Введение к работе
Актуальность проблемы. Одноклеточная эукариотическая зеле-іая водоросль Chlamydomonas reinhardtii является исключительно удобным модельным обьектом в изучении ряда биологических процессов, таких, как структура и функция жгутиков, взаимодействие слеток во время спаривания, клеточный цикл и, прежде всего, фотосинтез.
Применение техники рекомбинантных ДНК в значительной мере способствовало прогрессу в данной области исследований, в част-{ости в изучении структуры и функции фотосистем I и II. Однако, ірепятствием к дальнейшему развитию генетической инженерии Mamydomonas является проблема нестабильной экспрессии гетеро-тогичных генов в клетках этого организма.
К настоящему моменту имеется ряд фактов, свидетельствующих 5 пользу возможности экспрессии чужеродных генов в хлоропласте этой водоросли, но экспрессия гетерологичных генов, интегрированных в геном ядра, все еще остается достаточно сложной принци-іиальной проблемой, решение которой предстоит найти. Немногочис-тенные факты, касающиеся трансформации ядерного генома С. ^einhardtii гетерологичными генами, весьма противоречивы и вряд ш дают возможность сделать обоснованный вывод о причине их нестабильной экспрессии.
Настоящая работа посвящена изучению стабильности экспрессии гетерологичных генов в клетках С. reinhardtii. *
Цель и задачи исследования. Целью работы было исследование іричин нестабильной экспрессии гетерологичных генов в клетках "hlamydomonas reinhardtii. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1) создание эффективного метода трансформации "hlamydomonas и надежной системы селекции трансформированных слонов, содержащих последовательность гетерологичного гена; !) получение трансформантов, содержащих последовательности гете-юлогичных генов; 3) изучение экспрессии гетерологичных генов в слетках водоросли.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан іетод трансформации С. reinhardtii посредством электропорации. [ля трансформации водоросли сконструированы векторы, содержащие і качестве гетерологичных селективных маркеров бактериальные геїн, обусловливающие устойчивость к гигромицину (hpt) и канамици-iy (npt-II). Впервые показано, что для Chlamydomonas система се-
лекции, включающая ген hpt, имеет значительные преимущества по сравнению с селекцией на устойчивость к канамицину. Результаты анализа гигромицин-устойчивых трансформантов позволили сделать вывод о том, что, несмотря на стабильность последовательности hpt в процессе митоза, устойчивость к гигромицину фенотипнчески проявляется как крайне нестабильный признак. Далее, бь.ло обнаружено, что ДНК-повреждающие факторы способны увеличивать стабильность экспрессии гетерологичных генов в клетках Chlamydomonas, что подтвердилось в прямых экспериментах по определению активности неомицинфосфотрансферазы-П (продукт гетерологичного гена npt-II). Наконец, было выдвинуто предположение о том, что полученные результаты можно интерпретировать на основе известных фактов, касающихся убиквитин-зависимой системы протеолитической деградации белков. Результаты настоящей работы, несомненно, будут иметь значение в решении проблемы экспрессии гетерологичных генсв в клетках С. reinhardtii, что, в свою очередь, будет способствовать развитию как фундаментальных, так и прикладных исследований в данной области.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены й обсуждены на международной конференции "Soviet-Indian symposium on regulation of photosynthesis" (Pushchino, 1990) на семинарах отдела фотобиотехнологии ИПФС РАН и на заседаниях Ученого совета ИПФС РАН.
Публикации. Результаты исследований опубликованы в 3 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 11 рисунков и 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 92 наименования.