Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Современные представления о лизосомальном цистеиновом протеолизе и его регуляции 14
1.2. Факторы оксидативного и нитрозативного стресса, как возможный регулятор активности лизосомальных цистеиновых протеиназ 26
1.3. Роль лейкоцитов в патогенезе заболеваний вен нижних конечностей 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Клиническая характеристика пациентов 49
2.2. Экспериментальное моделирование венозного тромбоза у крыс 52
2.3. Получение материала для исследования
2.3.1. Фракционирование лейкоцитов 54
2.3.2. Получение гомогената лейкоцитов 54
2.3.3. Получение гомогената стенки сосуда 55
2.4. Определение активности катепсинов L и Н и факторов их регуляции 55
2.4.1. Определение активности катепсинов L и Н 55
2.4.2. Определение концентрации цистатина С в плазме и гомогенатах лейкоцитов 56
2.4.3. Оценка аутокаталитического действия катепсинов L и Н 57
2.5. Оценка показателей оксидативного/нитрозативного стресса 58
2.5.1. Оценка уровня окислительной модификации белков 58
2.5.2. Определение концентрации метаболитов оксида азота 59
2.6. Оценка выраженности воспалительной реакции 59
2.6.1. Определение концентрации С-реактивного белка 59
2.6.2 Определение концентрации сиаловых кислот 60
2.6.3. Подсчёт лейкоцитарного индекса интоксикации
2.7. Определение содержание белка в гомогенатах по методу Лоури 62
2.8. Статистические методы обработки результатов исследования 62
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 65
3.1 Лизосомальный цистеиновый проеолиз у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей: общие тенденции 65
3.2. Изучение влияния процессов оксидативного стресса на показатели протеолиза у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей 68
3.3. Изучение зависимости показателей лизосомального цистеинового протеолиза от клинических особенностей течения заболевания у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей 73
3.3.1. Зависимость показателей лизосомального цистеинового протеолиза от особенностей течения заболевания по международной классификации СЕАР у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей 73
3.3.2. Зависимость показателей лизосомального цистеинового протеолиза от ЛИИм у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей 75
3.3.3. Зависимость показателей протеолиза от динамики заболевания у пациентов с острым венозным тромбозом 79
3.3.4. Зависимость показателей протеолиза от уровня лейкоцитоза у пациентов с острым венозным тромбозом 81
3.3.5. Зависимость показателей лизосомального цистеинового протеолиза от показателей воспалительной реакции: ЛИИм, СРБ, сиаловых кислот у пациентов с острым венозным тромбозом 84
3.4. Изучение лизосомального цистеинового протеолиза в условиях моделирования экспериментального венозного тромбоза 91
Глава 4. Заключение
Список сокращений 117
Список литературы
- Факторы оксидативного и нитрозативного стресса, как возможный регулятор активности лизосомальных цистеиновых протеиназ
- Фракционирование лейкоцитов
- Изучение влияния процессов оксидативного стресса на показатели протеолиза у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей
- Зависимость показателей лизосомального цистеинового протеолиза от показателей воспалительной реакции: ЛИИм, СРБ, сиаловых кислот у пациентов с острым венозным тромбозом
Факторы оксидативного и нитрозативного стресса, как возможный регулятор активности лизосомальных цистеиновых протеиназ
Было выдвинуто предположение, что активные катепсины из поздних эндосом или лизосом секретируются во внеклеточное пространство через Са2+-зависимое слияние этих органелл с клеточной мембраной. Во время выхода гидролаз из поздних эндосом на поверхности последних образуются дополнительные пузырьки, а свободные М-6-Ф-рецепторы возвращаются в транссеть Гольджи. На последних этапах связывания в транс-Гольджи некоторые гидролазы «теряются», то есть секретируются. При этом некоторые М-6-Ф-рецепторы направляются к клеточной поверхности путём случайного попадания в секреторные пузырьки, предназначенные для клеточной мембраны. Таким образом, М-6-Ф-рецептор становится интегральным белком, в котором М-6-Ф-домен направлен наружу клетки. Секретируемые гидролазы, связываются с этим рецептором и в процессе эндоцитоза поступают в эндолизосомный комплекс [89].
Ограничение активации, таким образом, является важным моментом в регулировании активности катепсинов [253 ].
Как уже было отмечено ранее, катепсины синтезируются в виде неактивных предшественников, имеющих в своей структуре N - концевой пропептидный участок, а активируются путём удаления данного фрагмента. In vitro отщепление пропептида может происходить под действием других протеаз, например, катепсина D, пепсина, нейтрофильной эластазы и других цистеиновых протеиназ, либо путём аутоактивации [29] при кислых значениях рН [109, 280]. В данном процессе одна из молекул катепсина активирует другие, начиная, таким образом, цепную реакцию. После активации катепсины обладают мощнейшим разрушительным потенциалом, так как общая концентрация активных форм внутри лизосом может резко повышаться.
Известно, что аутокаталитический процессинг катепсинов В и L значительно ускоряется в присутствии различных гликозаминогликанов вплоть до рН 6,0 [168]. Гликозаминогликаны в процессе метаболизма сосредоточены в лизосомах [297], поэтому они могут вовлекаться в аутокаталитический процессинг ЛЦП in vivo за счёт ослабления внутримолекулярных взаимодействий между пропептидным фрагментом и каталитическим участком молекулы фермента.
В последние годы многие исследователи сосредоточили своё внимание на изучении аутокаталитического процессинга ЛЦП именно в кислой среде, так как снижение рН, возможно, ослабляет взаимодействие между пропептидным участком и зрелой частью фермента, что было показано работами по изучению взаимодействия катепсинов L и В с их пропептидами [12]. Ещё одним механизмом аутокаталитического процессинга может явиться расширение сайта активного центра фермента за счёт изменения рН (что, например, было показано для зрелого папаина), смещения пропептидного фрагмента закупоривающей петлёй (что было предложено для катепсина В), а также незначительными локальными структурными изменениями в пропептидном участке, что характерно для катепсина L [288]. Вследствие этого, профермент, предположительно, претерпевает конформационные изменения и связь пропептида с активным центром ослабляется при неизменённой вторичной структуре [110].
Активность и функционирование зрелых ЛЦП регулируются тремя группами эндогенных ингибиторов [29, 174, 289]: 1) стефинами (цистатины А, В и др.- внутриклеточные ингибиторы цистеиновых протеиназ); 2) собственно цистатинами (цистатины С, SN, SA, S. D и др.), локализующимися, главным образом, внеклеточно; 3) кининогенами.
Наиболее изученной является группа цистатинов, относящихся к низкомолекулярным одноцепочечным белкам. Многочисленные исследования показали, что цистатины синтезируются с постоянной скоростью всеми ядросодержащими клетками, свободно фильтруются через клубочковую мембрану почек, полностью метаболизируются в почках и не секретируются проксимальными почечными канальцами. В связи в этим сформировалось утверждение, что цистатин С можно считать более чувствительным маркёром скорости клубочковой фильтрации при умеренном нарушении функции почек по сравнению с традиционным креатинином [74, 202,203].
Все цистатины способны обратимо связываться с активным сайтом, конкурируя с субстратом фермента. Большинство цистатинов млекопитающих представляют собой полипептидную цепь, состоящую из 100-120 аминокислотных остатков с молекулярной массой 13-14 кД. Полипептидная цепь в области, близкой к карбокситерминальному концу, имеет два дисульфидных мостика. Цистатины, в отличие от стефинов, имеют дополнительный фрагмент, так называемый сигнальный пептид, позволяющий им функционировать вне клетки. Поэтому их можно найти в относительно высоких концентрациях во многих биологических жидкостях.
Из 12 известных цистатинов наиболее изученным является цистатин С [96], именно он является наиболее сильным ингибитором. Он представляет собой негликозилированный белок, мономер, содержит дисульфидные остатки цистеина. Имеет молекулярную массу 13,343 - 13, 359 кДа и изоэлектрическую точку при рН 9,3; кодируется геном CST 3 [181, 224].
По своему строению цистатин идентичен пост-гамма-глобулину. Впервые был выявлен в спинномозговой жидкости и моче у пациентов с почечной недостаточностью [233]. Электрофоретическая подвижность цистатина С совпадала с областью гамма-глобулинов, поэтому первое его название звучало, как «гамма-цереброспинальный флюид». Дальнейшие исследования привели к тому, что он был найден во многих других жидкостях организма - плевральной, асцитной, а также в плазме крови.
Аминокислотная последовательность цистаина С, выделенного из мочи человека (рисунок 3), была расшифрована в 1981 году [170] и, поскольку не было обнаружено значительной гомологии с последовательностями любого белка, известного в то время, стало понятно, что данный белок принадлежит к совершенно новому суперсемейству. Молекула цистатина С состоит из пяти Р-складок и пяти а-спиральных участков. Ближе к С-терминальному концу располагаются две петли, образованные дисульфидными связями последовательно располагающихся четырёх остатков цистеина (рисунок 4).
Фракционирование лейкоцитов
Объектом исследования явились 3 - 4-х месячные конвенциональные половозрелые крысы-самки линии Wistar массой 200 - 400 г в количестве 24-х особей, полученные из вивария ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
Все эксперименты на животных выполнены согласно Приказу МЗ-РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Содержание лабораторных животных осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г).
Животные содержались по 3 - 4 особи одного пола в металлических клетках площадью 24 дм2 при естественном освещении, получали воду и полнорационный сухой комбикорм для лабораторных животных «Чара» (производство ЗАО «Ассортимент - Агро», Московская область, Сергиев - Посадский район, д. Тураково). Перед хирургическим вмешательством животных наркотизировали. Предварительно, за 15 минут до подачи наркоза, проводили премедикацию введением «Рометара» внутримышечно, наркоз осуществлялся введением препарата «Золетил» внутримышечно.
Воспроизведение тромбоза у экспериментальных животных осуществляли путём лигирования общей подвздошной вены [190, 255] одной конечности. Операция проводилась в специально оборудованной операционной вивария ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
В ходе операции определяли пульсацию подвздошной артерии и в месте её проекции производили разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 4 - 5 см. Тупо расслаивая мышцы, выделяли сосудисто-нервный пучок, определяли в нём общую подвздошную вену и перевязывали её.
Забор крови у пациентов производился однократно до начала лечения утром в одно и то же время из локтевой вены натощак в количестве 15 мл. В качестве антикоагулянта использовали раствор ЭДТА, приготовленный из расчёта 1,5 мг антикоагулянта на 1 мл крови.
С целью осаждения эритроцитов к крови, стабилизированной ЭДТА, добавляли 6% декстран 500 (6% раствор декстрана с молекулярной массой от 50 тыс. до 70 тыс. в изотоническом растворе NaCI, ОАО «Красфарма», Россия) в соотношении 1:10 и смесь отстаивали 15-30 минут [45]. По истечении этого времени надосадочную взвесь лейкоцитов в плазме отбирали при помощи шприца с иглой большого диаметра и использовали для дальнейшего разделения путём изопикнического центрифугирования.
Получение материала для исследования у экспериментальных животных За 12 часов до выведения животных лишали корма, забой производился в утренние часы (8-9 часов утра). Выведение животных из эксперимента осуществлялось на первые, третьи, пятые сутки после операции путём эвтаназии под эфирным наркозом.
Дополнительно, немедленно после выведения животного из эксперимента, извлекали сосуды: участок вены ниже места лигирования (тромбированная вена) и симметричный участок вены другой конечности (интактная вена). В качестве контроля использовались участки общей подвздошной вены интактных животных, сопоставимых по возрасту, массе и условиям содержания с экспериментальными особями.
Для выделения различных фракций лейкоцитов эритроциты осаждали 6% раствором декстрана, после чего плазму, обогащенную лейкоцитами, наслаивали в соотношении 3:1 на смесь полиглюкина с 76% верографином (плотность 1,077) и центрифугировали при 200 g в течение 25 минут. Интерфазный слой, содержащий мононуклеары, отбирали и центрифугировали при 600 g в течение 10 минут для отделения от плазмы. Осадок гранулоцитов обрабатывали 0,9 % раствором хлорида аммония для удаления остаточных эритроцитов и центрифугировали 10 минут при 600 g. Полученные осадки лейкоцитов троекратно отмывали 0,15 М раствором хлорида натрия в соотношении 5:1 и пропускали через капроновый фильтр для удаления конгломератов клеток и подсчитывали в камере Горяева, используя микроскоп бинокулярный Р-15 «Биолам» фирмы ЛОМО.
Чистоту разделения лейкоцитов проверяли микроскопией окрашенных мазков из интерфазы и осадка (микроскоп бинокулярный Р-15 «Биолам»). Содержание мононуклеаров составляло 96,1%, полиморфноядерных лейкоцитов -95,6%. 2.3.2. Получение гомогената лейкоцитов
Полученные описанным выше способом осадки отмытых лейкоцитов доводили до концентрации 106 - 107 клеток/мл дистиллированной водой с добавлением раствора тритона X - 100 в конечной концентрации 0,1% и подвергали трёхкратному замораживанию - оттаиванию для окончательного разрушения плазматических и лизосомальных мембран. Гомогенизация производилась пипетированием через иглу малого диаметра. Нерастворимый материал осаждался центрифугированием (600 g, 10 минут). Супернатант использовался для определения активности ферментов.
Для получения гомогената ткани стенки сосудов немедленно, после выведения животного из эксперимента, извлеченные вены очищали от жировой ткани и взвешивали на торсионных весах. Затем измельченную ткань сосуда помещали в холодный 0,25 М раствор сахарозы и гомогенизировали в течение 60 секунд при 1500 об/мин в гомогенизаторе «Potter S» производства фирмы «Sartorius Stedium Biotech, GmbH» (Германия). Описанные процедуры проводили при температуре не выше 4С.
Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 1000 g для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Супернатант обрабатывали раствором Тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1% для разрушения субклеточных мембран и использовали в качестве материала для дальнейшего исследования.
Определение активности катепсинов L и Н Активность катепсинов L и Н изучали спектрофлуориметрическим методом по Barrett и Kirschke [113] с измерением флюоресцирующего продукта реакции - 7-амидо-4-метилкумарина, образующегося при расщеплении специфических флюорогенных субстратов: №-карбобензокси-Ь-фенилаланил-аргинин-7-амидо-4-метилкумарина (М-СВ7-Р1іе-А -7-амидо-4-метилкумарин, «Sigma», USA) для катепсина L, аргинин - 7 - амидо - 4 - метилкумарина (Arg - 7 - амидо - 4 - метилкумарин, «Sigma», USA) для катепсина Н.
Принцип метода - количественное определение 7 - амидо - 4 -метилкумарина, высвобождающегося в результате энзиматического гидролиза пептидной связи из соответствующего субстрата.
Ход определения. К 0,4 мл субстратно - буферного раствора, содержащего 20 мкМ соответствующего субстрата, 8 мМ ДТТ и 2 мМ ЭДТА в буферном растворе с соответствующим значением рН (ацетатный буфер с рН 5,5 для катепсина L; Na/K фосфатный буфер с рН 6,8 для катепсина Н), преинкубированного в течение 2-х минут при 37С, добавляли 0,1 мл исследуемого материала. Реакционную смесь инкубировали в течение 60 минут при температуре 37С. Реакцию останавливали добавлением 2,0 мл раствора холодного 0,1 М ацетатного буфера рН 4,0. Контролем служила проба, содержащая те же компоненты, за исключением исследуемого материала с изучаемым ферментом, который вносился в конце инкубации непосредственно после добавления ацетатного буфера рН 4,0.
Продукты реакции определяли на спектрофлюориметре «System 3 Scanning Spectrofluorometr» производства «Optical technology devices, inc. Elmstord, New York, 10523» при X=360 нм (возбуждение) и X=440 нм (эмиссия).
Активность ферментов выражали в нмоль 7-амидо-4-метилкумарина/чх106 клеток для лейкоцитов, в нмоль 7-амидо-4-метилкумарина/чхл для плазмы крови, в нмоль 7-амидо-4-метилкумарина/г белка для гомогената стенки сосуда.
Изучение влияния процессов оксидативного стресса на показатели протеолиза у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей
На следующем этапе своего исследования мы оценили корреляцию активности катепсинов с другими показателями воспаления - СРБ и сиаловыми кислотами. СРБ является мультифункциональным белком и вместе с 30 другими представителями белков плазмы крови относится к белкам острой фазы (БОФ). Он играет большую роль при воспалительных реакциях, при защите от чужеродных агентов и в аутоиммунных процессах. Доказано, что имеется положительная корреляция между изменениями уровня СРБ и тяжестью и динамикой клинических проявлений [14]. СРБ был выделен из сыворотки крови методом аффинной хроматографии и был назван «нативным». Он состоит из 5 одинаковых субъединиц молекулярной массой 21 - 23 кД каждая. В 1983 году была обнаружена новая форма СРБ с большей подвижностью при электрофорезе и более низкой растворимостью. Эта, так называемая «нео-СРБ» форма, ускоряла агрегацию тромбоцитов и секрецию серотонина, регулировала метаболизм арахидоновой кислоты, инициировала высвобождение интерлейкинов. Позже было выяснено, что данная форма является мономером и имеет отличные от нативной формы СРБ антигенные детерминанты. С помощью моноклональных антител антигены «нео»-СРб были обнаружены на поверхности лимфоцитов крови человека. Впоследствии было выяснено, что в культуре эндотелиальных клеток артерий человека «нео» - СРБ вызывает быстрое повышение концентрации хемоаттрактантного белка -1 моноцитов, интерлейкина -8, которые являются компенентами воспалительного ответа [143].
В нашем исследовании средняя концентрация С-реактивного белка в плазме крови больных острым венозным тромбозом составила 31,1 ± 23,8 мг/л и превысила показатели контрольной группы в 6,7 раза. Среднее значение сиаловых кислот в сыворотке крови данных пациентов составило 0,77 ± 0,42 ммоль/л и превысило показатели контрольной группы в 1,5 раза.
При подсчёте коэффициентов корреляции между активностью изучаемых ферментов в ПМЯЛ и показателями воспалительной реакции мы обнаружили положительную корреляцию высокой степени между активностью катепсина Н в МЯЛ и СРБ (г = 0,79), активностью катепсина Н в ПМЯЛ и СРБ (г = 0,49), корреляцию средней степени между концентрацией цистатина С в МЯЛ и СРБ (г = 0,3), а также корреляцию слабой степени между активностью катепсина L и концентрацией сиаловых кислот в плазме крови (г = 0,28) и слабую положительную корреляцию между активностью катепсина Н и концентрацией СРБ (г = 0,15). Различные воспалительно-дистрофические и аутоиммунные заболевания, а также злокачественный рост сопровождаются нарушением целостности соединительной ткани. Сиаловая кислота (N-ацетилнейраминовая кислота), входит в состав гликопротеидных комплексов, таких как гликопротеины, гликолипиды (ганглиозиды), олигосахариды. При отщеплении ее содержание в сыворотке крови, в выделяемом слизистых оболочек и в других биологических жидкостях организма увеличивается. Это обуславливает возможность использования изменения концентрации сиаловых кислот в качестве одного из надежных биохимических параметров, характеризующих активность воспалительного процесса.
Наличие сиаловых кислот в составе белков крови (церулоплазмина, кислого al-гликопротеина и др.) и некоторых гормонов (хорионического гонадотропина, фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов) определяет длительность циркуляции этих соединений в кровотоке. После отщепления сиаловых кислот эти белки поглощаются клетками печени. Именно этим объясняется потеря гормонами биологической активности. Длительность циркуляции в кровотоке некоторых клеток крови, например, эритроцитов и, в частности, лимфоцитов также зависит от наличия или отсутствия сиаловых кислот на их поверхности.
Оценка корреляционных связей зависимости показателей протеолиза от клинических особенностей теченияострого венозного тромбоза
При оценке корреляционных связей активности катепсинов L и Н, концентрации цистатина С в плазме и лейкоцитах крови пациентов с острым венозным тромбозом с уровнем лейкоцитоза была выявлена отрицательная корреляционная связь средней степени между активностью катепсина Н в плазме и уровнем лейкоцитоза (г = -0,33) (таблица 15). При оценке корреляционных связей были обнаружены корреляции средней степени между активностью катепсина L в МЯЛ и коэффициентом аутокаталитической активации катепсина Н в МЯЛ и ЛИИм.
Таким образом, очевидно, что наиболее выраженная связь у пациентов с острым венозным тромбозом определяется между активностью катепсина Н в МЯЛ и концентрацией СРБ в плазме крови г = 0,79 (р=0,00002), а также между активностью катепсина L и концентрацией сиаловых кислот в ПМЯЛ крови г = 0,49 (р=0,02), что может явиться показателем степени воспалительного процесса при остром венозном тромбозе. При корреляционном анализе, отражающем связи процессов протеолиза и динамикой заболевания мы отметили прямые корреляционные связи средней степени между концентрацией цистатина С в плазме и сутками от начала заболевания г = 0,43 (р=0,005); а также активностью катепсинов L г = 0,45 (р=0,003) и Н 0,35 (р=0,03) в ПМЯЛ.
Кроме того, были отмечены прямые корреляционные связи средней степени между коэффициентом аутокаталитического действия для катепсина Н в плазме г = 0,35 (р=0,05), для катепсина Н в МЯЛ г = 0,32 (р=0,04) и ЛИИм.
Высокая степень корреляции активности катепсина Н в моноядерных лейкоцитах с ЛИИм, с СРБ у пациентов с острым венозным тромбозом может подтвердить участие данного фермента в патогенезе заболевания.
Зависимость показателей лизосомального цистеинового протеолиза от показателей воспалительной реакции: ЛИИм, СРБ, сиаловых кислот у пациентов с острым венозным тромбозом
Кроме того, были обнаружены корреляционные связи: высокой степени -между активностью катепсина Н в МЯЛ и СРБ (г=0,79), средней степени - между активностью катепсина L в ПМЯЛ и сиаловыми кислотами (г=0,49), ЛИИ и коэффициентом аутокаталитического действия катепсина Н в плазме (г=0,35) и МЯЛ (г=0,32), цистатином С в плазме и динамикой процесса (г=0,43), активностью катепсинов L и Н в ПМЯЛ (г=0,45) и (г=0,35) соответственно, активностью катепсина L в МЯЛ и ЛИИ (г=0,31).
В настоящее время известно, что повышенные концентрации СРБ достоверно могут предсказать атеротромботические события и указывают на ключевую роль воспаления в атерогенезе. Доказано, что риск сердечной патологии, вызываемый СРБ, может быть связан с его повреждающим действием на стенки сосудов [14]. Полученный в результате исследований факт связи активности катепсина Н в МЯЛ согласуется с данными литературы о том, что СРБ может вызывать быстрое повышение компонентов воспалительного ответа, таких как хемоаттрактантный белок моноцитов, возможно в этом процессе принимает активное участие катепсин Н, содержащийся в МЯЛ .
Поэтому, следующим этапом нашего исследования явилось экспериментальное моделирование острого венозного тромбоза и изучение процессов протеолиза в плазме, ПМЯЛ, МЯЛ и стенках тромбированных и интактных сосудов крыс.
Сравнивая изменения активности катепсинов L и Н в динамике острого венозного тромбоза в клинических и экспериментальных исследованиях, мы отметили однонаправленную тенденцию изменения активности изучаемых ферментов в плазме и ПМЯЛ с той лишь разницей, что пик активности для катепсина L у пациентов приходился на первые сутки, для катепсина Н - на третьи сутки, а у экспериментальных животных максимум для двух катепсинов отмечался на пятые сутки. В ПМЯЛ максимум активности изучаемых ферментов был отмечен у пациентов на пятые сутки, у крыс - на первые.
Активность катепсинов в МЯЛ демонстрировала некоторые отличия. У пациентов мы наблюдали снижение активности изучаемых ферментов ниже контрольных значений, а у крыс такое снижение наблюдалось только для катепсина L к пятым суткам. Активность же катепсина Н была максимальной на первые сутки, снижалась к пятым, но так и не достигла уровня контрольных значений.
То есть, в ходе экспериментально моделированного тромбоза у крыс, мы видим, что однонаправленную тенденцию имеет активность изучаемых катепсинов в плазме и ПМЯЛ крови: активность как катепсина L, так и катепсина Н повышается. В моноядерных лейкоцитах мы отмечаем снижение активности изучаемых катепсинов у людей, но, в то же время, активность катепсинов у крыс в данной фракции клеток увеличивается, особенно выражено увеличение активности катепсина Н. Такие результаты могут быть обусловлены тем, что у крысы, в отличие от человека, основным пулом лейкоцитов являются лимфоциты (до 77%), принадлежащие к МЯЛ. Таким образом, возможно, что часть МЯЛ у крыс инфильтрирует сосудистую стенку и выходит в паравазальное пространство, а часть МЯЛ после моделирования тромбоза остаётся циркулировать в крови.
В целом, изменения активности катепсинов L и Н в динамике острого венозного тромбоза у пациентов с данной патологией подтверждаются исследованиями изменений активности катепсинов в динамике экспериментального тромбоза у крыс. Кроме того, они согласуются с проведёнными ранее исследованиями по моделированию венозного тромбоза [21, 48, 85], в которых на третьи-пятые сутки отмечается активная десквамация эндотелия, при электронно-микроскопическом исследовании он выявляется лишь на небольших участках интимы. С этим событием может быть связан активный выход катепсинов в плазму, где мы и отмечали подъём их активности. Далее в средней оболочке между ГМК наблюдается умеренная диффузная лейкоцитарная инфильтрация и выход лейкоцитов в окружающую сосуд соединительную ткань. Отмечая подъём активности катепсинов в ПМЯЛ и снижение в МЯЛ, мы получли ещё одно доказательство теории лейкоцитарной агрессии и предполагаем активное участие лизосомальных цистеиновых протеиназ - катепсинов L, и, возможно, в большей степени Н, содержащихся в лейкоцитах, в патогенезе острого венозного тромбоза.
Также в процессе моделирования острого венозного тромбоза мы получили данные, что процессы спонтанной окислительной модификации белков сосудистой стенки являются неотъемлемой составляющей в патогенезе острого венозного тромбоза в эксперименте и имеют динамическое развитие. На основании полученных данных можно предположить, что окисленные белки стенки вены являются активными участниками свободнорадикального повреждения клеток при данной патологии.
В течении острого венозного тромбоза в динамике эксперимента преобладают АДНФГ - маркёры первичного повреждения белков, что также согласуется с данными, полученными в клинических исследованиях. Преобладание первичных маркёров повреждения белков может указывать на начальные стадии ОС и возможную обратимость процесса.
Все вышеизложенное позволяет предположить, что процессы окислительной модификации белков могут явиться фактором регуляции активности лизосомальных цистеиновых протеиназ.
Изменение активности изучаемых ферментов, и в большей степени катепсина Н моноядерных лейкоцитов, подтверждает факт их участия в развитии ОС и согласуется с полученными данными, что именно ЛЦП данной лейкоцитарной фракции могут являться активными участниками процессов развития ОС в патогенезе заболеваний вен нижних конечностей: варикозного расширения вен и острого венозного тромбоза.
Таким образом, две социально значимые венозные патологии - варикозное расширение вен нижних конечностей и острый венозный тромбоз протекают на фоне изменения активности катепсинов L и Н, как в плазме, так и в различных фракциях лейкоцитов крови, что ещё раз доказывает вовлечённость лейкоцитов в патогенез данных заболеваний. Обе патологии сопровождаются изменением уровня карбонилированных белков в плазме и лейкоцитах. Кроме того, экспериментальные исследования демонстрируют вовлечённость процессов окислительной модификации белков и изменённого протеолиза сосудистой стенки в патогенез венозного тромбоза.