Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Внеклеточные гликолипиды дрожжевых грибов 9
1.1. Распространение и структура внеклеточных гликолипидов 9
1 2.Условия образования внеклеточных гликолипидов, пути биосинтеза и их 16
генетическая детерминация
1.3. Методы очистки внеклеточных гликолипидов 19
1.4. Биологическая активность и перспективы практического использования 22 внеклеточных гликолипидов дрожжевых грибов
Глава 2, Материалы и методы исследования 30
2.1. Объекты исследования 30
2.2.Состав среды и условия культивирования 31
2.3.Очистка гликолипидов 32
2.4.Тонкослойная хроматография 33
2.5.Метанолиз гликолипидов 34
2.6.Углеводный анализ 34
2.7.Масс-спектрометрический анализ 34
2.8.ЯМР-спектроскопия 35
2.9.Определение антифунгальной активности по подавлению роста тест-культур 35
на агаризрованной среде
2ДО.Определение выживаемости клеток дрожжей после обработки гликолипидами
2.11.Определение выхода АТФ из клеток дрожжей 37
2.12. Окрашивание бромкрезоловым пурпурным 37
2. ІЗ.Измерение закислення среды клетками Sacchawmyces cerevisim 38
2.14.Получениесферопластов из клеток Saccharomyces cerevisiae 38
2.15.Определение влияния целлобиозолипида В на накопление ортофосфата и полифосфатов у Sacchammyces cerevisiae.
2,16. Определение ортофосфата 39
2.17.0пределение содержания поляфосфатов 40
2.18.Определение активности снглюкозидазы 40
Глав» 3. Результаты исследования и их обсуждение 42
3.1. Получение антифунгальных гликолипидов из культуральной жидкости дрожжевых грибов
3.2.Физико-химические свойства и структура целлобиозолипидов 46
3.2. .Растворимость в воде и органических растворителях 46
3,2.2.Стабильность при хранении 46
3,2.3.Структура целлобиозолипидов 48
З.З. Антифунгальная активность целлобиозолипидов. 59
З.ЗЛ. Влияние целлобиозолипидов на рост и выживаемость дрожжей и грибов 59
3.3.2.Мембраноповреждающее действие целлобиозолипидов 69
3.3,2.1.Выход АТФ из клеток дрожжей при обработке целлобиозолипидами 69
3.3.2.2,Дополнительные методы оценки мембраноповреждающего действия целлобиозолипидов
3.3.2.3.Действие целлобиозолипида В на сферопласты и синтез полифосфатов у Sacchammyces cerevisiae
Заключение 82
Выводы 89
Список цитируемой литературы 90
Обзор литературы. Внеклеточные гликолипиды дрожжевых грибов
- Распространение и структура внеклеточных гликолипидов
- Объекты исследования
- Получение антифунгальных гликолипидов из культуральной жидкости дрожжевых грибов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск и характеристика новых антибиотических соединений, актуальны для понимания механизмов антагонистических взаимоотношений между микроорганизмами и борьбы с возбудителями различных заболеваний. У дрожжей антагонистические взаимоотношения преимущественно обеспечиваются секрецией в окружающую среду так называемых киллер-токсинов (микоцинов), специфических белков (или гликопротеинов), обладающих активностью против определенных таксонов (Makover and Bevan, 1963; Thornton, 1986; Heard and Fleet, 1987; Sawant et al., 1989; Stark et al., 1990; Голубев, 1991; McCracken et a!, 1994, Wickner, 1996; Klassen and Meinhardt, 2003; Golubev, J 998, 2006). Однако, далеко не всегда антибиотическая активность, проявляемая грибами, включая дрожжевые грибы, обеспечивается синтезом микоцинов. Грибы, также как и бактерии, способны изменять окружающую среду продуктами своего метаболизма, сохраняющими их доминирующую позицию за счет создания условий неблагоприятных для выживания других микроорганизмов. Например, антибактериальная активность дрожжей обычно вызывается изменениями рЫ в результате образования органических кислот (Лозинов и др., 1974) или этанола. Примером неспецифической антифунгальной активности также является секреция пульхерриминовой кислоты дрожжами Metschmkowia pulcherrima (Nguyen and Panon, 1998), Это соединение подавляет рост дрожжей благодаря тому, что связывает в комплекс необходимые для них ионы железа. Многие грибы продуцируют низкомолекулярные антифунгальные соединения, относящиеся к алкалоидам и полнкетидам, например патулин, фумагиллин и цитринин (Cole and Сох, 1981).
Сравнительно недавно обнаружены штаммы дрожжей, продуцирующие антифунгальные соединения с широким спектром действия, включающим дрожжи далеких друг от друга филогенетических групп, относящихся как к аскомицетам, так и к базидиомицетам (Golubev and Schabalin, 1994; Голубев и др., 2003). Данные соединения имеют низкую молекулярную массу (не свыше 1000 Да), термостабильны и устойчивы к действию протеиназ. К началу настоящей работы природа и структура таких антифунгальных соединений, оказавшихся целлобиозолипидами, была установлена только для штамма 9-6 дрожжей Cryptococcus humicola (Puchkov et al., 2002). Антифунгальная активность обнаружена и у другого целлобиозолнпида, секретируемого Psendozymaflocculosa (МІіпее et al,, 2005).
На сегодняшний день в литературе имеется лишь небольшое число работ, посвященных исследованию внеклеточных целлобиозолиподов дрожжевых грибов, их структуре и биологической активности (Haskins and Thorn 1951; Lemieux 1951, Lemieux et al. 1951; Bhattacharjee et al. 1970, Spoeckner et al. 1999; Puchkov et al, 2002; Голубев и др., 2003; Mimee et al., 2005), причем только в последних из них приводятся данные об антифунгальной активности этих соединений. В то же время, исследование этих соединений позволяет расширить наши представления о механизмах антагонистического взаимодействия дрожжеподобных грибов в сообществах, а с другой стороны, широкий спектр антифунгальной активности указанных гликолипидов, их стабильность, в том числе термостабильность, позволяют рассматривать данные соединения в качестве перспективных антифунгальных агентов. В связи с этим представляется актуальным определить природу антифунгальных соединений у неизученных в этом отношении видов и штаммов дрожжевых грибов, поддерживаемых в ВКМ и характеризующихся секрецией антифунгальных соединений, которые по своим свойствам (низкая молекулярная масса, термостабилыюсть, широкий спектр действия) по всей видимости не относятся к микоцинам.
Цели и задачи работы. Целью данной работы была очистка и установление структуры соединений, обуславливающих антифунгальную активность дрожжевых грибов, относящихся к родам Pseitdozyma, Sympodiomycopsis, и Ctyplococciis, а также изучение механизма действия этих соединений на клетки дрожжевых грибов.
6 Были поставлены следующие задачи:
Очистить низкомолекулярные антифунгальные соединения, продуцируемые тремя видами головневых дрожжей родов Pseudozyma и Sympodiomycopsis и тремелловыми дрожжами Cryptococcus humicola.
Изучить физико-химические свойства и определить структуру антифунгальных соединений, продуцируемые 1б-ю штаммами указанных дрожжевых грибов.
Исследовать механизм действия данных соединений на клетки дрожжей.
Научная новизна работы. В данной работе у двух видов дрожжевых грибов рода Pseudozyma и Sympodiomycopsis paphiopedili впервые обнаружены внеклеточные целлобиозолипиды, обладающие фунгицидным действием. Разработан эффективный способ очистки целлобиозолишдов из культуральной жидкости штаммов-продуцентов. Установлено, что Sympodiomycopsis paphiopedili секретирует целлобиозолипид А, представляющий собой (3-В-глюкопиранозил-(1—*4)-Р-В-глюкопиранозил-(1-*16)-2,15,16-тригидроксигексадекановую кислоту. Представители рода Pseudozyma секретируют целобшзолипид В, представляющий собой (2-0-3-гидроксигексаноил-P-D-глюкопиранозил-( 1 —*4)-(6-0-ацетил-(3-В-глюкопиранозил-(1 —* І 6)- 2,15,16-тригидроксигексадекановую кислоту. Эти целлобиозолипиды отличаются от известных ранее антифунгальных целлобиозолипидов Cryptococcus humicola отсутствием или уменьшенным количеством ацетатных групп в остатке целлобюзы, наличием остатка 3-гидроксикапроновой кислоты в качестве О-заместителя (для рода Pseudozyma) и дополнительной гидроксильной группы в остатке пальмитиновой кислоты.
Показано исследованные целлобиозолипиды обладают фунгицидным действием при кислых значениях рН среды и активны против широкого спектра дрожжевых и мицелиальных грибов, включая виды, патогенные для растений, животных и человека.
7 С помощью нескольких методов, таких как измерение выхода АТФ, фосфата и а- глюкозидазы из клеток и сферопластов, окрашивание клеток бромкрезоловым пурпурным, показано, что основой механизма фунгицидного действия этих соединений являются их мембраноповреждающие свойства.
Научно-практическое значение. Полученные в работе данные изменяют представления о функциях внеклеточных гликолипидов дрожжевых грибов и открывают возможности их нового практического применения. Сведения о действии изученных гликолипидов на дрожжевые и мицелиальные грибы, вызывающих заболевания человека, животных и растений, представляет интерес для разработки на их основе фунгицидов нового поколения. Изучаемые соединения могут быть использованы в качестве мембрановдвреждающих агентов в исследовательских целях.
Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на 80н и 9ой Международной Лущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 2Г века» (Пущино, 2004, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей.
Благодарности. Автор приносит искреннюю благодарность и признательность научным руководителям члену-корреспонденту РАН Игорю Степановичу Кулаеву и доктору биологических наук Владиславу Ивановичу Голубеву за постоянное внимание к работе и плодотворное обсуждение результатов. Автор благодарит доктора химических наук А.С. Шашкова (ИОХ им. Зелинского РАН) за проведение ЯМР-спектроскопического и масс-спектрометрического анализов, В. Я, Лысанскую (ИЕФМ им. Г.К.Скрябина РАН) за проведение углеводного анализа, а также сотрудников лаборатории регуляции биохимических процессов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН за содействие при выполнении работы и активное обсуждение результатов.
8 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Ї. Kulakovskaya, T.V., Kulakovskaya, E.V. and Golubev, W.I. ATP leakage from yeast cells treated by extracellular glycolipids of Pscudozyma fimformaia. FEMS Yeast Res. 2003, v. 3, p. 401-404. Kulakovskaya T.V., Shashkov A.S., Kulakovskaya E.V., GolubevW.I. Characterization of antifungal glycolipid secreted by the yeast Sympodiomycopsis paphiopedili, FEMS Yeast Research, 2004, v. 5, p. 247-252,
В.И. Голубев, Т.В.Кулаковская, Е.В.Кулаковская, Н.В.Голубев. Фунгицидная активность внеклеточного гликолипида Sympodiomycopsis paphiopedi/i Sugiama et al. Микробиология, 2004, т.75, № 6, с. 841-845. Kulakovskaya T.V., Shashkov A.S., KulakovskayaE.V., and Golubev^/.I. Ustilagig acid secretion by Pseudozyma fusiformata strains FEMS Yeast Res., 2005, v. 5, p. 919-923. E. В. Кулаковская, В. И, Голубев, И. С. Кулаев. Внеклеточные антифунгальиые гликолипиды дрожжей Cryptococcus humicola. Доклады Академии Наук, 2006, т. 410, №3, с. 422-424.
Е.В. Кулаковская Очистка и характеристика антифунгальных гликолипидов, секретируемых головневыми дрожжами. Биология-наука XXI века. 8-я Международная Пущинская конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущино, 20G4 г., с. 153.
Е.В.Кулаковская Действие целлобиозолипидов, секретируемых Psevdozyma fusiformaia на накопление полифосфатов у Saccharomyces cerevisiae. Биология-наука XXI века. 9-я Международная Пущинская конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущино, 2005 г., с. 198.
Распространение и структура внеклеточных гликолипидов
Гликолипиды представляют собой соединения, содержащие один или более моносахаридных остатков, гидроксильные группы которых замещены различными жирными кислотами (Кейтс, 1974; Ratledge and Wilkinson, 1988). Такие соединения широко распространены у микроорганизмов. Гликолипиды играют важную роль в построении и функционировании мембран и клеточных стенок, а также в различных сигнальных процессах. В связи с многообразием структуры и функций этих соединений, далее будут рассмотрены только внеклеточные гликолипиды дрожжевых грибов.
Ранее, когда современные методы определения структуры были недостаточно развиты, широко применяли трудоемкие методы химического определения структуры гликолипидов, основанные на различных способах гидролиза этих соединений, очистке получаемых компонентов - Сахаров и жирных кислот и их химической идентификации. В настоящее время установление строения гликолипидов чаще всего проводят с ПОМОЩЬЮ таких методов как масс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия.
Впервые внеклеточные гликолипиды были выделены из культуральной жидкости гриба Ustilago maydis (Haskins and Thorn, 1951; Lemieux, 1951, Lemieux et al., 1951; Bhattacharjee et al., 1970, Frautz et al, 1986, Lang and Wagner, 1987, Kitamoto et al., 2002). Данные гликолипиды были названы в соответствии с родовым названием продуцента устилаговыми кислотами (Haskins and Thorn, 1951; Lemieux, 1951; Lemieux et al., 1951; Bhattacharjee et al., 1970).
Объекты исследования
В качестве объектов исследования при получении антифунгальных соединений использовали дрожжевые грибы, способные подавлять рост широкого спектра грибов и дрожжей и секретирующие термостабильные низко молекулярные вещества по всей видимости не относящиеся к микоцинам. Это были следующие базидиомицетные дрожжи: Sympodiomycopsis paphiopedilt (Sugiyama et al.) BKM Y-2817, Cryptococcus humicota (Daszewska) Golubev BKM Y-2238, Y-1613, 9-6 (получен В.И. Голубевым путем селекции наиболее активных культур), Х-397 и Х-297 (выделены с растений Дальневосточного заповедника «Кедровая падь» (Голубев, 1992), а также Pseudozyma fusiformata (Buhagiar) Boekhout BKM Y-2821, Y-2S98, Y-2909, Ll-16, Ll-41, Ll-71 и Pseudozyma sp. BKM Y-2938 и Ll-46 (выделены В.И. Голубевым с кормовых трав, взятых в Московской области), и Pseudozyma fusiformata ПТЗ-351 и ПТЗ-356 (выделены с растительности в Приокско-Террасном заповеднике (Голубев и Голубева, 2004).
В качестве тест-культур для определения антифунгальной активности были использованы базидиомицетные дрожжи Oypiococcus tetreus (di Menna) BKM Y-2253 и Filobasidietta neoformans (Kwon-Chung) IGC 3957 (Коллекция института Гульбекяна, Португалия), аскомицетные дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Meyen) Hansen BKM Y-1173, Candida albicans (Robin) Berkhont JCM 1542 (Японская коллекция микроорганизмов), Clavispora lusitaruae (Rodrigues de Miranda) IGC 2705 (Коллекция института Гульбекяна, Португалия), Candida glabrata (Anderson) Meyer et Yarrow CBS 138 и Candida viswanathii (Viswanathan et Randhawa) Sandhu et Randhawa CBS 4024 (Центральная коллекция чистых культур грибов, Нидерланды), мицелиальные грибы Phomopsis helianthi (Muntanjola-Cvetcovich et al.), Sclerotima sderotiorum (Libert) de Вагу (получены из Кубанского института масличных культур, Краснодар), Mortierella isabellina (Oudemans) BKM F-526 и Mucor mitcedo (Brefeld) BKM F-1355, а также бактерии Acetobacter xytinum (Brown) Yamada BKM B-880.
Получение антифунгальных гликолипидов из культуральной жидкости дрожжевых грибов
Полученные препараты растворялись в 0,04 М цитрат-фосфатном буфере, по крайней мере до тех концентраций, которые образуются в процессе культивирования и которые использовали в экспериментах по определению антифунгальной активности (до 2 МҐ/МЛ). В деионизованной воде ни один из полученных препаратов не растворялся при 5-20С. Это свойство использовали в процессе очистки для отделения осадка антифунгальных веществ от растворимых в метаноле солей, Сахаров и других соединений, присутствующих в культуральной жидкости,
Все полученные вещества не растворялись в хлороформе, но были растворимы в пиридине и метателе, по крайней мере, до концентрации 20-50 мг/мл при 5-20(С. При концентрации свыше 50 мг/мл при использовании этих растворителей начинал образовываться осадок.
