Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Биохимия глутатионпероксидазы 9
1.1.1. Строение и функции фермента 9
1.1.2. Механизм реакции 13
1.1.3. Кинетика глутатионпероксидазы . 15
1.1.4. Субстратная специфичность глутатионпероксидазы 17
1.1.5. Ингибиторы глутатионпероксидазы 21
1.1.6. Функция глутатионпероксидазы в эритроцитах . 23
1.2. Наследственные энзимопатии эритроцитов человека и их молекулярные механизмы 26
1.2.1. Наследственная недостаточность эритроцитов человека 29
1.2.2. Биохимический полиморфизм 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 35
2.1. Материалы 35
2.2. Методы 36
2.2.1. Скрининг-тест для выявления недостаточности ГП 36
2.2.2. Количественное определение и других ферментов в гемолизате 38
2.2.3. Очистка глутатионпероксидазы из эритроцитов 40
2.2.4. Исследование кинетики и физико-химических свойств глутатионпероксидазы 44
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 46
3.1. Исследование активности глутатионпероксидазы в эритроцитах здоровых людей 46
3.2. Модификация скрининг-метода 50
3.3. Выявление носителей недостаточности 52
3.3.1. Исследование образцов крови в Масаллинском районе « 52
3.3.2. Исследование образцов крови в Таузском районе 56
3.3.3. Исследование образцов крови в г. Баку 58
3.4. Исследование нормальных молекулярных вариантов глутатионпероксидазы эритроцитов человека 71
3.4.1. Выделение из эритроцитов донорской крови .71
3.4.2. Изучение кинетических и физико-химических свойств 76
3.5. Идентификация мутантних аллелей 86
Заключение
Список литературы 123
- Субстратная специфичность глутатионпероксидазы
- Наследственные энзимопатии эритроцитов человека и их молекулярные механизмы
- Очистка глутатионпероксидазы из эритроцитов
- Исследование активности глутатионпероксидазы в эритроцитах здоровых людей
Субстратная специфичность глутатионпероксидазы
Глутатионпероксидаза в противоположность другим пероксида-зам высоко специфична в отношении донор-субстрата. Изучая Ш эритроцитов крупного рогатого скота, t/U№ &. /112/ выяснил, что глутатион - единственный субстрат Ш и что обычные субстраты пероксидаз 0 - толуидин, гваякол, пирогаллол /140/ и другие под действием ІЇІ вообще не разлагаются» Исследуя 30 различных тиоло-вых соединений в качестве субстратов глутатионпероксидазы,#& X. /65/ показал наибольшую ферментативную активность при глута-тион-субстрате; показана важная роль }f -глутаминрвого остатка глутатиона, блокирование которого приводило к резкому сниженрю ферментативной активности. Дальнейшие исследования /129,142,104, 103,80/ подтвердили результаты Мс-Ш (г, и j-CoJii , показав, что ГП обладает кинетикой первого порядка по отношению к глутатиону и получили насыщенность фермента глутатионом с величиной К равной 10 мМ /129,80/.
Учитывая, что в тканях печени, селезёнки и эритроцитах кроме глутатиона содержится значительное количество вышеназванных соединений, witou S. и (Убогшси Л. /124/ вновь сделали попытку определить субстратную специфичность тиоловых соединений. Авторы установили активность фермента и величину К по отношению к цисте-ину, щстамину, дитиотреитолу и глутатиону. Наиболее высокая активность Ш была отмечена в эритроцитах при глутатион-субстрате (конц. Г-2Н - 4 мМ); ткань печени показала самую низкую активность. Данные константы Михаэлиса ГП (в мМ) при различных соединениях приводятся в табл.1.I.
Наименьшая К обнаружена при дитиотреитол-субстрате. Учитывая физиологическую концентрацию цистеина и глутатиона, авторы полагают, что в качестве субстрата глутатион является наиболее предпочтительным. При изучении /124/ активности Ш в зависимости от содержания свободных и общих тканевых S Н-групп и восстановленного глутатиона, показана приблизительная корреляция между содержанием SH-групп и ферментативной активностью в печени, селезёнке и других тканях; снижение активности фермента в различных органах обнаруживается в следующем порядке : кровь печень селезёнка лёгкие жишечник, в то время, как содержание общего количества H-rpynn уменьшается в тканях в порядке: печень семенник почка сердце селезёнка, а Г-S Н - печень головно й мозг семе-нник сердце почка. Эта закономерность указывает на связь между активностью ІЇЇ и концентрацией Г-5Н. Очевидно, в крови и печени имеются оптимальные условия для Ш, в связи с высоким содержанием Г-SH, что не наблюдается в головном мозге, сердце и селезёнке.
Таким образом, многие тиоловые соединения могут служить субстратами для фермента Ш, среди которых глутатион восстановленный имеет явное превосходство. Предполагают /124/, что 5Н- группы этих соединений являются мишенями для постоянно образующихся в клетке перекисей /102,52/. Глутатион восстановленный стимулирует активность глутатионпероксидащы, ингибируя каталазу, а глутатион окисленный препятствует активации Ш, т.е. глутатион модулирует активность обоих ферментов, участвующих в разложении эндогенной перекиси /102/.
Приведенные выше данные несколько противоречат результатам 5№ Ае2,ж его сотрудников /142,62,79,59/. По мнению последних, аминные группы аминотиолов, находящиеся в непосредственном соседстве с S Н-группами замещаются крайне трудно; видимо высокий положительный заряд в активном центре препятствует сближению аммонийных групп, а также карбоксильная группа глутаминового остатка участвует в ориентации молекулы субстрата. Скорость реакции с другими субстратами может определяться также степенью диссоциации их меркаптидных групп.
Высокую специфичность Ш в отношении донор-субстрата наблюдали также точііоп X и СҐ хрре 6 Z . /70/. Они обнаружили, что в присутствии неглутатионовых тиолов (цистеин, меркаптоэтанол) снижается не только начальная скорость реакции, катализируемой Ш, но и общее количество образующегося глутатиона. Ингибирова -ние меркаптоэтанолом конкурентно относительно глутатиона. В присутствии глутатиона селен в составе активного центра окисляется до селениновой кислоты, для восстановления которой необходимо четыре восстановленные молекулы глутатиона на один атом Se. Этим объясняется эффект активации восстановленным глутатионом.
Специфичность акцепторного субстрата По литературным данным /103,79,52,51/ ГЇЇ низко специфична в отношении акцепторного субстрата. ZitC&. С. и 0]fittest ". /103/ на примере перекисей ненасыщенных жирных кислот (гидроперекиси линолевой кислоты, кумол/гидроперекиси, t -бутилгидропе-рекисей) наблюдали, что под действием ІЇЇ, выделенной из печени крысы, разложение перечисленных гидроперекисей идёт даже быстрее, чем разложение Ik . Эти данные подтвердили также tto&nee ід м/. У. /82/ и (уипх&л. W/79/ , использовавшие в качестве акцепторных субстратов кумол и t -бутилгидроперекись; причём скорость фермента не зависела от типа гидроперекиси, а была пропорциональна концентрации восстановленного глутатиона. Акцепторными донорами Ш могут служить также гидроперекиси различных стероидов /101/. При инкубации ГП из эритроцитов свиньи с различными стероидами в присутствии восстановленного глутатиона и рН 8 наибольшая скорость реакции наблюдалась о T?cL -гидроперекисью , в отношении которой Б составила 4x10 М (концентрация Г-5 Н 0,25 мМ); lid-гидроперекись аллопрегнанолона и 17 -гидроперекись прегнанолона обладали большим сродством к ферменту. Из производных холестерина только 10 -гидроперекись холестерина показала измеримую активность; 5 d -гидроперекись 6-кето-холестерола и 26 -гидроперекись холестерола не являются субстратами ГЯ. Таким образом, по литературным данным ГП имеет низкую специфичность в отношении акцепторного субстрата и наиболее предпочтительными субстратами являются гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот.
Наследственные энзимопатии эритроцитов человека и их молекулярные механизмы
Идентификацию аномальных форм Ш эритроцитов проводили по изучению физико-химических свойств очищенных препаратов фермента, У восьми человек с дефицитом активности ГП в эритроцитах из 20 мл венозной крови выделяли и очищали фермент; определяли электро-форетическую подвижность, К для двух субстратов» термостабиль-ность и рН-оптимум. При идентификации мутантных аллелей учитывались результаты анажза клинического проявления.дефицита фермента, гематологических данных и родословных»
Первый аномальный молекулярный вариант (пробанд I), У мальчика-азербайджанца 1978 г.рождения скрининг-тестом выявлен частичный дефицит активности ГП в эритроцитах; дефлюо-ресценция пятен крови на бумаге наступала на 12-15 мин, что соответствовало 40% активности фермента от нормы. Результат скрининга подтверждён количественным определением активности фермента, которая составила 7,85 ед/г Нв при норме 18,87 ед/г Нв. В результате семейного анализа установлена кровно-родственная связь между родителями пробанда (двоюродные брат и сестра). Б эритроцитах отца и сестры обследованного активность фермента снижена и составила 8,35 и 11,25 ед/г Нв, соответственно. Уровень активности фермента у матери, брата и второй сестры в пределах нормы (рис.3.13.). Пробанд из городской клиники был направлен в гематологическое отделение НИИ ОЩ с диагнозом гемолитическая анемия. Гемолиз возникал на фоне респираторного заболевания. На первом году жизни ребёнка наблюдалось уменьшение веса с развитием гипотрофии І-П степени. Наличие гемоглобинопатии исключено, количественное содержание Нв 2 и J также в норме. Количество общего гемоглобина 7,0 г%,гематокрит32%, сывороточный билирубин 2,2 мг%, рети.кулоциты 1,6$, мишеневидность повышена, эритроциты 3x10 (в I мкл) Измерение активности глююзо-6-фосфатдегидрогеназы, пиру-ваткиназы» гексофосфоизомеразы и глутатионрюдуктазы не показало каких-либо количественных изменений. Кинетические свойства мутантной Ш представлены в табл. 3 27, Специфическая активность фермента в гемолизате пробанда 7,8 ед/г Нв (40% от нормы). Электрофорезом в ПМГе обнаружен один изофермент, отличный как от А, так и от В форм ГП в нормальных образцах; мутантная форма фермента обладает высокой электрофоретической подвижно.- -стыо - примерно 280% от нормы (рис.3«14.). Величина константы Михаэлиса в отношении глутатиона для мутантного фермента составила 15,5 мМ (табл»3.27.) при Б - 4 мМ для Ш нормальных образцов» Линейная зависмость скорости Ш-реакциии от концентрации донор-субстрата изображена графически по Лайнуиверу и Бэрку (рис.3.29.) Значение Код для аномальной формы ГП в отношении "«-бутил-гидроперекиси незначительно превышает значение К для Ш нормальных образцов и равно 80 М (табл.3.27., рис.3.30.). Измерение активности мутантного фермента в различных температурных условиях показано в табл.3»27. и на рис.3.31 : актин- ность ГП падает в течение 15 мин до 50, 40, и 15,5% от активности в 0-время при 40, 45 и 50С, соответственно; при температуре 55С за 15 мин фермент инактишруется полностью, в то время, как в нормальных образцах инактивация фермента наступает при 60С,а 50% снижение активности нормальной ГП показано при 45С. Максимальная активность мутантной ГП наблюдалась в рН-сре-де от 8,5 до 9,0; рН-оптимум фермента в нормальных образцах 9,0 (табл.3.27.). Т.о., очищенный препарат ГП, выделенный из эритроцитов прбанда I, отличается от нормальных молекулярных вариантов низкой специфической активностью (40% от нормы), электрофоретически более подвижен (280% от нормы), имеет низкое сродство к субстратам, менее термоустойчив и имеет широкий предел рН оптимума (8,5 -9,0) (табл.3,27.). Второй аномальный молекулярный вариант Ш (пробанд 2)» Пробанд 2 - девочка 1977 г. рождения, азербайджанка по национальности. Скрининг-тестом выявлена недостаточность ГП в эритроцитах - дефлюоресценция пятен крови на бумаге наступала на 9-й минуте (60% снижение активности фермента от нормы), что подтверждено количественным спектрофотометрическим определением (10,16 ед/г Нв). Изучение родословной показало сниженную активность фермента у матери (9,3 ед/г Нв) при нормальном уровне ГП у отца. Пробанд - ребёнок от неродственного брака. Первый ребёнок в обследованной семье мертворожденный. Больная находилась под наблюдением врачей поликлиники с диагнозом анемия неясной этиологии, физически слабо развита с часто повторяющейся пневмонией. Некоторые показатели крови: количество гемоглобина 7,0 г%, гематокрит 30%, Билирубин 2,0 мг%, ретикулоциты 1,7%, мишеневидность наблюдается, эритроциты 3,2x10 (в I мкл). Наличие гемоглобинопатии полностью исключено. Активность ферментов Г6ФД, ПК, ГФИ, ГР в пределах нормы. Кинетические свойства аномальной ГП электрофоретическая подвижность для глутатиона и Ґ-бутилгидроперекиси, термостабильность и рН-оптимум аномальной ГП - представлены в табл.3.27. Специфическая активность мутантного фермента равна 10,16 ед/г Нв (50% от нормы).
Очистка глутатионпероксидазы из эритроцитов
Код для глутатиона равна 3,3 мМ и для t-бутилгидроперекиси - 105 /»Щ(рис«3 29 и 3.30), при значении К для Ш нормальных образцов 4 мМ (Г-SH) и 71ЛМ ЇГВЕ), т.е. мутантная форма фермента показала более низкое сродство с акцепторным субстратом, чем Ш, обладающая нормальной активностью.
Термостабильность аномального энзима установлена путём определения изменения активности Ш при температурах от 40 до 60С с интервалом в 5С в течение 15 мин (табл.3.27). При 40,45 и 50С ферментативная активность падала на 48; 30,2 и 10,5$, соответственно, от активности в 0-время, тогда как нормальные образцы Ш показали снижение активности на 75,3; 56,5; 45$ (в тех же температурных условиях в течение 15 мин); при температуре 55С аномальная форма Ш полностью инактивируется, нормальная форма ГП при той же температуре показала почти 20$ активность от активности в 0-время и инактивировалась только при 60С ( через 15 мин).
Графическое изображение влияния температуры на скорость реакции нормальной и мутантной форм ГП (пробанд 6) представлено на рис.3.32. ГП, выделенная из эритроцитов пробанда, менее термоустойчива, чем нормальная форма фермента. Результаты определения рНюптимума очищенной фракции ГП, выделенной из эритроцитов пробанда 6, представлены в табл.3.27. Фермент активен в,рН-среде от 6,5 до 10,5. В отличие от нормальных образцов максимальная активность аномальной ГП наблюдалась в более щелочной среде - рН-оптимум 9,5. Т.о., Ш,выделенная из эритроцитов пробанда 6 отличается от нормальных образцов некоторыми кинетическими свойствами: низким сродством с Ь -бутилгидроперекисью, менее термоустойчива и активна в более щелочной среде (рН-оптимум 9,5). Седьмой аномальный молекулярный вариант Ш (пробанд 7). У девочки, по национальности азербайджанки, 1978 г.рождения, скрининг-тестом установлена 60$ активность ГД в эритроцитах (12,03 ед/г Нв). Пробанд от неродственного брака. Анализ родословной семьи (рис.3.25.) показал наследственный характер дефицита фермента. Носителем мутантного гена явился отец, у которого активность Ш снижена на 50%. Дефект фермента обнаружен также у брата обследуемого. Активность ГП в эритроцитах матери и сестры в пределах нормы (18,5 и 18,3 ед/г Нв). Больная находилась в клинике с диагнозом гемолитическая анемия неясной этиологии. Физически слабая, трижды перенесла пневмонию. Количество общего гемоглобина - 7,5г%, гематокрит 29%, уровень сыврроточного билирубина 2,1 мг%, ретикулоциты -1,8%, мишеневидность значительная, эритроциты 3,8x10 /мкл. Содержание Нв А2 и J в норме; гемоглобинопатии не обнаружено. Активность ферментов Г6ФД,ГФИ, ГР в пределах нормы, пируватки-наза завышена (180% активности от нормы). Результаты исследования кинетических свойств мутантной Ш (электрофоретичеекая подвижность K j для субстратов, термостабильность и рН-оптимум) представлены в табл.3.27. Специфическая активность фермента в гемолизате пробанда 7 равна 12,03 ед/г Нв. Электрофоретическая подвижность препарата ГП, выделенного из эритроцитов пробанда не отличается от ГП-А нормальных образцов (рис.3.26.). Константа Михаэлиса в отношении глутатиона аномальной ГП равна 6,0 иМ (табл.3.27.); линейная зависимость скорости Ш-ре-акции от концентрации глутатиона для нормальных и мутантных форм представлена графически (рис.3.29.). В табл.3.27. и на рис.3.30 показано значение К в отношении іг-бутилгидролерекиси, которое равно 85( М Т.о.,, величины К аномальной формы ГЯ в отношении субстратов незначительно отличаются от нормальных образцов. ГИ, выделенная из эритроцитов пробанда, в отличие от ГП доноров, менее термоустойчива - при температуре 40, 45, 50С активность Ш снижается на 50, 75 и 90% от активности в 0-время в течение 15 мин; показано 50$ снижение активности Ш пробанда через 15 мин при 40С, тогда как в нормальных образцах пробанда падение ферментативной активности наступает через 15 мин при температурах от 45 до 50С. Графическое изображвние изменения активности фермента, выделенного из эритроцитов донора и пробанда при темпвратурах от 40 до 60С с интервалом в 5С в течение 15 мин показано на рис. 3.32, рН-оптимум мутантной формы Ш не отличается от нормальных образцов и равен 9,0 (табл.3.27.). Результаты кинетических исследований показали, что ГП, выделенная и очищенная из эритроцитов пробанда 7 отличается от Ш из эритроцитов доноров низкой ферментативной активностью, меньшей термостабильностью и незначительной разницей величин констант Михаэлиса для субстратов.
Исследование активности глутатионпероксидазы в эритроцитах здоровых людей
Настоящая работа посвящена изучению биохимического полиморфизма ГП энзимопатш у населения Азербайджана. Для установления наличия и частоты распространения Ш-энзимопатологии проведено массовое обследование населения Масаллинского и Таузского районов республики и г.Баку полуколичественным скринирующим методом. При выборе метода для массового обследования населения принималось во внимание применимость теста при измерении активности ГП в образцах крови человека, экспедиционные условия исследования, а также учитывалось количество использованных дорогостоящих и дефицитных реактивов, Б имеющейся литературе описано несколько методов флюоресцентных пятен для определения ГП в эритроцитах /39, 40,88,90,96,134/, Однако большинство методов применимы только для измерения активности фермента в эритроцитах животных при оценке концентрации селена в крови. Скринирующий тест определения активности Г1Т в эритроцитах людей предложен.Учитывая большой расход, в основном» кристаллической глутатион-редуктазы (10 ед/мл) в инкубационной смеси по методу Ивььи S , нами для массового обследования населения на активность ГП модифицирован метод ]!bDtyU3tciV &}t& JQlir01&tQ модификация включала замену цельной гепаринизированной крови, взятой в пробирки, образцами крови, взятых на фильтровальную бумагу, что удобно в условиях экспедиции при транспортировке (активность фермента сохраняется в течение 10-12 дней); изменена молярная концентрация НАДФН в реакционной смеси (0,024 М вместо 0,015 М в конечной концентрации).
Достоинством метода является также его относительная независимость от содержания эритроцитов в цельной крови - время дефлюоресценции не зависит от гематокрита в пределах 45-25%.
Разработанная модификация скринирующего метода может. быть использована при массовом обследовании с целью диагностирования дефицита ГП в эритроцитах человека.
Для выявления лиц с недостаточностью Ш обследовано 3054 человека, У 102 показана сниженная активность фермента (от 5,3 до 13,55 ед/г Нв) при норме от 14,06 до 23,9 ед/г Нв, что было подтверждено неоднократной спектрофотометрической оценкой» Б результате исследования установлены фенотипическая и генная частоты по каждому району: в Масаллинском районе из 1200 обследованных в образцах крови 43 человек подтверждён дефицит активности ГП, фенотипическая частота 3,5833%и генная 0,0173$; в Та-узском районе из 354 человек у семи показана низкая активность ГП с фенотипической частотой 1,9774% и генной - 0,098%; из 1500 обследованных в г.Баку в эритроцитах 52 человек выявлен дефицит фермента, т.е. фенотипическая частота распространения недостаточности ГП жителей г.Баку составила 3,4388% и генная - 0,017%. Жители г.Баку (студенты ВУЗов) - приезжие, уроженцы различных районов республики; по географическому расположению эти районы и, соответственно, обследованные разделены на четыре группы. Распределение частоты распространения ГП-энзимопатии представлено в следующем виде: в I группе обследованных, уроженцев северных районов республики, фенотипическая частота составляла 3,0%, генная - 0,013%; во второй группе ( уроженцы центральной части Азербайджана) фенотипическая частота распространения Г11-недоста-точности составляла 3,2%, генная - 0,016%; в третьей группе (уроженцы юго-восточной части республики) - фвнотипическая частота составила 4,0$ и генная - 0,02%; в четвёртой группе (уроженцы южных районов) фенотипическая частота распространения ГП-недостаточности - 3,5555$ и генная 0,0177%.
Т.о., в результате обследования 3054 человек, проживающих в различных районах республики, показано гетерозиготное носитель-ство ГП-энзимопатии в Азербайджане с фенотипической частотой распространения в среднемЗ,33% и генной - 0,0165%. Дефицит фермента в различных районах распределён относительно равномерно и составляет от 1,9% (Таузский район)до 4% (г.. Баку, Ш группа обследованных), хотя некторая закономерность распределения частоты мутантного гена ГП у жителей обследованных районов наблюдается: у жителей более южных районов республики частота дефекта Ш в два раза выше (в Масаллинском районе фенотипическая частота 3,58%, в Ш группе обследованных - 4,0%), чем у лиц, проживающих в северной части (Таузский район;.- 1,9%).
Вполне вероятно, что частота распространения мутантного аллеля ГП связана с высокой инбредностью и эндогамностыо браков в исследуемых популяциях. Средний процент родственных браков в Масаллинском районе составил около 40%, а в некоторых селах доходил до 88,4%; коэффициент инбридинга в Масаллинской популяции 0,0171, тогда как в Таузском районе - 0,0062. /19,21/.
Результаты массового обследования, свидетельствующие о наличии и частоте распространения мутантного гена ГП невозможно сопоставить с литературными, т.к. подобного рода исследования в GCCP и,в частности, в Азербайджане не проводились. Единственная работа, проведенная в этом направлении, представлена омЫеъё. /36,3% Автор обследовал 1137 человек афро-американского происхождения и по результатам электрофоретической подвижности судил о частоте мутантного гена популяции. Б образцах крови 33 человек (2,8%) им показана быстромигрирующая форма фермента. Автор считает мутационные изменения белка генетически детерминированными и полагает, что только исследование очищенного фермента позволит правильно определить его свойства.
Генетически обусловленный характер дефекта Ш показали и в наших исследованиях. Путём анализа родословных у 102 носителей ГП-дефицита во всех случаях установлен наследственный характер дефекта; у 61,7$ пробандов носителем мутантного аллеля ГП были оба родителя, у 26,4% - дефицит наблюдался в эритроцитах отца и в 11,76% - ГП-недостаточность передавалась от матери. Наследственный дефицит ферментов в эритроцитах во всех случаях проявлялся в первом же поколении, у пяти пробандов дефект фермента удалось проследить в трёх поколениях».
