Введение к работе
Актуальность проблед»ы. Изучение механизмов биогенеза и регуляции якового состава пероксисом эукариотическж клеток является одним из ввивающихся аспектов биологин клетки. Дополнительный стимул к разработке ІННОГО направления связан с обнаружением наследственных заболеваний шовека, связанных с дисфункцией пероксисом (ПС). Удобной моделью для следования этих органелл являются дрожжи, среди которых особое место іинадлежит группе метилогрофных дрожжей.
За последние годы был получен ряд регуляторныхих мутантов с мененным спектром утилизируемых источников углерода [Сибирный А.А. и і., 1986; Sibirny, А.А., et al., 1987,], позволивших исследовать пути метаболизма пганола, этанола и глюкозы в дрожжевой клетке. Особое значение в последнее емя получили исследования, направленные на расшифровку механизмов анслокации и сборки белков в пероксисомах. Получен ряд мутантов по сборке биогенезу пероксисом, что позволило идентифицировать группу белков, аствующих в этом процессе.
Пути превращения метанола, этанола, глюкозы и irx регуляция довольно эдны у всех видов метилогрофных дрожжей [Sahm, Н., 1977; Veenhuis, J.P., et 1983]. При этом утилизация метанола и этанола сопровождается цественным изменением белкового матрикса пероксисом. Транскрипция «уктурных генов, кодирующих алкогольоксидазу (ЕС 1.1.3.13) наиболее ражена в присутствии метанола [Eggeling, L., et al., 1980], а многоуглеродные їстратьі роста (этанол, глюкоза) репрессируют ее синтез [Eggeling, L., et al., 50; Сибирный А.А. и др., 1986]. Помимо катаболнтной репрессии, ферменты юксисом, в том числе и алкогольоксидаза (АО), подвержены катаболитиой іктивации, которая наблюдается при переносе дрожжевых клеток, выросших метаноле, в среду с глюкозой или этанолом [Сибирный А.А. и др., 1986; Hill, ., et al., 1985; Tutlle, D.L., et al., 1995]. По исчерпание репрессора вновь
синтезируемые предшественники АО транслоцируются только в находящуюся ) стадии роста ПС и не обнаруживаются в ПС, возникших при росте на этанол Все имеющееся данные о регуляции биосинтеза АО не дают однозначного отве на вопрос, является ли присутствие метанола решающим фактором д транскрипции генов АО и развитии ПС определенного белкового состава.
Агрегатное состояние АО, а также активность фермента, зависят соединений, которые взаимодействуют с SH-реагентами [Bellion, Е., Goodmc J.M., 19S7]. Определение первичной структуры АО дрожжей P. methanoli показало, что АО относится к цистеин-богатым белкам [Raymond, С.К., et і 1998]. Несет ли это какую-нибудь функциональную нагрузку - неизвестно, можно предположить, что некоторые из цистеиновых остатков существенны восстановленном состоянии для правильной сборки активного фермента, поддержание восстановительных условий в матриксе пероксисом — важт функция глутатиона и глутатионредуктазы при росте клеток на метаноле.
Для большей части белков, локализованных в цитоплазме, отсутству условия для образования дисульфидных связей вследствие восстановленное среды [Freedman, R.B., 1989]. Необходимое для стабильности S-S свя; соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона обнаруже экспериментально лишь в эндоплазматическом ретикулюме у эукариотичес* клеток и в периплазме бактерий и дрожжей [Raina, S., Missiakas, D., 1997], настоящему времени нет надежной информации ни о степени восетановленної матрикса пероксисом, ни о необходимости глутатиона для поддержаї структуры ферментов матрикса.
Основной целью данной работы стала идентификация регуляторг механизмов биосинтеза и транслокации АО в пероксисомы и исследования р< сульфгидрильных соединений в поддержание активной октамерной структ) фермента у метилотрофных дрожжей Piclria methanolica. При э~ предусматривалось решение следующих задач:
исследование мутанта с нарушенной эганолыгой репрессией ecrl и іределенне в локализации алкогольоксидазы в клетках этого штамма методом імуноспецифической электронной микроскопии,
характеристика пероксисом дрожжей дикого типа и мутанта ecrl с >чки зрения распределения в них ключевого фермента метаболизма метанола,
исследование влияния Р-меркаптоэтанола на активность АО н рост еток дрожжей дикого типа и клеток мутантов, нерастущих на метаноле.
Научная новизна. Впервые показано, что метанол не является ідуктором синтеза алкогольоксидазы у метилотрофных дрожжей Р. zthanolica. Установлено, что у мутанта по катаболитной репрессии в шсутствии этанола алкогольоксндаза синтезируется и транспортируется в роксисомы, где и собирается в активный комплекс. Сульфгидрильные агенты необходимы для синтеза и проявления активности алкогольоксидазы у танта, не растущего на метаноле. Это указывает на важность тиолового зтуса клетки для сборки/функционирования алкогольоксидазы in vivo.
Практическая значимость работы. Полученные результаты по учению функционирования алкогольоксидазы у мутанта с нарушенной габолитной репрессией, создают теоретическую основу для понимания огенеза пероксисом с целью выявления причин ряда заболеваний человека.
Данные по исследованию токсичности сульфгидрилъных соединений гут быть использованы для создания штаммов дрожжей, устойчивых к эессивному воздействию SH-реагентов.
Публикации » апробация работы. По материалам диссертации убликовано и принято к публикации 5 печатных работ. Основные положения Зоты были представлены на школе-конференции «Горизонты физико-мической биологии» (Пущино, 2000).
Объем работы. Диссертация имеет стандартную структуру. Всего
)., в том числе 2 таблицы, 18 рисунков и 121 ссылок цитируемой литературы.