Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Антимикробные пептиды (АМП) 8
1.1.1. Классификация АМП 8
1.1.2. Механизм действия АМП 15
1.1.3. Механизмы возникновения резистентности микроорганизмов к АМП 18
1.1.4. Терапевтическое применение АМП 20
1.1.5. АМП из яда паука Lachesana tarabaevi
1.1.5.1. Латарцины 24
1.1.5.2. Цито-инсектотоксины 27
1.2. Системы регуляции экспрессии генов 30
1.2.1. Молекулярные механизмы тетрациклин-зависимой системы регуляции экспрессии 30
1.2.2. Фармакология доксициклина 34
1.3. Особенности жизненного цикла Chlamydia trachomatis 35
2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Материалы 39
2.1.1. Штаммы E. coli 39
2.1.2. Плазмидные векторы 39
2.1.3. Реактивы и антибактериальные препараты 39
2.2. Методы 39
2.2.1. Реакция рестрикции 39
2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 40
2.2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 40
2.2.4. Реакция лигирования 40
2.2.5. Конструирование векторов 40
2.2.6. Культивирование клеток E. coli 42
2.2.7. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК 42
2.2.8. Выделение плазмидной ДНК методом кипячения 43
2.2.9. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 2.2.10. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК 43
2.2.11. Препаративное выделение плазмидной ДНК 43
2.2.12. Химический синтез пептидов. Определение концентрации полипептидов. УФ-спектрофотометрия 44
2.2.13. Тестирование антимикробной активности пептидов на E.coli 44
2.2.14. Культивирование линий клеток млекопитающих 44
2.2.15. Культивирование штамма C. trachomatis 45
2.2.16. Определение антихламидийной активности пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi 45
2.2.17. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) доксициклина на C. trachomatis 45
2.2.18. Трансфекция клеток линии HEK293 46
2.2.19. Заражение линии клеток HEK293 C. trachomatis 46
2.2.20. Выявление включений C. trachomatis 46
2.2.21. Конфокальная микроскопия 46
2.2.22. Определение титра C. trachomatis 47
2.2.23. Анализ жизнеспособности клеток 47
2.2.24. Выделение суммарной РНК из линии клеток HEK293, зараженной C. trachomatis 47 2.2.25. Реакция обратной транскрипции 48
2.2.26. Транскрипционный анализ 48
2.2.27. Протеомный анализ 48
2.2.28. Дополнительное программное обеспечение 50
2.2.29. Статистика 50
3. Результаты 51
3.1. Антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi 51
3.2. Антибактериальная активность пептидов из яда паука Lachesana tarabaevi на E. coli in vitro 51
3.3. Антимикробный эффект латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a на C. trachomatis 52
3.4. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих гены латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда паука Lachesana tarabaevi 53
3.5. Регуляция экспрессии генов, кодирующих латарцины и цито-инсектотоксин CIT1a, в клетках млекопитающих 57
3.6. Антихламидийная активность латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда пауков при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HEK293 59
3.7. Транскриптомный анализ клеток линии HEK293 при экспрессии гена цито-инсектотоксина cit1a 60
3.8. Протеомный анализ линии клеток HEK293 при экспрессии гена, кодирующего цито-инсектотоксин CIT1a 63
3.9. Влияние экспрессии гена цито-инсектотоксина cit1a на ингибирование инфекции C. trachomatis на разных фазах жизненного цикла 67
4. Обсуждение 72
Заключение 86
Выводы 88
Список сокращений 89
Список литературы
- Механизмы возникновения резистентности микроорганизмов к АМП
- Реакция рестрикции
- Химический синтез пептидов. Определение концентрации полипептидов. УФ-спектрофотометрия
- Антихламидийная активность латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда пауков при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HEK293
Механизмы возникновения резистентности микроорганизмов к АМП
На сегодняшний день считается, что нет единого для всех АМП механизма, объясняющего их действие на про- или эукариотическую клетку. В настоящий момент существует несколько моделей, демонстрирующих возможные варианты взаимодействия пептидов с клетками.
Контакт пептида с клеткой начинается с электростатического взаимодействия пептида и отрицательно заряженной мембраной клетки. В случае грам-отрицательных бактерий, молекуле пептида необходимо преодолеть дополнительную наружную мембрану, несущую отрицательный заряд, обусловленный наличием липополисахаридов в ее составе. А в случае грам-положительных бактерий, на пути к цитоплазматической мембране барьером служит клеточная стенка, состоящая из тейхоевых и липотейхоевых кислот, также имеющих отрицательный заряд. Положительно заряженные пептиды имеют высокое сродство к липополисахаридам (ЛПС) внешней мембраны. Это сродство выше, чем к ионам магния (Mg2+) и кальция (Ca2+) (Hancock and Chapple, 1999), поэтому в результате взаимодействия АМП с мембраной из последней происходит вытеснение двухвалентных ионов, что ведет к нарушению целостности наружной мембраны. Далее, достигнув цитоплазматической мембраны, пептиды при невысоком молярном соотношении пептид/липид, за счет электростатических взаимодействий выравниваются параллельно поверхности мембраны (Yang et al., 2001). Как только это соотношение возрастает, они начинают ориентироваться перпендикулярно бислою мембраны. При высоком молярном соотношении пептид/липид, молекулы пептида ориентируются перпендикулярно и встраиваются в мембрану. Причем критическая концентрация, необходимая для проникновения, различна для разных пептидов, а также зависит от типа липидов, входящих в мембрану (Yount and Yeaman, 2005). Дальнейшее развитие событий может происходить несколькими путями. Существует три модели, объясняющих, каким образом происходит разрушение мембраны - это модель «ковра», модель тороидальных пор и модель «доска-бочка» (da Costa et al., 2015) (рисунок 3).
Согласно модели «доска-бочка» (рисунок 3Б), -спирали пептида формируют трансмембранную пору путем образования узелков с люменом так, что гидрофобная поверхность пептида взаимодействует с гидрофобными липидами бислоя, а гидрофильная – образует внутреннюю часть поры (da Costa et al., 2015, Nguyen et al., 2011, Yang et al., 2001). При этом пору можно сравнить с бочонком, а молекулы пептида с досками в бочонке. Такой механизм действия обнаружен у аламетицина, при действии которого на клетку пору формируют от 3 до 11 молекул пептида (He et al., 1995, Spaar et al., 2004). Внутренний и внешний диаметры поры составляют 1.8 нм и 4.0 нм, соответственно.
В модели «ковра» (рисунок 3В) пептиды аккумулируются на поверхности бислоя (da Costa et al., 2015, Nguyen et al., 2011, Shai, 1999). Они располагаются параллельно бислою мембраны за счет электростатических взаимодействий с отрицательно заряженной поверхностью мембраны. Молекулы пептида выстилаются подобно ковру так, что гидрофильная составляющая пептида взаимодействует с гидрофильными участками липидов. Это, в свою очередь, при высокой концентрации пептида, вызывает изменение ориентации гидрофильной и гидрофобной частей липидного бислоя относительно друг друга. В конечном счете, происходит нарушение кривизны бислоя и разрушение мембраны. Таким образом действуют, например, овиспирин (Brogden, 2005), магаинин, дермасептин, цекропин.
Согласно модели тороидальных пор (рисунок 3А), в образовании поры участвуют как молекулы пептида, так и липиды мембраны. Пептид, встраиваясь в мембрану, вызывает искривление бислоя так, что полярная часть пептида и полярные части липидов, взаимодействуя, образуют пору (da Costa et al., 2015, Nguyen et al., 2011, Yamaguchi et al., 2002). В этой модели пептиды всегда связаны с липидами бислоя в отличие от модели «доска-бочка» (Yang et al., 2001). По механизму образования тороидальных пор действуют протегрин, мелиттин, магаинин (Matsuzaki et al., 1996, Yamaguchi et al., 2002, Yang et al., 2001). Размеры пор, образованных согласно этой модели, больше размеров пор, формирующихся по модели «доска-бочка». Внутренний диаметр поры, образованной магаинином, составляет от 3 до 5 нм, внешний - от 7 до 8 нм. В ее образовании участвуют от 4 до 7 молекул пептида и около 90 липидных молекул (Matsuzaki et al., 1998, Yang et al., 2001).
Большинство пептидов действуют по описанным выше механизмам. Но известны случаи, когда пептиды проникают через мембрану, не вызывая ее лизиса. Их действие направлено на различные внутриклеточные мишени (рисунок 4), что приводит к ингибированию синтеза клеточной стенки бактерии, подавлению биосинтеза нуклеиновых кислот и белков, либо ингибированию активности ферментов (Nguyen et al., 2011).
Также мишенями для АМП могут служить аутолизин бактерий и фосфолипазы эукариот, которые активируются ими. В присутствии тейхоевых и липотейхоевых кислот аутолизин находится в неактивном состоянии. При этом у Staphylococcus simulans аутолизин реактивируется при добавлении пептида Pep5 (Bierbaum and Sahl, 1987). Секретируемая фосфолипаза А2 также активируется в присутствии магаинина 2, индолицидина (Zhao and Kinnunen, 2003).
Другой АМП, буфорин, проникает через цитоплазматическую мембрану в клетку и аккумулируется в цитоплазме (Park et al., 2000). Затем происходит его связывание с нуклеиновыми кислотами, что приводит к гибели клетки (Park et al., 1998).
Пролин-богатый пептид PR-39 вызывает филаментацию Salmonella enterica серовара Typhimurium (S. typhimurium), а индолицидин приводит к филаментации E. coli (Shi et al., 1996, Subbalakshmi and Sitaram, 1998). Это может происходить по нескольким причинам: либо из-за нарушения репликации ДНК, либо из-за подавления активности ферментов, участвующих в образовании оболочки клетки. PR-39 блокирует синтез белка, приводит к деградации белков, необходимых для репликации ДНК (Boman et al., 1993). Индолицидин подавляет синтез ДНК и РНК (Subbalakshmi and Sitaram, 1998).
Гистатин проникает в клетки грибов и приводит к нелитической потере АТФ из активно дышащих клеток (Kavanagh and Dowd, 2004). Пирхорицин и дрозоцин связываются с шаперонами, специфически с DnaK и неспецифически с GroEL, препятствуя фолдингу белков (Otvos et al., 2000). Рисунок 4. Альтернативные механизмы действия АМП на примере Escherichia coli. Адаптировано из (Brogden, 2005).
Исследованы свойства некоторых пептидов, связанные с активацией иммунитета. Некоторые из таких АМП участвуют в хемотаксисе моноцитов, нейтрофилов, стимулируют заживление ран (Chertov et al., 1996, De et al., 2000, Kolls et al., 2008).
Хотя возникновение устойчивости у микроорганизмов к АМП кажется маловероятным в силу особенностей механизма действия, существует несколько примеров, подтверждающих такую возможность. Неизвестно, как быстро возникает такая устойчивость. Кроме того, остается неясным, как возникновение такой адаптации может повлиять на эволюцию АМП.
Рассмотрим несколько примеров возникновения резистентности микроорганизмов к АМП (рисунок 5). Одним из возможных механизмов возникновения такой устойчивости является изменение суммарного отрицательного заряда мембраны, приводящее к уменьшению сродства АМП к бактериальной мембране. Снижение величины суммарного отрицательного заряда происходит за счет модификации тейхоевых кислот, липида А, фосфолипидов и пептидогликана. Так, показано, что Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes способны уменьшать отрицательный заряд за счет перемещения D-аланина из цитоплазмы на наружную поверхность мембраны (Abachin et al., 2002, Peschel et al., 1999, Poyart et al., 2003). Этот перенос обеспечивается белками, кодируемыми опероном dltABCD. Другим примером данного феномена является модификация у S.aureus одного из важнейших фосфолипидов мембраны, лизилфосфатидилглицерола, L-лизином (Peschel et al., 2001), осуществляемая белком MprF. У грам-отрицательных бактерий также может происходить уменьшение отрицательного заряда за счет изменения структуры липида А (компонента липополисахаридов) при встраивании аминоарабинозы, например, как это происходит у Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa (Miller et al., 2005). S. enterica также способна добавлять жирные кислоты в структуры липида А, что уменьшает проницаемость внешней мембраны за счет увеличения гидрофобных взаимодействий (Guo et al., 1998). Тем не менее, антимикробная активность пептидов сохраняется при действии более высоких концентраций АМП. Это вызвано тем, что нейтрализация мембраны оказывается неполной.
Реакция рестрикции
Через 72 часа после заражения инфицированный монослой клеток разрушали с использованием стеклянных шариков, тщательно перемешивали и центрифугировали 1300 g 5 минут. Далее делали серию последовательных разведений супернатанта, которыми заражали новый монослой линии клеток. Через 24 часа оценивали образование хламидийных включений. Единицу, образующую включения, рассчитывали исходя из количества включений в одном поле зрения по следующей формуле:
Жизнеспособность клеток определяли с помощью теста LIVE/DEAD (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В основе теста лежит флуоресценция кальцеина (calcein AM) и гомодимера этидия (EthD-1). Полианионный краситель кальцеин, флуоресцируя зеленым светом (длина волны возбуждения/излучения 495 нм/ 515 нм), является индикатором активности внутриклеточной эстеразы. EthD-1 проникает через поврежденную мембрану и связывается с нуклеиновыми кислотами, флуоресцируя красным светом (длина волны возбуждения/излучения 495 нм/ 635 нм).
Выделение РНК из линии клеток HEK293, зараженной C. trachomatis, осуществляли с использованием набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США) следууя рекомендациям производителя.
Полученный образец РНК освобождали от примеси ДНК с помощью дезоксирибонуклеазы I (Fermentas, Литва). Реакция проходила при 37С в течение 30 мин в буфере, рекомендованном производителем, с добавлением 20 единиц ингибитора рибонуклеаз. 2.2.25. Реакция обратной транскрипции Денатурацию РНК и отжиг праймеров проводилив соотношении 1мкг РНК и 20 пмоль специфического праймера Un 5`-AGAACAATCAAGGGTCCCCAAACTC при 70С в течение 10 мин. Объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Далее пробирки охлаждали во льду.. Пробу смещивали с 200 ед. M-MLV обратной траскриптазы (Promega, США), 20 ед. ингибитора рибонуклеаз, 1 мM dATP, dCTP, dTTP и dGTP. Реакцию проводили в буфере, рекомендованном производителем, при 42С в течение часа. Затем смесь прогревали при 5 мин 95С.
Гибридизацию контрольных и опытных образцов проводили на чипах WG-6 версии 2 (Illumina, США), согласно рекомендациям производителя. Анализ полученных данных проводился с помощью программного обеспечения BeadStudio (Illumina, США). Анализ онтологии генов был выполнен при помощи программного обеспечения WebGestalt (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) (Zhang et al., 2005). Трансфицированные клетки промывали раствором Хенкса (Биолот, Россия), затем снимали 0,05% раствором трипсина (Sigma, США). Клетки осаждали центрифугированием при 130g в течение 10 мин, затем снова промывали раствором Хенкса (трижды). Осадок (около 10мкл) суспендировали в 100 мкл буфера следующего состава: 8 М мочевина (GE Healthcare, США), 2 М тиомочевина (GE Healthcare, США), 10 мМ Tris-HCl (GE Healthcare, США), 167 мкл раствора 30 % СHAPS (GE Healthcare, США) и 10 % NP 40, рН 8.0, вода для хроматографии (Merck, Германия). Далее образцы центрифугировали при 13000 g в течение 15 мин. Концентрацию белков в образце определяли с использованием набора Quick start Bradford (Bio 49
Rad, США), следуя инструкции производителя. Все образцы доводили до концентрации белка 2 мг/мл. После чего пробы окрашивали флюоресцентными метками CyDye-DIGE СуЗ (GE Healthcare, США) и CyDye-DIGE Су5 (GE Healthcare, США), согласно инструкции производителя, в соотнощении 400 пМ метки для 50 мкг общего белка. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 4 С в темноте, реакцию останавливали 10 мМ раствора лизина. Далее проводили одномерный электрофорез в 12% ПААГ для проверки эффективности окрашивания. Перед изоэлектрофокусировкой образцы смешивали в эквимолярном соотношении, к пробам добавляли DTT (GE Healthcare, США) (до 80 мМ) и амфолины 3-10 (GE Healthcare, США) (до 0,2%).
Изоэлектрофокусировку проводили в стеклянных 18-сантиметровых трубочках в 4% ПААГ: 8 М мочевина, 4 % акриламид/метиленбисакриламид, 2 % амфолины рН 3 - 10, 4 % амфолины рН 5 - 8, 6 % р-ра, содержащего 30 % CHAPS и 10 % NP 40, 0.1 % ТЕМЕД, 0,02 % персульфат аммония, при условиях: 100 В - 200 В - 300 В - 400 В - 500 В - 600 В в течение 45 мин, 700 В - в течение 10 часов, 900 В - 1 часа. Далее трубочки в течение 30 мин уравновешивали в буфере следующего состава: 6 М мочевина, 30 % глицерин, 62.5 мМ Tris-HCl, pH 6.8, 2 % додецилсульфат натрия, 20 мМ ДТТ, бромфеноловый синий. Далее трубочки переносили на поверхность градиентного полиакриламидного геля (9-16%) длиной 20 см, закрепляя при помощи 0,9 % агарозы с бромфеноловым синим. Электрофорез проводили в трис-глициновом буфере при охлаждении в условиях из расчета 20 мА на стекло в течение 20 мин, 40 мА на стекло - 2 часа, 35 мА на стекло - 2,5 часа при охлаждении камеры до 10 С.
Сканирование полученных гелей проводили на приборе Typhoon Trio Imager (GE Healthcare, США) при разрешении 200 dpi. Для последующей идентификации белков гели окрашивали серебром.
Химический синтез пептидов. Определение концентрации полипептидов. УФ-спектрофотометрия
Использование антибиотиков приводит к росту резистентных штаммов патогенных микроорганизмов. В настоящее время проблема антибиотико-резистентности представляет угрозу национальной безопасности в развитых странах. Антимикробные пептиды могут стать новыми противомикробными агентами при лечении различных инфекционных заболеваний.
Антимикробные пептиды являются частью древнейших защитных систем живых организмов. За последние годы изучено большое количество АМП, охарактеризованы их свойства и функции. На данный момент описано более 2000 АМП (aps.unmc.edu/AP/main.php), обнаруженных у самых разнообразных организмов. Так, пептиды выделены из растений, грибов, беспозвоночных, позвоночных животных, включая человека (Tossi et al., 2000). Среди всего многообразия данного класса соединений особое внимание привлекают АМП из ядов членистоногих, служащие одновременно средствами защиты и нападения (Mebs, 2002). Состав яда членистоногих представлен цитолитическими пептидами, ферментами, дисульфид-содержащими нейротоксинами, а также низкомолекулярными соединениями. В нашей работе мы остановили свой выбор на пептидах из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi (таблица 11). В составе яда среднеазиатского паука обнаруживается широкое разнообразие компонентов, отобранных в ходе эволюции. В яде присутствуют одновременно большое количество как гомологичных, так и различающихся по структуре АМП и нейротоксинов. При этом биосинтез этих компонентов яда происходит сходным образом. Препроучастки в молекулах предшественников консервативны, а зрелые пептиды отличаются значительной вариабельностью (Vassilevski et al., 2009).
В яде Lachesana tarabaevi представлены уникальные по составу АМП, в число которых входит группа латарцинов. Латарцины — это короткие (до 30 а.о.), линейные, катионные (pI 10) и амфифильные пептиды. В водном растворе они имеют неупорядоченную структуру, а в мембранном окружении склонны к образованию -спирали (Kozlov et al., 2006). Их заряд при нейтральном pH колеблется от +5 до +9. Также среди пептидов из яда Lachesana tarabaevi следует отметить особый уникальный класс пептидов - цито-инсектотоксины. К ним относятся линейные катионные пептиды необычной длины – 69 а.о. (Vassilevski et al., 2008), в последовательности которых не обнаружено остатков цистеина, в то время как лизин составляет около 30% аминокислотного состава. Суммарный заряд при pH 7 составляет +14. Этот необычный класс АМП появился, по всей видимости, благодаря мутации, приведшей к невозможности разделения двух коротких линейных пептидов из молекулы предшественника. До сих пор не описано универсального механизма взаимодействия АМП с про- и эукариотическими клетками. В настоящее время существует несколько моделей воздействия пептида на клетку: модель тороидальных пор, модель «ковра» и модель «доска-бочка» (Jenssen et al., 2006). Для всех моделей предполагается, что на первом этапе имеет место электростатическое взаимодействие положительно заряженного пептида и отрицательно заряженной мембраны клетки. Амфипатичная природа АМП предполагает эффективное взаимодействие их с молекулами липидов в составе мембраны. При достижении определенного молярного соотношения пептид/липид, пептиды ориентируются перпендикулярно поверхности мембраны. После этого происходит образование поры в мембране согласно одной из моделей действия АМП на клетку. В независимости от реализуемого механизма образования поры, это приводит к нарушению целостности плазматической мембраны и, как следствие, дальнейшей гибели клетки.
Ранее была продемонстрирована высокая антимикробная и цитолитическая активность исследуемых нами пептидов на различных организмах, таких как грамположительные (Arthrobacter globiformis, Bacillus subtilis) и грамотрицательные бактерии (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa), дрожжи; гемолитическая активность — на эритроцитах кролика и человека (Kozlov et al., 2006). Диапазон активных концентраций для пептидов колебался в пределах 0,5–16 мкМ для разных микроорганизмов. Значения МИК наиболее активных пептидов для E. coli (таблица 12) составляет 0,5 мкМ (латарцины Ltc2 и Ltc5). Наименьшая активность среди латарцинов наблюдается у пептида Ltc4b, его МИК - 4,5 мкМ. Данные по антимикробной активности пептидов из яда Lachesana tarabaevi согласуются с общепринятым механизмом действия АМП, а именно с нарушением целостности мембраны клетки посредством образования поры и последующим лизисом клетки.
Наибольшей гемолитической активностью обладали пептиды Ltc2, Ltc 5 и CIT1a. Важно отметить, что значения концентраций, вызывающих 50% лизис эритроцитов, для пептидов из яда паука выше, чем для мелиттина. При анализе инсектицидной активности пептидов из яда паука было показано, что цито-инсектотоксин CIT1a в 20 раз активнее по отношению к линии клеток насекомых Sf9 в сравнении с латарцином Ltc 2a (Vassilevski et al., 2008). При анализе токсического действия пептидов на лабораторных мышах активность CIT1a и Ltc 2a была сопоставима, а при действии пептидов на насекомых цито-инсектотоксин CIT1a проявлял значительно большую активность по сравнению с латарцинами. Высокая активность цито-инсектотоксинов в отношении насекомых и обусловила название данного класса пептидов из яда Lachesana tarabaevi. Известно, что некоторые АМП, в частности, мелиттин, способны вызывать аллергические реакции у человека. В то же время не было найдено каких-либо совпадений при сравнении аминокислотной последовательности CIT1a с последовательностями в базе данных аллергенов (http://www.allergome.org). Высокая антибактериальная активность совместно с низкой токсичностью цито-инсектотоксина CIT1a для клеток эукариот делает его привлекательным агентом в борьбе с внутриклеточными инфекциями.
Внутриклеточный патоген C. trachomatis вызывает такие серьезные заболевания, передающиеся половым путем, как уретриты, цервициты, сальпингиты, также может приводить к бесплодию. Общепринятым средством борьбы с развитием хламидийной инфекции являются антибиотики. Однако уже описан ряд случаев возникновения устойчивости к различным антибиотикам у C. trachomatis (Jones et al., 1990, Mourad et al., 1980, Somani et al., 2000). Альтернативой антибиотикам в лечении инфекции, вызванной C. trachomatis, могут служить АМП. Ранее была продемонстрирована антихламидийная активность мелиттина из яда пчелы Apis mellifera (Lazarev et al., 2002, Lazarev et al., 2005). Однако мелиттин обладает сильной гемолитической активностью, а также может являться аллергеном, что делает возможность его использования в качестве лекарственного препарата не очевидной.
Антихламидийная активность латарцинов и цито-инсектотоксина CIT1a из яда пауков при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HEK293
Известно, что хламидии активно используют цитоскелет клетки-хозяина. Взаимодействие с актином, микротрубочками и промежуточными филаментами играет важную роль для патогена на всех этапах его жизненного цикла, особенно на стадиях проникновения в клетку и образования включения (Scidmore, 2011). Для проникновения в клетку хламидии используют Rac1-зависимый механизм реорганизации актина. В этом процессе ключевую роль играет хламидийный белок-эффектор TARP (translocated actin-recruiting phosphoprotein). Регуляция реорганизации актина посредством TARP возможна как за счет изменения активности Rho GTPаз, так и непосредственного участия в полимеризации при взаимодействии с актином. TARP взаимодействует с Sos2, Vav2 и факторами обмена гуаниновых нуклеотидов (GEFs), которые в свою очередь активируют Rac1. Хламидии также секретируют белки, вызывающие деполимеризацию актина, а именно CT166, гликозилирующий Rac1, и CT694, который взаимодействует с актин-связывающим белком AHNAK (Bastidas et al., 2013).
Во время ранней фазы инфекции образующееся включение перемещается в перинуклеарную область клетки-хозяина и остается тесно связанным с аппаратом Гольджи, где включение начинает сливаться с везикулами, содержащими сфингомиелин. Для своего перемещения хламидии активно используют микротрубочки, включение двигается к минус-концу микротрубочек и остается в тесной связи с центром образования микротрубочек (Grieshaber et al., 2006). Транспорт различных компонентов в клетке вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков: кинезинов и динеинов. Движение хламидий вдоль микротрубочек происходит динеин-зависимым способом. Для перемещения C. trachomatis, подобно везикулярному транспорту в клетке, белки мембраны включения взаимодействуют с динеином и некоторыми компонентами комплекса динактина (Grieshaber et al., 2003).
Зрелое включение стабилизируется в клетке за счет образования вокруг него «каркаса», состоящего из F-актина и промежуточных филаментов (Kumar and Valdivia, 2008). Более того, протеаза хламидий CPAF, секретируемая в цитоплазму, взаимодействует с виментином, изменяя структурные свойства промежуточных филаментов на поверхности включения. За счет этого «каркас» становится динамичным, т.е. способен расширяться вместе с увеличивающимся в размерах включением на поздних стадиях развития хламидий. Анализ транскриптомного профиля клеток при экспрессии гена cit1a показал изменение уровня транскрипции генов acta1, actg1, myh3, кодирующих актин и миозин соответственно. Кроме того, протеомный анализ трансфицированной плазмидным вектором pBI-EGFP-rtTA-CIT1a линии клеток HEK293 показал отличия в уровнях миозина, белка 4, ассоциированного с цитоскелетом, кератина, тубулина, виментина (таблица 15), главных компонентов цитоскелета эукариотической клетки. Также следует отметить изменение уровня кинезин-подобного белка KIF17, который, как и динеин, является моторным белком, участвуя в транспорте различных компонентов вдоль микротрубочек.
Принимая во внимание прочную взаимосвязь жизненного цикла хламидии с цитоскелетом клетки-хозяина, изменение уровня экспрессии генов и белков, вовлеченных в организацию актина, промежуточных филаментов и микротрубочек, может значительным образом сказываться на развитии хламидийной инфекции.
Как упоминалось выше, хламидии, находясь в клетке, тесно связаны с аппаратом Гольджи. C. trachomatis получает холестерин эукариотических клеток, синтезированный de novo или из липопротеинов низкой плотности. Хламидийное включение сливается с везикулами, содержащими сфингомиелин, перехватывая их на пути транспорта от аппарата Гольджи к плазматической мембране (Carabeo et al., 2003). Было показано, что во время инфекции C. trachomatis в эукариотической клетке происходит фрагментация аппарата Гольджи с образованием миницистерн, окружающих бактериальное включение (Heuer et al., 2009). Образование миницистерн инициируется протеолитическим распадом формирующего матрикс аппарата Гольджи белка гольджина-84. Фрагментация аппарата Гольджи является критическим моментом для внутриклеточного роста C. trachomatis. Таким образом, изменения в функционировании аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума (ЭПР) могут существенным образом повлиять на эффективный рост хламидий внутри эукариотической клетки. При протеомном профилировании линии клеток, экспрессирующей ген cit1a, нами было показано изменение количества белка 1 комплекса рецептора SNAP аппарата Гольджи (Golgi SNAP receptor complex member 1 GOSR1), а также АТФазы гладкого ЭПР (валозин-содержащего белка) VCP (таблица 15). Комплекс белков рецептора SNAP аппарата Гольджи относится к семейству белков SNARE, вовлечен в транспорт компонентов от ЭПР к аппарату Гольджи. Более того, обнаружено, что синтаксин 6, также относящийся к семейству белков SNARE взаимодействует с мембраной хламидийного включения (Moore et al., 2011).
C. trachomatis активно модифицируют мембрану включения с помощью собственных белков сразу после ее проникновения в клетку. Белки мембраны включения хламидий являются посредниками во взаимодействии патогенного микроорганизма с эукариотической клеткой. Одним из примеров такого взаимодействия является взаимосвязь белков 14-3-3 клетки-хозяина и хламидийного белка IncG. Данный процесс видоспецифичен, поскольку в случае инфекции C. psittaci и C. pneumoniae подобного взаимодействия не происходило (Scidmore and Hackstadt, 2001). Белки 14-3-3 принадлежат к семейству высококонсервативных фосфосерин-связывающих белков. Изоформа 14-3-3 является первым описанным эукариотическим белком, для которого показано взаимодействие с хламидийным включением посредством IncG. Белок 14-3-3 взаимодействует с различными сигнальными молекулами, что указывает на его роль в таких важных процессах как регуляция клеточного цикла и дифференцировка клеток. При инфицировании клетки C. trachomatis большая часть белка 14-3-3 обнаруживается в связанной с хламидийным включением форме. Таким образом, нарушается взаимодействие данного белка с другими клеточными компонентами, что может приводить к изменению путей трансдукции сигнала (Scidmore and Hackstadt, 2001). Помимо этого, адаптерный белок 14-3-3 может принимать участие в регуляции процесса активации апоптоза. При инфицировании клетки C. trachomatis BAD, взаимодействуя с 14-3-3, оказывается связанным с хламидийным включением. Это приводит к тому, что фосфолирированный BAD не взаимодействует с митохондриями, где он может индуцировать апоптоз за счет выхода цитохрома С. Таким образом, в клетке, инфицированной C. trachomatis, не запускается процесс апоптоза, что является следствием взаимодействия белка мембраны включения IncG с фосфосерин-связывающим белком, который, в свою очередь, связывает BAD (Verbeke et al., 2006). Взаимосвязь белка 14-3-3 с хламидийным включением показана только для изоформы 14-3-3, остается неясным происходит ли подобное в случае других изоформ данного белка. Возможно, обнаруженное изменение количества белка 14-3-3 в 3,09 раза при экспрессии гена cit1a в линии клеток (таблица 15) может сказываться на развитии хламидийной инфекции.