Введение к работе
Актуальность проблемы. До недавнего времени была хорошо известна роль а-2-макроглобулина (МГ) как регулятора систем свертывания крови и фибринолиза, чистильщика крови от малоспецифичных протеиназ. Исследованиями последних 10 лет была показана возможность взаимодействия этого универсального эндогенного ингибитора протеолитических ферментов с некоторыми иммунными пептидами, в том числе цитокинами. В 1987 - 89 г. профессором И.Г. Щербаком была выдвинута гипотеза о возможности сорбции на а-2-макроглобулине белково-пептидных ингибиторов протеиназ и получены первые экспериментальные свидетельства этого феномена. Эти не связанные между собой поначалу данные и явились предпосылками настоящего исследования.
Уникальность а-2-макроглобулина заключается в способности связывать протеиназы всех четырех известных классов, а так же в особом механизме взаимодействия с этими ферментами. Являясь наиболее высокомолекулярным эндогенным ингибитором и одним из самых крупных белков в организме (молекулярная масса 720 кДа), МГ состоит из четырех полипептидных цепей, образующих две идентичные субъединицы. Каждая из них содержит участок, подходящий для атаки большинством известных протеиназ. Согласно теории Алана Барретта (1979-86 гг.), в результате гидролиза одной из пептидных связей в этом «приманочном» участке (bait region) в молекуле МГ открывается особая ловушка, куда «проваливается» протеиназа. Оказавшись «в плену», фермент не теряет полностью свою способность гидролизовать пептидные связи. Однако, субстратная специфичность протеиназы сужается. Фермент сохраняет способность гидролизовать относительно небольшие молекулы, а большинство крупных белковых субстратов становится для него недоступными.
Одним из существенных моментов в функционировании МГ является наличие в каждой из субъединиц так называемой тиол-эфирной петли, образованной радикалами цистеина и глутамата. Такой участок встречается крайне редко в молекулах белков и обнаружен в СЗ- и С4-компонентах комплемента и белке беременности, которые поэтому были отнесены к семейству макроглобулинов. При гидролизе тиол-эфирной связи, например, под действием первичных аминов или после взаимодействия с молекулой фермента, упомянутая выше ловушка закрывается, и МГ теряет способность дополнительно связывать
протеиназы. Электрофоретическая подвижность МГ с гидролизованными тиолэфирными связями несколько выше, чем у нативного, поэтому они получили название соответственно F (fast)- и S (5Іо\у)-форм. В последние годы показано, что F-формы МГ связываются с LRP-рецепторами на поверхности гепатоцитов и всех клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а затем поглощаются внутрь клеток.
Особая роль таких природных полипептидных молекул, как цитокины, заключается в том, что они обеспечивают взаимосвязи между иммунокомпетентными клетками, влияя на процессы пролиферации, дифференцировки и функциональную активность клеток. В условиях in vivo не встречается случаев изолированной продукции индивидуальных цитокинов, что позволяет говорить о существовании цитокиновой сети. Биологические эффекты цитокинов, как правило, дозозависимы. При массивном выбросе этих пептидов к местным эффектам присоединяются системные. Так, повышение концентрации фактора некроза опухолей альфа приводит к резкому расширению сосудов, повышению их проницаемости с развитием картины эндотоксического шока. Развитие системных эффектов провоспалительных цитокинов связано с попаданием в кровь и транспортированием этих пептидов ею. Таким образом, вопрос изучения механизмов транспорта, возможности связывания и деградации иммуноцигокинов приобретает огромную важность и для клинической медицины.
В исследованиях иммунологического плана в начале 90-х годов на феноменологическом уровне показана возможность взаимодействия таких пептидов как фактор некроза опухолей, интерлейкины 1, 2, 6 и дефензинов в крови с одной из форм а-2-макроглобулина. В одних случаях - это нативный макроглобулин, в других - макроглобулин, обработанный метиламином. Однако, в физиологических условиях такой модифицированной формы макроглобулина не существует, а результаты таких модельных экспериментов лишь частично отражают свойства макроглобулина, комплексированного с протеиназами. В большинстве работ, выполненных в иммунологических лабораториях, использовали белково-пептидные молекулы с радиоактивной меткой, не обладающие функциональной активностью. Более того, такая процедура может оказывать существенное влияние на комплексирование с белковыми молекулами, в том числе с а-2-макроглобулином.
Т. о., механизмы взаимодействия а-2-макроглобулина с биологически активными белково-пептидными молекулами, его биологическая и патофизиологическая роль пока остаются неизвестными. Интересной представляется и потенциальная возможность элиминации
провоспалительных цитокинов с использованием различных форм
макроглобулина. Попытки удаления цитокинов из плазмы крови и
модельных растворов с использованием иммобилизованных
моноклональных антител неоднократно предпринимались, однако, удовлетворительных результатов достигнуто не было.
Целью работы явилось выявление взаимосвязи между антипротеиназной функцией а-2-макроглобулина и его способностью к взаимодействию с пептидными молекулами, а также изучение механизмов и биологической роли такого взаимодействия. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:
-
Разработать новую методику выделения а-2-макроглобулина из плазмы крови человека с максимальным сохранением его нативных свойств
-
Изучить механизмы взаимодействия между иммунноцитокинами (фактор некроза опухолей а, интерлейкины 1 и 2) и а-2-макроглобулином, предварительно комплексированным с протеиназами различной специфичности.
3. Исследовать возможность конкуренции между отдельными
белково-пептидными молекулами за связывание с а-2-макроглобулином.
4. Изучить способность малоспецифичных прогеиназ,
комплексированных с макроглобулином, разрушать цитокины с утратой
их биологической активности.
-
Исследовать способность высокоспецифичных протеиназ, комплексированных с а-2-макроглобулином, к сорбции и транспорту пептидных молекул; способность макроглобулина влиять на биологическую активность цитокинов, возможность их "маскировки".
-
Изучить возможность влияния 'различных форм а-2-макроглобулина на комплемент- и токсин-зависимый лизис эритроцитов.
7. Разработать метод получения препаратов иммобилизованного
макроглобулина человека, пригодного для элиминации
туморнекротизирующего фактора а из биологических жидкостей.
Научная новизна исследования состоит в следующем: изучено влияние различных форм а-2-макроглобулина на биологически активные человеческие туморнекротизирующий фактор альфа, интерлейкины ір и 2. Показано, что комплексы туморнекротизирующего фактора а с макроглобулином обладают существенно более высокой биологической активностью, чем свободный цитокин, вызывая "кэпинг" специфических рецепторов на поверхности клеток-мишеней. Получены доказательства сорбции белково-пептидных молекул на поверхности а-2-макроглобулина
в плазме крови. На основе полученных результатов сформулированы новые представления о роли сс-2-макроглобулина как полифункционального протеина, в частности о существенном вкладе его антипротеиназной функции в реализацию избирательного взаимодействия с неферментативными белково-пептидными молекулами.
Научно-практическое значение работы. Работа имеет как теоретическое, так и прикладное значение. Разработана новая, "мягкая" методика выделения и очистки а-2-макроглобулина человека из плазмы крови человека, включающая повторную гель-хроматографию, диализ и ультрафильтрацию; эта методика позволяет максимально сохранить нативные свойства ингибитора.
С помощью разработанных новых модификаций методов
определения макроглобулина и его комплексов с протеиназами в
сыворотке крови показано, что в условиях гипертермии у человека
изменения уровней этих показателей коррелируют с типом регуляции
вегетативной нервной системы, тепловой устойчивостью организма и
выраженностью острофазного ответа. Разработан метод получения
аффинного сорбента на основе высокоочищенного а-2-макроглобулина и
подобраны оптимальные условия для элиминации
туморнекротизирующего фактора а из растворов и сыворотки крови при патологических состояниях. Сорбент, метод его получения и способ удаления туморнекротизирующего фактора из растворов и биологических жидкостей Государственным Комитетом по Изобретениям и Открытиям РФ признаны изобретениями и выданы соответствующие Патенты (Патент RU N 2123860 и патент RU N 2112553). Прикладное значение имеют и ряд других методических разработок, в том числе газохроматографический способ определения эстеразной активности протеиназ (Патент RU N2027764) и средство для стерилизации и отмывания от биологических жидкостей (Патент RU N2077890). Основные положения, выносимые на защиту.
-
а-2-макроглобулин человека является важнейшим фактором транспорта, элиминации и модификации биологической активности провоспалительных цитокинов.
-
Биологическое действие сложных надмолекулярных комплексов макроглобулин-протеиназа-цитокин определяется как специфичностью протеиназы, так и физико-химическими и биологическими свойствами самого пептида и его рецепторов.
-
В результате исследования белок-белковых взаимодействий МГ обнаружена способность ингибитора отменять токсин- и комплемент-зависимый гемолиз.
-
Препараты иммобилизованного на носителе модифицированного макроглобулина эффективно сорбируют туморнекротизирующий фактор а из растворов и биологических жидкостей, а также снижают активность и совокупную емкость комплемента крови человека.
-
Разработанные методики определения а-2-макроглобулина и его комплексов с протеиназами могут быть использованы для изучения функционального состояния ингибитора при различных патологических состояниях.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Третьем Международном конгрессе по иммунным механизмам травмы, шока и сепсиса в Мюнхене (1994), Международном конгрессе по шоку в Токио (1995), Второй и Третьей научных конференциях с международным участием "Дни иммунологии в С-Петербурге"(1998 и 1999), на 8-ом международном конгрессе Европейского общества аллергологов и иммунологов (Стокгольм, 1994), на IV симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 1997), на II съезде Всероссийского биохимического общества (Москва, 1997), на заседании С.-Петербургского отделения биохимического общества (1997), на заседаниях Научного Совета С.-Петербургского Государственного медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова (1998 и 1999). По теме диссертации опубликовано 30 работ в отечественных и зарубежных научных изданиях.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 6 глав собственных результатов исследований, главы «Обсуждение результатов» и выводов. В работе 27 таблиц и 21 рисунок; список литературы включает 285 источников, в том числе 40 - на русском языке.