Введение к работе
Актуальность проблемы. В современной клинической практике широко
используется ряд адамантан-содержащих лекарственных препаратов, обладающих противопаркинсонической (амантадин, мемантин) [Schawab et al., 1969; Rabey et al., 1992], противовирусной (ремантадин, адапромин) [Перший и соавт., 1973; Букринская, 1988], ноотропной (адафеноксат) [Petkov et al., 1988], иммуностимулирующей (кемантан) [Арцимович и соавт., 1990], миорелаксантной (диадоний) [Харкевич и соавт., 1974], противоопухолевой (ДАМП) [Но et al., 1972] активностью. Однако, у многих производных адамантана, помимо основных эффектов, обнаружены нейропсихотропные свойства активирующего типа, обусловленные, как полагают, специфическим дофамин- и серотонинпозитивным действием, а также тропностью к рецепторам возбуждающих аминокислот [Морозов и др., 2001]. Эти вещества обладают низкой токсичностью, не вызывают эйфории, толерантности и зависимости [Вальдман и соавт., 1976]. Еще одним общим свойством этих соединений является их высокая мембранотропность, связанная с липофильностью адамантанового ядра, и в значительной степени определяющая особенности фармакокинетики и фармакодинамики адамантановых производных [Ковалев, 1977]. В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН на протяжении ряда лет проводился целенаправленный поиск новых эффективных средств психоактивирующего действия на основе производных адамантана [Морозов и соавт., 1999]. В результате скрининговых исследований по анализу совокупности фармакологических свойств и выраженности психоактивирующих эффектов было отобрано соединение АДК-709 - ]Ч-(2-адамантил)-]Ч-парабромфениламин. После обнаружения в спектре действия препарата анксиолитических свойств соединение получило название ладастен [Середенин и соавт., 2001]. К настоящему времени фармакологическая активность ладастена и некоторые аспекты механизмов его действия достаточно подробно изучены и охарактеризованы. Это позволило рекомендовать препарат для клинических исследований в качестве антиастенического средства при психогенных астенических расстройствах [Сюняков и соавт., 2006].
Как уже отмечалось выше, первоначально ладастен разрабатывался в качестве средства повышения адаптации и работоспособности в экстремальных условиях, включающих интенсивные физические и эмоционально-психические нагрузки. Традиционно с этой целью использовались психостимуляторы - производные и
структурные аналоги фенилалкиламинов, сиднониминов, а также антигипоксанты, транквилизаторы, ноотропы, адаптогены и вещества метаболического типа действия [Бобков и соавт., 1984]. В то же время, экспериментальные психофармакологические исследования позволили выявить целый ряд преимуществ ладастена перед классическими психостимуляторами. Следует отметить, что в доступной нам литературе данные о лекарственных веществах - производных аминоадамантана - с подобным спектром действия не обнаружены, что определяет необходимость изучения механизмов действия ладастена. Поскольку ранее использованные нейрохимические методы не позволяли придти к заключениям о том, как реализуются его эффекты, главным образом психостимулирующие, в настоящей работе в качестве концептуального избран подход оценки динамики функционального состояния потенциальной фармакологической мишени ладастена - ключевого фермента биосинтеза катехоламинов - тирозингидроксилазы. Подробное изучение нейрохимического профиля ладастена, механизмов его дофаминпозитивного действия в процессе реализации эффектов препарата позволяет углубить представления о фармакологических мишенях ладастена и открывает перспективы создания на его основе новых, более эффективных препаратов.
Цель исследования. Выявление основных механизмов регуляции биосинтеза ключевого фермента синтеза катехоламинов тирозингидроксилазы (ТГ) в клетках различных структур головного мозга крыс при однократном введении ладастена. Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо были поставлены следующие задачи:
исследовать влияние однократного введения ладастена (50 мг/кг, in vivo) на уровень L-ДОФА и дофамина в различных структурах мозга крыс;
изучить динамику экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы, а также уровня фермента, фосфорилированного по Ser40 (pTT-Ser40) в вентральной области покрышки, прилежащем ядре, гипоталамусе, стриатуме, и гиппокампе головного мозга крыс в зависимости от продолжительности действия препарата (50 мг/кг, in vivo);
изучить действие однократного введения ладастена (50 мг/кг, in vivo) на характер метилирования CpG-динуклеотидов промоторной области гена тирозингидроксилазы, экспрессирующегося в гипоталамусе крыс;
- исследовать эффект ладастена (однократно, 50 мг/кг, in vivo) на динамику уровня гистондеацетилазы 1 (HDAC1), а также содержание ацетилированных форм НЗ и Н4 гистонов (ацетил-НЗ, ацетил-Н4) в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе крыс. Научная новизна. Впервые показано, что ладастен при однократном внутриже луд очном введении в дозе 50 мг/кг увеличивает экспрессию гена тирозингидроксилазы и содержание соответствующего белка, коррелирующее с накоплением продуктов реакции - L-ДОФА и дофамина в гипоталамусе, гиппокампе и вентральной области покрышки экспериментальных животных. Синтез de novo данного катехоламина под действием ладастена рассматривается в качестве основного механизма, определяющего особенности психоактивирующего действия препарата. Впервые показано, что изменение транскрипционной активности гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса крыс под действием ладастена может быть связано с изменением характера метилирования CpG-динуклеотидов в промоторной его области: выявлено увеличение частоты деметилирования CpG-динуклеотидов в последовательностях, ассоциированных с сайтами связывания отдельных транскрипционных факторов. Установлено, что ладастен снижает уровень гистондеацетилазы 1 в стриатуме и гиппокампе крыс, а также влияет на содержание ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4 в различных структурах мозга крыс. Научно-практическая значимость. Установленные геномные и внутриклеточные механизмы действия ладастена подтверждают данные о спектрах фармакологической активности препарата, что определяет целесообразность его использования в клинике при необходимости коррекции ряда состояний. Полученные данные учтены при составлении инструкции по применению ладастена в качестве антиастенического средства.
Внедрение результатов исследования в практику. Методические подходы, использованные в данной работе, могут найти применение на этапах доклинического исследования потенциальных лекарственных препаратов с целью уточнения спектра действия и анализа механизмов их активностей. Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций студентам на кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета.
Основные положения, выносимые на защиту. Предметом защиты данной работы являются следующие основные результаты исследований:
- одним из механизмов, обеспечивающим особенности психоактивирующего
действия ладастена является усиление экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы
и биосинтеза дофамина в отдельных структурах мозга крыс;
в регуляцию транскрипционной активности данного гена вовлекаются эпигенетические механизмы, что проявляется в увеличении частоты деметилирования цитозинов в сайтах связывания отдельных транскрипционных факторов в промоторной области гена тирозингидроксилазы;
- ладастен ингибирует активность гистондеацетилазы 1 и влияет на содержание
ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4.
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (10002-251/П-10/142-448/260503-196), Государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ - 2217.2003.4), РФФИ - Агидель (02-04-97904), Программы целевых расходов Президиума РАН "Поддержка молодых ученых" (10324-812).
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на V-м Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); 4-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006); Научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону , 2006), III Съезде Фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007). Работа апробирована на заседании Ученого совета Института биохимии и генетики (протокол № 14 от 2 октября 2007 г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 3 таблицы и 20 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (главы 3 и 4), заключения, выводов и списка литературы, включающего 227 источников.
