Введение к работе
Актуальность проблемы. Циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза; 1,4-а-глюканотрансфераза, циклизующая, КФ 2.4.1.19) - это фермент, катализирующий реакцию превращения линейных цепей крахмала в особые соединения, так называемые циклические декстрины, представляющие собой замкнутые в кольца остатки глюкозы. Известны три типа циклодекстринов: а-, Р- и у-, состоящие из 6-ти, 7-ми и 8-ми остатков глюкозы, соответственно (Villiers, 1881). Практическая ценность их заключается в способности образовывать комплексы включения с широким рядом органических молекул, что существенно улучшает физико-химические и другие характеристики последних (Saenger, 1980). В связи с этим циклодекстрины широко применяются в фармацевтической, пищевой, парфюмерной, химической промышленности, в сельском хозяйстве, биотехнологии и в других отраслях (Кестнер, Пальм, 1988). ЦГТазы обнаружены в почвенных микроорганизмах, преимущественно рода Bacillus (Wilson et al., 1943), причем у разных штаммов они несколько отличаются специфичностью своего действия, превращая крахмал в смесь всех трех циклодекстринов в различных пропорциях.
Химический синтез циклодекстринов сложен, поэтому их получают исключительно конверсией крахмала под действием Ці Таз, однако стоимость получаемых циклодекстринов пока еще достаточно высока. По этой причине ведется активный поиск штаммов-продуцентов ЦГТаз, а также клонирование и секвенирование их генов с тем, чтобы в будущем с помощью генной и белковой инженерии получить во-первых, штаммы-суперпродуценты ЦГТаз, во-вторых, сконструировать высокоспецифичные по отношению к конечному продукту ферменты.
ЦГТазы выделены из большого числа различных микроорганизмов, однако, клонировано всего 19 генов ЦГТаз. Для них определены последовательности нуклеотидов и на их основе предсказаны аминокислотные последовательности ЦГТаз (Takano et al., 1986; Binder et al., 1986; Kato, Kimura et al., 1987; Schmid et al., 1987; Kaneko et al., 1988; Hill ct al., 1990; Nitschke et al., 1990; Sin et al., 1991; Fujiwara et al., 1992; Starnes et al., 1992; Kim, 1998). С помощью рентгеноструктурного анализа для некоторых ЦГТаз построены
модели их третичной -структуры. Показано, что эти ферменты имеют характерную доменную организацию (Hofmann et al., 1989). Предпринимаются также попытки создать химерные конструкции ЦГТаз для выявления доменов и отдельных аминокислот, ответственных за специфичность действия фермента (Kaneko et al., 1989; Lawson et al., 1994).
Однако, в настоящее время имеющиеся сведения еще не позволяют приступить к целенаправленному созданию ЦГТаз с желаемыми свойствами. В связи с этим необходимо дальнейшее изучение этих уникальных ферментов. Таким образом, клонирование и секвенирование генов ЦГТаз, а также подробный сравнительный анализ кодируемых ими белков является актуальной научной проблемой.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении структурных различий бациллярных ферментов а- и р-ЦГТаз для выявления особенностей их организации и влияния последней на специфичность действия изучаемых ферментов.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Создание геномных библиотек штаммов микроорганизмов Paenibacillus macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. в векторах на основе фага лямбда и идентификация в них функционально-активных генов а- и р-ЦГТаз.
-
Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК и выведение на их основе аминокислотных последовательностей а- и Р-ЦГТаз.
-
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов ЦГТаз и аминокислотных последовательностей кодируемых ими ферментов, обладающих различной специфичностью действия, с привлечением данных по некоторым другим ЦГТазам для выявления консервативных и дивергировавших участков в молекулах ЦГТаз.
-
Выявление особенностей эволюционирования структуры ЦГГаз и их генов у микроорганизмов, продуцирующих данные ферменты.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые клонированы фрагменты ДНК, содержащие гены а- и р-ЦГТаз, продуцирующих следующее соотношение а-, р- и у-циклодекстринов (в %): для а-ЦГТазы 65:25:10, для Р-ЦГТазы 6:83:11, что отличает их от ранее клонированных генов ЦГТаз.
Впервые выявлены различия в структуре а-и Р-ЦГТаз, выражающиеся в. заменах и инсерциях отдельных аминокислот в высококонсервативных функционально-значимых участках молекулы ферментов.
На основе гомологии аминокислотных последовательностей всех известных ЦГТаз построено филогенетическое древо, демонстрирующее существование достаточно обособленных групп микроорганизмов-продуцентов ЦГТаз. Показано, что все сравниваемые а-, р- и у-ЦГТазы из микроорганизмов родов Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus и Thermoanaerobacter имеют одного общего предка и являются результатом дивергенции, тогда как происхождение ЦГТазы Klebsiella pneumoniae имеет независимый и в то же время конвергентный характер.
Полученные нами результаты расширяют представление об организации и эволюции структуры генов ЦГТаз, а также способствуют более полному пониманию различий в функционировании данных ферментов. Они могут быть использованы в исследованиях по конструированию ферментов ЦГТаз с заданными свойствами.
Положения, выносимые на защиту
-
ЦГТазы с одинаковой специфичностью действия, относящиеся к одной группе, имеют высокий уровень гомологии аминокислотных последовательностей; ферменты с а-, Р- и у-специфичностями имеют между собой гомологию аминокислотных последовательностей на уровне 50-65%.
-
Лидерный пептид ЦГТаз может служить критерием внутривидового родства микроорганизмов-продуцентов ЦГТаз.
-
Наиболее существенные различия между а- и р-специфичными ЦГТазами наблюдаются в А-домене.
-
Большинство известных ЦГТаз имеют общего предка и являются результатом дивергенции.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции биохимического общества РАН, посвященной памяти академика А.Е. Браунштейна (С.-Петербург, 1992); на конференции молодых ученых УНЦ РАН (Уфа, 1994) и Международной конференции
«Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические
проблемы» (Пермь, 1996).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в трех печатных : работах, а также депонированы в международных банках данных The EMBL : Nucleotide Sequence DataBase, GenBank и SWISS PROT.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора