростков пшеницы было обнаружено, что с момента прорастания по седьмые сутки развития проростка ДНК в этих органах синтезируется в виде периодичных, синхронных пиков /Кирнос и др., 1983$ По мере формирования листовой пластины, уровень синтеза яДНК в ней снижается, а мтДНК-продолжается в виде синхронных циклов /Кирнос и др.,1983 а В колеоптиле заметная репликация яДНК наблюдается лишь в первые три цикла синтеза. В каждом цикле синтез яДНК предшествует синтезу мтДНК. С завершением формирования колеоптиля синтез яДНК в большинстве его клеток прекращается, а синтез мтДНК продолжается в виде синхронных циклов. В стареющих колеоптилях или в истощенной инкубацией в воде срезанных проростках яДНК почти не синтезируется и практически вся новообразованная в них ДНК является митохондриальной /мтДНК/. МтДНК пшеницы неметилирована и по составу / GC = 56 мол% / резко отличается от новообразованной яДНК /GC = 44 мол%; 100т5С/ (С +т5С0= 16- / /Кирнос и др., 1983а, 19836/,
Таким образом, состав и уровень метилирования новообразованной в проростке ДНК определяется его возрастом и соотношением уровней синтеза яДНК и мтДНК в разных органах. Однако уровень метилирования новообразованной ДНК может определяться динамикой метилирования новообразованной ДНК до и после репликации. Уровень метилирования новообразованной в разные циклы синтеза ДНК не превышает 16-18%, т.е. оказывается примерно в 1,5 - 1,8 раза меньше, чем у суммарной ДНК органа проростка /Кирнос и др., 1983а,б; Кудряшова и др., 1983/. Каждая цепь ДНК, по-видимому, метилируется по крайней мере дважды: сначала при репликации, в качестве дочерней, а потом в новом цикле репликации уже в качестве родительской. Это должно приводить к появлению у растений полуметилированных сайтов в ДНК в отличие от клеток животных Adams, Bur don, 1982/, у которых полуконсервативный механизм метилирования приводит к полной модификации сайта метилирования в комплементарных цепях, и таким образом, к наследованию уровня и характера метилирования ДНК.
Проращивание семян пшеницы
Семена пшеницы многократно промывали горячей (45-50) с добавлением детергента водой, обрабатывали 70% этанолом, отмывали проточной, затем 2-3 раза дистиллированной водой. Отмытые семена равномерно размещали на стеклянных пластинках (30x30 см), покрытых фильтровальной бумагой. Стекло помещали в кювету из винипласта (35x35x10 см), так что края фильтровальной бумаги оказывались погруженными в Дистиллированную воду. Сверху семена закрывали листом фильтровальной бумаги с прорезями. Кювету плотно закрывали стеклом и помещали в термостат (30). Через 24 часа с момента замачивания семян, проросшие семена отбирали строго по размеру, проводили пикировку на расстоянии 0,5 см друг от друга и продолжали выращивание в термостате в тех же условиях. Введение радиоактивной метки в ДНК проростков.
Контроль за синтезом новообразованной ДНК с помощью / б-3Н / тимидина. Проростки срезали у самой зерновки, не захватывая конус нарастания и помещали в дистиллированную воду. С помощью водоструйного насоса воду отсасывали, и проростки инкубировали в среде, содержащей метку / б-3Н / тимидин 50 мкКи/мл, в течение 30 мин в термостате (30). По окончании инкубации проростки промывали водой фиксировали этанолом.
б/ Исследование степени метилирования вновь синтезируемых ДНК в присутствии / 2- С / оротовой кислоты и / 8- С / аденина Целые либо срезанные проростки пшеницы инкубировали в растворе, содержащем / 2- С / оротовую кислоту или / 8- С / аденин (по 100 мКи/мл). Раствор / 2- С/ оротовой кислоты готовили следующим образом: содержимое ампулы переносили в колбу, добавляли эквимолярное количество аОН (0,1 мл 2 М jjaOH на 31 мг оротовой кислоты) и дистиллированную воду, затем растворяли в кипящей водяной бане. Инкубацию проростков проводили в присутствии антибиотиков сульфата стрептомицина (50 мкг/мл) и бензилпенициллина (10 ед/мл) для предотвращения бактериального заражения и роста. По окончании инкубации проростки отмывали водой и фиксировали 96%-ным этанолом.
Особенности метода определения ДНК-метилазной активности in vitro
Как следует из приведенных в литературном обзоре данных, включение метильных групп в ДНК может быть осуществлено путем реакции in vitro в определенных условиях, если в инкубационной смеси присутствуют: S-аденозил- ь -метионин, являющийся донором метильных групп, ДНК-метилаза-фермент, модифицирующий ДНК по остаткам цитозина либо аденина, ее субстрат, т.е. ДНК, имеющая сайты, специфичные для данной ДНК-метилазы. Количество метильных групп, включенных в остатки цитозина либо аденина данной ДНК является основным показателем, характеризующим активность ДНК-метилазы и ее субстратную специфичность. Общепринятым методом является идентификация продукта реакции по включению радиоактивной метки из С3Н-метилЗ -S -аденозил- Ь-метионина в выделяемые затем из ДНК отдельные основания, т.к. спектрофотометрически продукт реакции достоверно определить невозможно.
Используемый для обнаружения ДНК-метилазной активности бесклеточный экстракт, как правило, содержит эндогенные нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды, липиды и другие вещества, которые могут акцептировать СН3-группы, либо неспецифически связывать sAM. Это приводит к загрязнению интересующего нас основного продукта реакции мечеными соединениями и затрудняет его идентификацию. Наиболее достоверным, по нашим данным, способом определения количества включенных в ДНК-акцептор метильных групп, является определение радиоактивности в m С и m А, выделенных путем дву - 53 мерной хроматографии в тонком слое целлюлозы из гидролизата конечного продукта реакции. Под конечным продуктом реакции мы подразумеваем ДНК-акцептор, очищенный после инкубации in vitro по следующей схеме:
1 Очистка от белка - инкубация с проназой и другими известными способами ;
2 Освобождение от РНК с помощью щелочного гидролиза по методу Шмидта и Таннгаузера (Schmidt, Laimhauser, 1945).
Полученные таким образом результаты могут быть выражены в величине радиоактивности (распады в мин ) либо в пкмоль метальных групп на мкг белка или ДНК. В данной работе мы относили величину радиоактивности в m Си m иА )асп/мин ) к количеству аде нина (мкМ ) , выделенного из той же пробы ДНК после двумерной хроматографии гидролизата конечного продукта реакции.
