Введение к работе
Актуальность проблемы.
Проблема, как линейная аминокислотная последовательность полипептида сворачивается, чтобы принять уникальную пространственную структуру, является одной из фундаментальных проблем современной науки. Многие принципы и характеристики сворачивания белков были изучены при анализе ренатурации денатурированных полипептидов. Однако проблема сворачивания белков не может быть полностью понята без соотнесения ее к биологическому контексту, особенно для больших, мультидоменных и мультисубъединичных, белков. Одно из основных различий между биосинтетическим сворачиванием белка и его ренатурацией является котрансляционное сворачивание- сворачивание, которое происходит во время синтеза полипептидной цепи на рибосоме. Основная отличительная черта котрансляционного сворачивания- векторное (направленное) появление полипептидной цепи из рибосомы и возможность инициации сворачивания появляющегося растущего полипептида. При этом самым существенным образом может отличаться кинетика процесса сворачивания, его пути и возможное распределение продукта между несколькими формами (например нативная и агрегированная форма) и их относительный выход. Обеспечение эффективного сворачивания белков и есть суть биосинтетического процесса сворачивания и векторного (котрансляционного) сворачивания как его интегральной части, как мы постараемся показать в данной работе.
За последние 15-20 лет появился огромный вал работ, связанный с участием белков теплового шока, теперь обычно называемых молекулярными шаперонами или просто шаперонами. Тем не менее, даже основные принципы и механизмы действия шаперонов не являются достаточно изученными. Работы, направленные их выяснение, являются несомненно актуальными.
Достаточно очевидна актуальность создания, исследования и возможного применения новых вариантов природных белков и искусственных полипептидов с заданной пространственной структурой как для проверки понимания самоорганизации белков, так и создания белков с определенными функциями для медицины, биотехнологии и т.д.
Внимание к изучению вируса гепатита С (ВГС) легко объяснимо. Вирусом инфицировано 3-5% населения, у 30% инфицированных развиваются терминальные болезни печени. При этом, несмотря на колоссальные усилия в течение около 20 лет после обнаружения ВГС, отсутствуют как соответствующая вакцина, так и эффективная терапия.
Создание рекомбинантной противотуберкулезной вакцины несомненно является актуальным и объявлено одним из приоритетов ВОЗ ввиду ограниченной эффективности БЦЖ.
Целями настоящей работы являются: изучение биосинтетического сворачивания белков, в том числе котрансляционного этапа и вклада молекулярных шаперонов в процесс сворачивания; разработка подходов для изучения сворачивания, структурно-функционального и иммунологического анализа белков в бесклеточных системах экспрессии; изучение природных и
искуственных белков с применением, в том числе, разработанных подходов; изучение подходов к созданию противотуберкулезной вакцины на основе молекулярных шаперонов.
Основными экспериментальными задачами данной диссертационной работы являлись: изучение этапов котрансляционного сворачивания белков; характеристика пути биосинтетического сворачивания белков и прямое сравнение с ренатурацией из денатурированного состояния; выяснение принципов действия молекулярных шаперонов в достижении белками биологически активной нативной конформации и минимизации альтернативных непродуктивных путей сворачивания. Кроме этого, задачами являлись: изучение альбебетина, искуственного белка с заранее заданной пространственной структурой, и структурных белков вируса гепатита С; изучение шаперона HSP70 М. tuberculosis как основы противотуберкулезной вакцины.
Научная новизна диссертационной работы.
Детально исследован процесс котрансляционного сворачивания полипептидов. Для этой цели разработаны целый ряд оригинальных подходов. Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что процесс сворачивания полипептида может начинаться до завершения синтеза соответствующего домена белка. При этом образующаяся структура рибосомо-связанного полипептида близка к структуре нативного белка.
Впервые, на примере |3 субъединицы бактериальной люциферазы, изучен путь биосинтетического сворачивания белка, охарактеризован основной скорость-лимитирующий интермедиат при сворачивании и кинетика процесса. Показано, в прямом сравнении с ренатурацией денатурированной |3 субъединицы, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активной люциферазы. Таким образом, доказано, что котрансляционное сворачивание полипептидов является фактором, который обеспечивает быстрое сворачивание в клетках. Показано, что ключевым для быстрой кинетики биосинтетического сворачивания является нестабильный интермедиат, освобождающийся из рибосомы после завершения синтеза.
На основании полученных результатов выдвинуты некоторые основные принципы котрансляционного сворачивания.
Изучена роль молекулярных шаперонов в биосинтетическом сворачивании белков. Показана вовлеченность шаперонов в процесс котрансляционного сворачивания полипептидов; продемонстировано, что эти взаимодействия могут быть ключевыми для определения пути сворачивания полипептида. Показано, на примере GroEL, что шапероны могут играть активную роль в сворачивании белка, максимально повышая путь сворачивания, ведущий к биологически активной структуре белка и минимизируя альтернативные пути, приводящие к появлению биологически не значимых форм. Предложен механизм такого действия шаперонов.
Изучены эволюционные аспекты сворачивания полипептидов. Показано, что биосинтетическое сворачивание полипептида в гомологичном для него окружении может отличаться от сворачивания в гетерологичной системе.
Таким образом, совокупность полученных результатов позволяет сказать,
что начато новое научное направление- изучение биосинтетического
сворачивания белков как комплексного процесса, определяемого
совокупностью факторов, которые делают указанный путь сворачивания уникальным: это и векторный неравновесный характер процесса, определяемый его котрансляционной стадией, и вовлеченность шаперонов, и эволюционная адаптация для сворачивания в определенном клеточном окружении. Этот подход включает определение путей биосинтетического сворачивания и их прямое сравнение с процессом ренатурации полноразмерных полипептидов.
Предложен новый подход к структурно-функциональному и иммунологическому анализу белков- анализ белков, синтезированных в бесклеточных системах экспрессии. Данный подход позволяет изучать белки, которые затруднительно или невозможно получать традиционной наработкой в клеточных системах культивирования. Для этого предложен или адаптирован целый ряд методов. Используя данный подход, изучен искуственный полипептид альбебетин, белок с заранее заданной пространственной структурой. Проведен начальный структурно-функциональный анализ структурных белков вируса гепатита С. Изучен конъюгат шаперона HSP70 М. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием как возможная основа противотуберкулезной вакцины.
Практическая значимость диссертационной работы. Установленные закономерности биосинтетического сворачивания белков вносят заметный вклад в понимание процесса их сворачивания и самоорганизации. Полученные результаты позволяют оптимизировать продукцию рекомбинантных белков в клеточных и бесклеточных системах экспрессии, а также процедуры ренатурации в биологически активные формы.
Разработанные подходы для структурно-функционального и иммунологического анализа полипептидов, в том числе синтезированных в бесклеточных системах, могут применяться для быстрого анализа природных и искуственных полипептидов, экспрессия которых в клетках затруднена, например из-за токсичности, подверженности протеолизу и т.д. Возможности подхода продемонстрированы на начальном структурном анализе альбебетина, полипептида с заранее заданной пространственной структурой.
Большое практическое значение имеет изучение структурных белков ВГС. В настоящее время отсутствуют вакцина против ВГС. Структурные белки вируса рассматриваются как кандидаты на создание соответствующей вакцины и терапии. Их анализ и использование в данных качествах затруднены сложностью работы с данными белками. Получены несколько форм структурного белка Е2, пригодных для структурно-функционального анализа. Установлена его доменная организация.
Показано, что конъюгат шаперона HSP70 М. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием может являться основой противотуберкулезной вакцины.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Gordon conference (USA, 1994, 1998-2000), Conference of Protein society, USA (USA, 1994-2000), Conference of Biochemical
society, USA (USA, 1995, 1997-2000), Protein folding conference (USA, 1992-2000), Keystone Simposium (USA, 1995, 1996, 1997, 2000), International congress on HCV (Japan, 2004), conference of Royal Society on British-Russian scientific cooperation (UK, 2004), всесоюзной конференции биохимического общества (Тбилиси, 1989), российско-французской конференции (Москва, 1992). Результаты работы докладывались на семинарах в Институте белка (Пущино), Институте Пастера (Франция), Центре ядерных исследований (Франция), Высшей политехнической школе (Франция), Университете Страсбурга (Франция), Техасского А и М университета (Колледж Стейшн, США), университетов Техаса в Остине, Сан-Антонио, Хьюстоне, Далласе и Гальвестоне, Университете Пенсильвании (Херши, США), Институте биологии (Бостон, США), Гарвардском университете (Бостон, США), Гарвардской школе медицины (Бостон, США), Университете Глазго (Великобритания), Отделении вирусологии медицинского исследовательского совета (Великобритания).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 статей в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шестнадцати глав, заключения, выводов и списка 381 цитируемого литературного источника. Материалы диссертации иллюстрируют 69 рисунков и 4 таблицы.
Используемые сокращения. ВГС- вирус гепатита С.
HSP- белок теплового шока (heat shock protein), эти белки также называются молекулярными шаперонами.
GroEL- бактериальный белок теплового шока с молекулярной массой 60 кДа. DnaK- бактериальный белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа. HSP70 М. tuberculosis - белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа микобактерии туберкулеза.
