Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.Обзор литературы 11
1.1. Гормоны репродуктивной системы в возрастном аспекте 11
1.1.1. Метаболизм женских половых гормонов 11
1.1.2. Биологические эффекты женских половых гормонов 14
1.1.3. Регуляция синтеза и секреции женских половых гормонов 18
1.1.4. Механизм действия женских половых гормонов 20
1.1.5. Влияние метаболизма ткани влагалища на состав микрофлоры 24
1.2. Патогенетические механизмы нарушений в пострепродуктивном периоде 27
1.2.1. Особенности патогенеза атрофического кольпита 27
1.2.2. Влияние метаболизма ткани влагалища на состав микрофлоры у женщин больных атрофическим кольпитом 31
ГЛАВА 2.Материалы и методы 34
2.1. Клинический материал 34
2.2. Морфометрические исследования ткани влагалища 38
2.3. Биохимические методы исследования 41
2.3.1.Определение содержания прекалликреина и активности калликреина 41
2.3.2. Определение общей аргинин-эстеразной активности 43
2.3.3.Определение активности ингибиторов протеаз: 1 протеиназного ингибитора и 2-макроглобулина 44
2.3.4.Экспресс-метод определения активность ангиотензинпревращающего фермента 46
2.3.5. Метод определения эластазоподобной активности 47
2.3.6. Метод определения активности лейкоцитарной эластазы 48
2.3.7. Газожидкостная хроматография этиловых эфиров жирных
кислот 49
2.3.8. Определение продукции NOлейкоцитами крови 50
2.3.9. Выделение митохондрий
2.3.10. Исследование метаболитов ткани влагалища, эритроцитов и лейкоцитов 52
2.3.11. Получение суспензии эритроцитов 53
2.3.12. Методы определения метаболитов 54
2.3.13. Определение содержание 2,3-бифосфоглицерата 54
2.3.14. Определение содержания пировиноградной кислоты 56
2.3.15. Определение содержания молочной кислоты 57
2.3.16. Определение активности фосфорилазы 58
2.3.17. Определение активности фосфогексоизомеразы з
2.3.18. Определение активности гексокиназы 60
2.3.19. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 61
2.3.20. Определение активности аденозинтрифосфатного
ферментного комплекса (Mg2+ и Ca2+-зависимой Na, K-АТФ азы) 61
2.3.21. Определение активности цитохромоксидазы 62
2.3.22. Определение активности сукцинатдегидрогеназы
2.4. Метод определения фракций воды 62
2.5. Определение белка 67
2.6. Микробиологическое исследование 67
2.7. Статистические методы исследования 68
Глава 3. Особенности углеводно-энергетического обмена в ткани влагалищаи крови женщин, больных атрофическим кольпитом, и женщин с атрофическим кольпитом на фоне лейомиомы матки 70
Глава 4. Особенности жирнокислотного состава ткани влагалища и микрофлоры при атрофическом кольпите 92
Глава 5. Состояние калликренкининовой системы крови у женщин с атрофией влагалища и атрофией влагалища при лейомиоме матки, неосложненной кровотечением 121
Глава 6. Сотношение различных фракций воды в ткани влагалища и эритроцитах крови у женщин с атрофией влагалища и атрофией влагалища при лейомиоме матки, неосложненной кровотечением 136
Глава 7. Активность ферментов mg2+ и ca2+-зависимых атф-аз в ткани влагалища крови у женщин с атрофическим кольпитом 146
Глава 8. Активность индуцибельной no - синтазы в лейкоцитах крови у женщин с атрофией влагалища и атрофией влагалища на фоне лейомиомы матки, неосложненной кровотечением 151
Обсуждение полученных результатов 158
Выводы 182
Список используемой литературы 184
- Регуляция синтеза и секреции женских половых гормонов
- Биохимические методы исследования
- Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
- Сотношение различных фракций воды в ткани влагалища и эритроцитах крови у женщин с атрофией влагалища и атрофией влагалища при лейомиоме матки, неосложненной кровотечением
Регуляция синтеза и секреции женских половых гормонов
Считается, что специфические стероидосвязывающие гликопротеиды крови выполняют роль своеобразного «депо» стероидных гормонов, защищая иx от чрезмерного поглощения тканями и быстрого вывода из организма, а также от химических и ферментативных воздействий в кровеносной системе. При этом убыль «свободного гормона» за счет его поглощения тканями легко компенсируется диссоциацией гормон-белковых комплексов, которая быстро протекает при физиологической температуре. С точки зрения рациональности организации процессов, протекающих в организме человека, наиболее сильным логическим доводом в пользу активного участия гормонсвязывающих гликопротеинов крови в гормональном действии стероидов является тот факт, что в комплексе с данными гликопротеинами находится намного больше стероидов, чем в «свободном» виде, а изменение концентраций «свободных» и связанных стероидов в крови нередко носят не противоположный, а однонаправленный характер. Однако, экспериментальные данные показывают, что именно на уровне плазматической мембраны, отделяющей внутреннюю среду от внешней, должен осуществляться отбор регуляторных молекул из крови. Следовательно, первым и важнейшим этапом механизма передачи гормонального сигнала в клетку при участии связывающего гликопротеина крови должна быть рецепция гормонгликопротеинового комплекса специализированными участками клеточной мембраны. Механизм захвата стероидных гормонов клетками-мишенями реализуется при участии транскортина, посредством двойной регуляции: со стороны крови по изменению гормонсвязывающего гликопротеина и со стороны ткани по изменению количества мембранных рецепторов. Было установлено [254], что мембраны эндометрия проявляют примерно одинаковое сродство к комплексам транскортин - с эстрадиолом, эстриолом, эстроном. Аввакумов Г.В., [4]; Szego C.M. et al., [404] доказали, что стероидсвязывающий компонент и рецептор эстрогенов функционируют в мембране как единая система узнавания комплексов транскортин-эстроген, и что на плазматической мембране клеток эндометрия может происходить сборка комплекса транскортин-эстрадиолов из индивидуальных компонентов. Это возможно только в том случае, когда мембранные компоненты, связывающие транскортин и связывающие эстрадиол, образуют единую систему узнавания.
Зависимость мембранного связывания транскортина от природы находящегося с ним в комплексе стероида дает основания считать, что происходящие при образовании стероид-гликопротеинового комплекса конформационные изменения полипептидной цепи транскортина [79, 419, 420] играют важную роль в формировании детерминант узнавания этого комплекса мембранами. Вместе с тем в образовании этих детерминант принимает непосредственное участие углеводный компонент транскортина [216]. Методом аффинной хроматографии на иммобилизированном транскортине солюбилизата мембран, меченных изотопом 125I, были определены и частично охарактеризованы транскортинсвязывающие компоненты данных мембран [254. 255]. Установлено, что целостность олигосахаридных цепей и определенные особенности строения транскортина необходимы для специфического связывания комплекса гормон гликопротеин мембранной клетки-мишени [216]. Необходимо также учитывать связывающую способность транскортина [59].
По-прежнему широко распространена точка зрения, согласно которой гормональную активность способны проявлять только «свободные», не связанные с белком стероиды. Сродство каждого гормона к своему белку-переносчику столь велико, что в несвязанном виде обнаруживаются лишь малые количества гормона. Однако, биологической активностью обладает именно свободный стероид [206, 419, 420]. В отношении способа проникновения в клетку имеется некоторая неопределенность. Считается, что они просто проникают сквозь липидный бислой плазматической мембраны [132]. Однако, в настоящее время появились указания на возможность присутствия на плазматической мембране специфических рецепторов для эстрогенов. Отношения между этими мембранными белками и внутриклеточными рецепторами неясны [222].
Последовательность действия стероидных гормонов можно суммировать следующим образом: - проникновение стероида в клетку - образование комплекса гормон-рецептор Рецепторы - глобулярные белки одинакового размера с высоким сродством к гормону. Все незанятые рецепторы связаны с ядром еще до того, как стероид проник вглубь клетки. Рецепторы эстрогенов обратимо фосфорилируются киназой и дефосфорилируются фосфатазой. Только фосфорилированный рецептор может связывать гормон.
Происходит трансформация комплекса гормон-рецептора в форму, способную связываться с ядерными акцепторами.
Гормон-рецептор (активированный) связывается со специфическими (строго к определенному гормону) кислым белком и с хроматином, разрыхляя и вызывая его деспирализацию. В результате введения стероида в клетку увеличивает м-РНК. Затем происходит избирательная инициация транскрипции специфических матричных рибонуклеиновых кислот (м-РНК); координированный синтез транспортных рибонуклеиновых кислот (т-РНК) и рибосомальных рибонуклеиновых кислот (р-РНК).
Следующим этапом начинается процессинг первичных РНК транскриптов: метилирование, полиаденилирование, вырезание интронов, сплайсинг экзонов, метаболизм вырезанных интронов. Далее следует транспорт зрелых м-РНК в цитоплазму.
Биохимические методы исследования
Определение активности ингибиторов в биологическом материале проводили унифицированным энзиматическим методом Нартиковой В.Ф. и Пасхиной Т.С. (1979) [146]. Определение активности ингбиторов основано на различном механизме взаимодействия с трипсином и комплексов «трипсин-ингибиторов» с субстратом (БАЭЭ). Активность ц-протеиназного ингбитора определяли по торможению аргинин - эстеразной активности трипсина, разведенной в 50 раз сывороткой крови человека; активность 2-макроглобулина измеряли по сохраняющейся аргинин - эстеразной активности комплекса трипсин - 2 - макроглобулин, образующегося после взаимодействия избытка трипсина с сывороткой крови, разведённой в 10 раз, и последующей инактивацией свободного, не связанного с 2-макроглобулином трипсина соевым ингибитором трипсина. Затем добавляли 1 мл раствора БАЭЭ и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 253 нм, второе измерение проводили через 30 минут.
Определение активности ц-протеиназного ингибитора. К 0,1 мл разведённой в 50 раз 0,85% раствором NaCl сыворотки крови добавляли 1,8 мл 0,05 М трис - НС1 буфера, 8,0 и 0,1 мл 0,01% раствора трипсина (Sigma+Aldrich, USA). Пробу выдерживали 5 минут при 25 С и добавляли 1 мл 1,5 10"3 М раствора БАЭЭ. После быстрого перемешивания сразу измеряли прирост оптической плотности при длине волны 253 нм, против пробы, содержащей только реактивы (2 мл трис-HCl буфера, рН 8,0 и 1 мл раствора БАЭЭ). Отсчеты производили через каждую минуту в течение 4-5 минут. Контрольная проба для определения активности трипсина содержала 1,9 мл трис-HCl буфера, pH 8,0 и 0,1 мл 0,01% раствора трипсина, ход определения тот же.
Из линейного участка графика хода реакции находили прирост оптической плотности при 253 нм за 1 минуту для опытной и контрольной проб, разность между этими величинами использовали для вычисления активности 1-протеиназного ингибитора по формуле: (V0 – Vi) 2.73 50 = числу ингибиторных единиц на мл сыворотки крови, 0,1 Где V0 и Vi– скорости гидролиза БАЭЭ трипсином в контрольной и опытной пробах, соответственно равные приросту оптической плотности за 1 минуту. 2,73 – расчетный коэффициент, вычислено по разности оптической плотности 1 мМ раствора N--бензоил-L-аргинина и БАЭЭ при 253 нм, 0,1 – количество сыворотки (в мл), 50 – фактор разведения сыворотки. Определение активности 2-макроглобулина. Перед исследованием сыворотку крови разводили в 10 раз физиологическим раствором. 0,1 мл разведенной в 10 раз сыворотки крови вносили 1,75 мл 0,05 М трис – HCl буфера, pH 8,0 и 0,05 мл 0,1% раствора трипсина. Пробу преинкубировали в течение 5 минут при 25С, добавляли 0,1мл 0,3% раствора соевого ингибитора трипсина (Reanal, Hungary), перемешивали и через 5 минут вносили 1 мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ. После перемешивания сразу измеряли прирост оптической плотности при 253 нм в течение 10 минут против контрольной пробы, содержащей только реактивы (2 мл три – HCl буфера и 1 мл раствора БАЭЭ).
Активность 2-макроглобулина выражали в ИЕ в 1 мл сыворотки и вычисляли по формуле: D10253 2.73 10 = D10253 27.3 = ИЕ/мл, где 0,1 10 D10253 – прирост за 10 минут оптической плотности при линейном ходе реакции. 2,73 – расчетный коэффициент, 10 – время измерения реакции (мин), 10 – фактор разведения, 0,1 – количество сыворотки крови, взятой для анализа (мл). Активность 1- протеиназного ингибитора и 2-макроглобулина выражали в условных ингибиторных единицах (ИЕ) в мл сыворотки крови. За 1 ИЕ принято такое количество сыворотки, которое тормозит гидролиз трипсином 1 мкмоль БАЭЭ за 1 минуту при 25С.
Активность ангиотензинпревращающего фермента (КФ 3.4.15.1) определяли спектрофотометрическим методом с использованием синтетического субстрата АПФ – фурилакрилоилфенилалнил-глицилглицина (ФАПГГ) [58].
Исследуемую сыворотку разливали в две пробирки по 0,02 мл, затем в одну пробирку добавляли 0,1 мл 1 мМ раствора ФАПГГ (Sigma-Aldrich, USA) - субстрата (опыт), в другую – 0,1 мл 20 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Merk, Germany) (контроль). Пробы инкубировали в термостате при 37С 30 минут. Затем пробирки помещали в ледяную баню и в одну из них добавляли 0,1 мл раствора ЭДТА (опыт), а в другую – 0,1 мл субстрата ФАПГГ (контроль), тщательно смешивали. Через 5 минут в обе пробирки вносили по 2,5 мл буферного раствора, содержащего 50 мМ трис-(оксиметил)-аминометана и 300 мМ хлорида натрия, pH 8,3 и измеряли на спектрофотометре оптическую плотность проб при длине волны 334 нм против дистиллированной воды. При этом экстинкция раствора контрольной пробы отражала исходный уровень адсорбции ФАПГГ, а экстинкция раствора опытной пробы свидетельствовала об уровне снижения адсорбции ФАПГГ в результате гидролиза субстрата ферментом до фурилакрилоилфенилаланина и глицилглицина. Различие экстинкций контрольной и опытной проб указывает на активность АПФ.
Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Установленное нами значительное падение активности фермента ЦТК – СДГ, катализирующего превращение сукцината в фумарат, также позволяет предполагать значительное снижение эффективности ЦТК. Такое резкое замедление СДГ участка приводит к снижению концентрации восстановленных коферментов, которые являются донорами протонов для дыхательной цепи.
Достоверное снижение активности фермента конечного сопряженного участка дыхательной цепи – ЦХО, свидетельствует о падении скорости окислительного фосфорилирования и, как следствие, снижение концентрации АТФ, используемой на полифункциональные потребности влагалищной ткани. Очевидно, такие метаболические изменения, сопровождающиеся увеличением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, снижением активности СДГ и ЦХО, накоплением ПВК являются следствием как тканевой гипоксии, которая является одной из причин, приводящих к атрофии влагалищной ткани. Видимо, в условиях гипоксии под влиянием изменения нейрогуморального сигнала начинает меняться приоритет метаболических путей углеводного обмена за счет перераспределения общих промежуточных метаболитов [117]. Скорее всего, большая часть глюкозо-6-фосфата используется по ПФ-пути – альтернативному пути окисления глюкозы в сложившейся метаболической ситуации.
На основании анализа фактического материала возможно предположить, что в результате активации ФГИ образуется промежуточный продукт гликолиза – 3-фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА), который включается в неокислительную ветвь ПФ-пути, усиливая компенсаторные значение ПФ цикла в условиях атрофии. Итак, одной из особенностей атрофического процесса влагалищной ткани может являться изменение скорости различных метаболических путей углеводного обмена, снижение эффективности дыхательной цепи на СДГ участке, накопление недоокисленных субстратов НАДН и НАДФН2, приводящих к нарушению интеграции процессов углеводно-энергетического обмена.
Известно, что в базальном слое многослойного плоского эпителия, новые клетки под действием эстрогенов накапливают гликоген, постепенно созревают и под действием прогестерона подвергаются десквамации. Таким образом, накопленный гликоген попадает во влагалищную среду и служит питательной средой для лактобактерий [70]. Лактобактерии, расщепляя гликоген до молочной кислоты, продуцируют её в количестве, достаточном для создания выраженной кислой среды влагалищного отделяемого (рН = 3,8-4,5) и, тем самым, препятствуют размножению ацидофобных бактерий (12, 23-25).
Снижение скорости углеводно-энергетического обмена приводит к изменению синтеза гликогена. Последствием этого метаболического события является нарушение взаимодействия с микрофлорой, ответственной за выработку конечного продукта расщепления гликогена – молочную кислоту.
Атрофический процесс неизбежно сопровождается изменением со стороны метаболического обеспечения макроорганизма. Наряду с этим, формированию атрофии сопутствует развитие гипоксии.
Гипоксия –патологический процесс, который вызывает недостаточное поступление кислорода в ткани и клетки организма или нарушение его использования при биологическом окислении. Гипоксия всегда приводит к недостатку свободной энергии, гипоэргозу [402]. Основной причиной, определяющей все последующие изменения гомеостаза, является нарушение кислородного статуса организма, которое непосредственно влияет на клеточный метаболизм [394, 68].
Учитывая, что кровь является надежным клиническим показателем состояния организма [63, 138, 56, 77, 170], нам представилось целесообразным изучить особенности функционирования системы крови в условиях развития атрофического кольпита. Известно, что сдвиги в составе крови и нарушение метаболических процессов в эритроцитах отражают особенности индивидуальной реактивности [33, 139, 154, 155, 187, 296], а изменения содержания субстратов и ключевых ферментов углеводно-энергетического обмена в клетках крови является чувствительным индикатором повреждения и развития тканевой гипоксии [182, 169].
Метаболизм в эритроцитах, в сущности, ограничен анаэробным гликолизом и гексозомонофосфатным шунтом, а главным источником энергии является глюкоза. В процессе гликолиза молекула глюкозы расщепляется на две молекулы молочной кислоты. Энергетический выход процесса составляется две молекулы АТФ. Образующаяся при гликолизе АТФ является прежде всего субстратом Na+/K+-АТФ-азы, которая поддерживает мембранный потенциал эритроцитов. Кроме того, АТФ поддерживает сам процесс гликолиза, поскольку гексокиназная и фосфофруктокиназная реакции энергозависимы. Последней реакцией анаэробного гликолиза является восстановление пирувата в лактат, катализируемое лактатдегидрогеназой. Молочная кислота метаболизируется, в основном, в почках, сердце, печени, и лишь единично экскретируется с мочой. Лактат – своеобразный тупик в метаболизме [198], поскольку единственно возможным путем его утилизации является превращение молочной кислоты в пируват. Данный процесс возможен путем обращения лактатдегидрогеназой реакции при наличии аэробных условий. Большая часть пирувата окисляется до CO2 и ацетил-СоА. Окисление последнего в цикле трикарбоновых кислот обеспечивает образование 36 (или 38) молекул АТФ. На фоне дефицита кислорода углеводный метаболизм в клетке резко нарушается, что сопровождается накоплением молочной кислоты и резким снижением энергетических возможностей клетки [68].
Сотношение различных фракций воды в ткани влагалища и эритроцитах крови у женщин с атрофией влагалища и атрофией влагалища при лейомиоме матки, неосложненной кровотечением
Полученные нами результаты показали, что в обеих клинических группах (табл. 8) уровень 2,3 – БФГ повышается. Однако, улучшение доставки кислорода к тканям не отражает в полной мере степень утилизации молекулярного кислорода в процессах тканевого дыхания. Косвенным показателем, отражающим утилизацию молекулярного кислорода, является показатель степени окисления субстратов или продуктов общего пути катаболизма, в частности ПВК и молочной кислоты. Увеличение концентрации 2,3-БФГ-молекулярного регулятора сродства гемоглобина к кислороду в эритроцитах пациентов первой клинической группы свидетельствует о формировании тканевой гипоксии. При этом способность эритроцитов к отдаче кислорода у пациента второй клинической группы была выражена в меньшей степени по сравнению с первой клинической группой. Более высокий рост 2,3-БФГ у пациентов первой клинической группы свидетельствовал, по нашему мнению, о более выраженных адаптивных возможностях у этой группы пациентов. Полученные нами данные свидетельствовали о сдвигах метаболического обеспечения кислородтранспортной функций эритроцитов крови. Рост концентрации 2.3-БФГ в эритроцитах обеих групп свидетельствует о конформационных изменениях структуры гемоглобина (переход из R- в T-конформацию) и приводит к снижению сродства гемоглобина к кислороду. Подобные явления принято рассматривать как адаптационный механизм, направленный на улучшение снабжения тканей кислородом. Характер изменения уровня 2,3-БФГ является выражением «надежности» адаптационных механизмов, связанным с повышением эффективности функций системы транспорта и утилизации кислорода, а также гарантом сохранения структурно-функциональной целостности эритроцитов.
Выявленные особенности регуляции газотранспортных процессов в эритроцитах при умеренной форме атрофического кольпита на фоне гипо- и гиперэстрогении диктует необходимость анализа более глубоких механизмов реакции системы крови, формирующихся в ответ на атрофические изменения во влагалищной ткани.
Анализ эритроцита, как функционального компонента системы кровообращения при умеренной атрофии ткани влагалища на фоне гипо- и гиперэстрогении, позволяет сделать заключение о разной чувствительности звеньев этой системы к формирующейся гипоксии. Выявлены как общие закономерности включения адаптативного молекулярного механизма, таки специфические, отражающие индивидуальную устойчивость к гипоксии. Регистрация уровня ПВК, лактата и 2,3 – БФГ позволяет определить эти индивидуальные особенности.
Следует отметить, что увеличение уровня ПВК в эритроцитах обеих клинических группах положительно влияет на газотранспортную функцию эритроцитов, обеспечивая рост количества 2,3-БФГ и улучшая процессы микроциркуляции. На этом фоне параллельное увеличение уровня лактата происходит в первой и второй клинических группах. Это, очевидно, обусловлено напряженностью гликолиза и могло отражать усиление метаболического обеспечения функциональной активности эритроцитов. Однако, следует отметить, что во втрой клинической группе уровень лактата и ПВК значительно выше, чем в первой - соответственно. Надо полагать, что в этой группе наблюдался более высокий приспособительный потенциал механизмов, направленных на снижение гипоксии в ткани влагалища с одной стороны, а с другой стороны направленных на рост лейомимы матки у пациенток второй клинической группы. Полученные факты позволяют полагать, что в исследуемых группах в разной степени реализуются молекулярные механизмы компенсации гипоксии. Таким образом, у больных с умеренной атрофией ткани влагалища и умеренной атрофией ткани влагалища на фоне лейомиомы матки выявлены значительные нарушения окислительно-восстановительных процессов, отражающие как общие гипоксические изменения, так и индивидуальные особенности реакции организма на гипоксию.
Для исследования соотношения исследуемых показателей в изучаемых группах был применен один из статистических методов - дискриминантный анализ. Этот метод используется для принятия решения о том, какие переменные различают (дискриминируют) две или более возникающие совокупности (группы). Второй важной возможностью дискриминантного анализа - это построение "модели", позволяющей лучше всего предсказать, к какой совокупности (группе) будет принадлежать тот или иной новый член выборки.
Для анализа были выбраны показатели углеводного обмена в эритроцитах женщин, больных атрофическим кольпитом, группы сравнения и больных атрофическим кольпитом на фоне лейомы матки: 2,3-БФГ, лактат, ПВК а также активность NO-синтазы в лейкоцитах. Графически результаты моделирования представлены на рис. 8. На рисунке видно очень четкое расслоение пациентов изучаемых групп на основе измеряемых показателей. Вклад отдельных показателей в дискриминацию групп можно видеть из табл. 9. Первая колонка признаков (Кор.1) в нашем случае отвечает за распределение по горизонтали, вторая колонка (Кор. 2) - за распределение по вертикали. Наиболее значимый вклад вносят значения показателей 2-3 БФГ и лактата.